• Author / Uploaded
• lovethalx

Citation preview

Cultivo y conservación de los microorganismos • Historia • Composición de los microorganismos y componentes celulares • Composición química de una célula procariota • Requerimientos nutricionales • Clasificación de los microorganismos por sus requerimientos nutricionales • Concepto y clasificación de los medios de cultivo

HISTORIA • Brefeld (micólogo), aisló y cultivó esporas de hongos en medios sólidos realizados a base de gelatina. • El año 1878, Lister popularizó un método enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido. • Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne líquido, diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las colonias microbianas. • Walter Hesse ( médico alemán) introduce el agar-agar (polisacárido extraído de algas rojas) como solidificante.

HISTORIA • En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri. • Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias quimioautótrofas (utilización de nitrógeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. • En 1892 Würtz impulsó el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la composición de ciertos medios con lo cual se podía observar la producción de ácidos en la fermentación en ciertos microorganismos.

Composición de los microorganismos • La célula: – Obtiene la mayoría de las pequeñas moléculas del ambiente – Las macromoléculas son sintetizadas en el interior de la célula – Dentro de la célula se sintetizan moléculas pequeñas de las sustancias obtenidas del ambiente. • La masa total está formada de 4 tipos de átomos: carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrógeno. • En menor cantidad : fósforo, calcio, magnesio, azufre, fierro, zinc, manganeso, cobre, molibdeno, cobalto y tungsteno.

Principales componentes celulares • El agua constituye aproximadamente el 94-98% del peso de una célula • Peso seco principalmente de macromoléculas: – – – –

proteínas ácidos nucleicos (DNA y RNA) lípidos carbohidratos.

Requerimientos de los microorganismos • • • •

Requerimientos de Nitrógeno: N2, NH4+, NO3-, NO2-, aminoácidos. Requerimiento de Azufre: aminoácidos, So, SO4-2 Requerimientos de Fósforo: PO4-2 Requerimientos de macro y micronutrientes: • Macronutrientes (10-3 a 10-4 M); Ca, Na, K, Mg • Micronutrinetes (10-5 a 10-6 M) ; Cu, Zn, Mn, Mo, Cr, Fe, etc.

• Requerimiento de factores de crecimiento

Auxotrofía Prototrofía

Composición química de una célula procariota Molécula Total de macromoléculas Proteínas Polisacáridos Lípidos DNA RNA Total de monómeros Aminoácidos y precursores Azúcares y precursores Nucleótidos y precursores Iones inorgánicos Total •

Peso seco (%)b

Moléculas por célula

Clases diferentes

96 55 5 9.1 3.1 20.5 3.5 0.5 2 0.5 1

24,610,000 2,350,000 4,300 22,000,000 2.1 255,500

~2,500 1,850 2c 4d 1 ~650 ~350 ~100 ~50 ~200 18

100

Los datos son de Neidhardt, F.C. y col (eds).1996. Escherichia coli y Salmonella typhimurium-Cellular and Molecular Biology, 2a, ed, ASM; b Peso seco de una célula de E. coli creciendo activamente (2.8 x 10-13 g); c Asumiendo que la peptidoglicana y el glucógeno son los polisacáridