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• Andreé Pozo

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N6 medios de cultivo INTRODUCCION La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del micólogo Brefeld, que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos realizados a base de gelatina. Sin embargo, este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamaño) y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó un método enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido. Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne líquido, diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las colonias microbianas. En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiología en relación con los medios de cultivo: el médico alemán Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacárido extraído de algas rojas) como solidificante. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces. Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre lasbacterias quimioautótrofas (utilización de nitrógeno y azufre, sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Diseñaron este tipo de medios de tal forma que su especial composición química favorecía el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en función de sus procesos metabólicos, eran los únicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio. En 1892 Würtz impulsó el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la composición de ciertos medios con lo cual se podía observar la producción de ácidos en la fermentación en ciertos microorganismos. OBJETIVOS Familiarizar al participante con los términos de medios de cultivo. Conocer cómo preparar y diferenciar los medios de cultivo. Conocer las técnicas de esterilización de los medios de cultivo. MARCO TEÓRICO Un medio de cultivo es una mezcla de diversos nutrientes que en concentracionesadecuadas permite el crecimiento de microorganismos, bajo determinadas condicionesfísico-químicas. La composición química de los medios de cultivo es variada pero, demanera general, todos ellos contienen una fuente de energía (compuesto orgánico oinorgánico), una fuente carbonada (algunas veces un mismo compuesto puede servir defuente de energía y fuente carbonada), sales minerales, vitaminas y agua. Tipos de medios de cultivo Medio sintético: es un medio que contienen una composición química definida cualitativamente y cuantitativamente.

Medio mínimo: es un medio de cultivo que contiene una cantidad mínima de nutrientes capaz de permitir el desarrollo de microorganismos no tan altamente exigentes, desde el punto de vista nutricional Medio complejo (completo): es un medio de cultivo que contiene nutrientes de composición química el cual permite el crecimiento de diversos microorganismos (Agar soya tripticasa, etc.) Medio enriquecido: es un medio que contiene, además, de los nutrientes básicos de un medio de cultivo sustancias altamente nutritivas, como son, suero, sangre, etc.(Agar sangre, etc.) Medio selectivo: es un medio que sólo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibe el crecimiento de otros tipos de microorganismos (Agar eosina azul de metileno o EMB), etc.) Medio diferencial: es un medio que permite revelar características fisiológicas de los microorganismos (Agar Mac Conkey, etc.) La mayoría de las bacterias se desarrolla en un medio de cultivo básico que contiene agua, extracto de carne y peptona (producto soluble que resulta de la autólisis o de una hidrólisis enzimática de proteínas de origen animal o vegetal). Este medio se denomina medio nutritivo, y puede ser líquido (caldo nutritivo ) o sólido (agar nutritivo).

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de Microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígenos adecuados, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licua completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él. La Gelatina es otro agente solidificante, pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. También se añaden colorantes que

actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-positivas). Condiciones generales para el cultivo de microorganismos El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio. 1- disponibilidad de nutrientes adecuados Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaba la pérdida delos factores nutritivos lábiles. Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica. Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien comoindicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos. 2- consistencia adecuada del medio Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio. 3- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a

cualquiera de las citadas condiciones. Los gases principales que afectan al desarrollo microbiano son el oxígeno y el dióxido de carbono. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al oxígeno libre clasificándose en cuatro grupos: i.-Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de oxígeno libre. ii.-Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxígeno libre. iii.-Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como en ausencia de oxígeno libre. iv.-Microaerófilas: bacterias que crecen en presencia de pequeñas cantidades de oxígeno libre. Para desarrollar bacterias aerobias se incuban los medios de cultivo en agitación constante o introduciendo aire estéril en el medio. Los anaerobios estrictos son muy sensibles al O2 por lo que se debe evitar la exposición de estos microorganismos al O2. Se puede obtener un ambiente de anaerobiosis por los siguientes métodos: A.- Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el tioglicolatosódico, para disminuir el contenido de O2.B.- Quitando el O2 por procedimientos mecánicos y reemplazándolo por N2 o CO2.C.- Mediante reacciones químicas dentro del recipiente que contiene el medio de cultivo inoculado para combinar el oxígeno libre con otro compuesto. Por ejemplo: al encender una vela se transforma el oxígeno en dióxido de carbono. 4- condiciones adecuadas de humedad Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio. 5- Luz ambiental La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos. 6- pH La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales. 7- Temperatura Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios. 8- Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es la autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante) Clasificación de los medios de cultivo SIMPLES: están formados solamente por compuestos químicos simples de fórmula química bien conocida. COMPLEJOS: están formados por líquidos animales, jugos vegetales, extractos de carne, etc. También podemos clasificarlos en: electivos, selectivos, diferenciales y enriquecidos. Medios electivos En algunos casos, especialmente en el aislamiento de organismos del suelo, un medio que satisfaga los requerimientos nutricionales mínimos de los organismos que interesan, pueden ser más útiles. Por ejemplo, se pueden obtener cultivos de enriquecimiento conteniendo un gran número de bacterias del género Azotobacter, usando un medio libre de nitrógeno y que contenga una fuente orgánica de carbono e incubando aeróbicamente. Medios selectivos Otro importante método de separación de cultivos mixtos, es por medio del uso de un medio selectivo. Este es un medio que ha sido modificado para incluir uno o más agentes inhibitorios. La elección de un medio selectivo debe ser apropiada para el aislamiento del organismo que interesa. Las sustancias inhibitorias pueden ser colorantes, antibióticos, sales biliares y sustancias que afecten el metabolismo enzimático de algunas especies. Los medios selectivos para especies Gram-, pueden incluir cristal violeta el cual inhibe el crecimiento de muchas bacterias Gram+. La penicilina con una concentración de 5,50 unidades/ml inhibe la mayoría de las bacterias Gram+ y por lo tanto el medio se hace selectivo para bacterias GramLos medios selectivos para bacterias Gram+, incluyen Telurito de Potasio, azidasódica, etc. que inhiben el crecimiento de bacterias Gram-. Medios diferenciales Es aquel que tiene adicionado un reactivo que luego de la inoculación e incubación nos permite observar diferencias entre los distintos tipos de microorganismos que se han desarrollado.Ej.: que tenga agregado un indicador de pH que haga variar el color del medio cuando se encuentre frente a un microorganismo. Medios enriquecidos Cuando se agrega una sustancia para enriquecerlo, aportando algún factor decrecimiento necesario para el microorganismo que el medio no lo posea .Ej.: agar sangre. Procedimiento de enriquecimiento Cuando se necesita obtener un cultivo

de un organismo determinado es necesaria una técnica de enriquecimiento adecuada para esa especie. Los métodos se basan en cualquier característica fisiológica del organismo deseado, por ejemplo, pH o temperatura óptima, requerimientos nutricionales o tolerancia a algunos inhibidores. En algunos casos se puede hacer un tratamiento térmico de suspensiones de suelo para el aislamiento de organismos esporulados y otros organismos termo-resistentes, seguidos por un plaqueo en medio sólido. Otras veces se puede usar diferentes temperaturas de incubación, de manera que el organismo deseado aumente su número en relación con el de los otros organismos presentes. El procedimiento de enriquecimiento en medio líquido es inadecuado para dar un cultivo puro, y el procedimiento final de aislamiento, comprende la obtención de colonias separadas en medio sólido. COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Peptonas Las características de una peptona dependen de la pureza y calidad del material proteico empleado y del método de hidrólisis. La hidrólisis ácida y alcalina tienden a destruir el contenido de vitaminas de la proteína, y parte del contenido de aminoácidos también pueden perderse. La hidrólisis enzimática tiende a preservar las vitaminas y a mantener intacto el contenido de aminoácidos. Por Ej., la caseína pura no contiene hidratos de carbono y tiene gran contenido de triptofano y vitaminas. Una peptona de caseína preparada por hidrólisis ácida no tiene triptofano ni carbohidratos y puede usarse como ingrediente en medios para analizar el contenido vitamínico de sueros o de preparaciones farmacéuticas. Casi todos los extractos de levadura microbiológicos son en realidad peptona de levadura, debiéndose la digestión de las células de levaduras a sus propias enzimas autolíticas. Infusiones y extractos Las infusiones y los extractos de carne y otros tejidos se usaron antes de conocérselas peptonas, hoy se los sigue usando en menor medida. Examen de peptonas, infusiones y extractos por su contenido microbiano La excesiva contaminación microbiana de peptona, infusiones y extractos u otros ingredientes los hace poco seguros para propósitos científicos, aunque generalmente favorecen el crecimiento de otros microorganismos. Si se preparan estos materiales en un laboratorio siempre deben hacerse las pruebas de contaminación antes de usarlos. Esto se hace de la siguiente manera: Disolver 1gr. del material a examinar en 10,0 ml de agua purificada. Extender 0,01 ml sobre un área de 1 cm2 de una lámina portaobjetos de vidrio, secada al aire, y colorear por el método de Gram. Examinar 10 campos con una lente de inmersión en aceite. No debe haber más de 50microorganismos o grupos visibles en 10 campos. Los medios pueden ser: líquidos o agarizados. Agentes solidificantes El agar es un polímero de la galactosa que es esterificado con ácido sulfúrico y se extrae de ciertas algas marinas rojas, las Rhodophyceae , debe estar limpio y libre de desechos. Se

agrega a la solución acuosa del 1,5 al 2%.El medio agarizado comienza a fundir a los 100°C, si bien se mantiene líquido hastalos 45°C, en donde se comienza a solidificar. Ventajas Prácticamente no es atacado o asimilado por los microorganismos, hay pocosorganismos que lo digieren. Desventajas No es útil en medios ácidos La gelatina es poco usada ya que a temperaturas altas se disuelve y por otra parte numerosos microorganismos lo digieren, se usa principalmente en microbiología de suelos. La agarosa es un polisacárido neutro que junto con la agaro pectina es un producto de disociación del agar. Se usa en pruebas de difusión inmunoelectroforética, donde la claridad es especialmente importante. Otros componentes Indicadores colorimétricos Los indicadores pueden incluirse entre los medios . Los indicadores de pH más usados son rojo fenol, azul bromotimol, púrpura de bromocresol y rojo neutro. Estos indicadores se usan para demostrar la producción de ácido por un hidrato de carbono contenido en el medio. El azul de metileno y la resazurina son los indicadores de Eh (carga iónica) más usados actualmente. Algunos lotes de pH y Eh pueden ser tóxicos para algunos microorganismos y deben probarse antes de usarlos. Agentes selectivos Agentes selectivos que permiten el crecimiento de algunos microorganismos e inhibenel de otros pueden incorporarse a los medios. Son muy útiles para los trabajos de identificación. Se han ensayados muchos agentes selectivos y algunos son muy valiosos y usados. Los colorantes fueron probablemente los primeros agentes selectivos que se emplearon. Son ejemplos el cristal violeta y el verde brillante, que se usan para inhibir microorganismos Gram- . El cloruro de sodio en altas concentraciones inhibe el crecimiento de casi todas las bacterias, pero es bien tolerado por los estafilococos. La azida de sodio, el citrato y el telurito de sodio, el laurisulfato y elselenito de sodio, el iodo y el feniletanol se usan para dar selectividad. Un medio puede hacerse selectivo ajustando la reacción a un pH muy alto o muy bajo para permitir el crecimiento de algunos microorganismos e inhibir el de otros. Un ejemplo bien conocido es el uso de un pH 5,6 en medio de Sabouraud para el crecimiento de levaduras y mohos. Agentes reductores Agentes reductores puede agregarse para promover la anaerobiosis. Uno o más compuestos como los siguientes pueden usarse: ácido ascórbico, tiogilcolato de sodio,formaldehído sulfoxilato de sodio, ácido tiomálico, hidrosulfito de sodio y cisteína. Muchos medios que no contienen agentes reductores y se usan normalmente para cultivar aerobios pueden emplearse para cultivar microorganismos de requerimientos especiales incubándolos en propano, hidrógeno, metano u otros gases. Preparación

La preparación de medios terminados a partir de materiales deshidratados debe hacerse de acuerdo a las instrucciones. Sólo debe usarse equipos y cristalería química limpios. El agua debe ser siempre destilada o desmineralizada, salvo indicación en contra. La pesada exacta de los materiales y la medida correcta de agua son esenciales. El calor debe ser directo o en baño de agua hirviendo o recipientes envueltos en vapor con agitación. El calentamiento excesivo debe evitarse. La homogeneidad también es esencial, especialmente para medios que contienen agentes gelificantes. El mezclado debe ser suave para lograr homogeneidad sin espuma ni burbujas. La esterilidad se hace de varias formas, generalmente por autoclave o filtración. Casi todos los medios se esterilizan a 121°C durante 15 minutos para volúmenes de hasta500 ml. Para volúmenes mayores el tiempo debe extenderse a 20, 30 ó más minutos según sea necesario. Para verificar la esterilización placas y tubos con el medio se deben incubar a 20-25°Có 30-35°C durante varios días o semanas. Los medios deben guardarse en un refrigerador. CUESTIONARIO 1. QUE ES UN AGAR DE DONDE SE EXTRAE es un polímero de subunidades de galactosa; en realidad es una mezcla heterogénea de dos clases de polisacáridos: agaropectina y agarosa.1 Aunque ambas clases de polisacáridos comparten el mismo esqueleto de galactosa, la agaropectina está modificada con grupos ácidos, tales como sulfato y piruvato. Los polisacáridos de agar sirven como la estructura primaria de la pared celular de las algas. Disuelto en agua caliente y enfriado se vuelve gelatinoso. Su uso principal es como medio de cultivo en microbiología; también se usa como laxante, espesante para sopas, gelatinas vegetales, helados y algunos postres y como agente aclarador de la cerveza. 2. QUE ES GELATINA DE DONDE SE EXTRAE La gelatina es una mezcla de proteínas fabricadas de colágeno en el tejido conectivo animal. Cuando se mezcla con agua y se calienta, forma un gel viscoso que sirve como un buen medio de crecimiento para las bacterias. Aislar un tipo particular de bacterias de esta forma es difícil, sin embargo, en parte porque las bacterias están en todos lados y diferentes especies pueden contaminar fácilmente el cultivo. 3. ¿Porque se usa agua destilada en la preparación de medios de cultivo? La ventaja es que el agua destilada es 100% pura, y es apta para el crecimiento de las bacterias en ella, a una temperatura adecuada, el agua destilada es la indicada para los medios de cultivo por estas razones. para limpiar materiales de laboratorio, es la mejor, ya que esta purificada y libre de partículas contaminantes.

BIBLIOGRAFÍA https://es.scribd.com/doc/17102236/4%C2%BA-LABORATORIO-DE-MICROBIOLOGIA-I http://microbiologia3bequipo5.blogspot.pe/2014/09/tipos-y-funciones-de-los-mediosde.html http://www.bdigital.unal.edu.co/4999/1/albertorojastrivino.2011.pdf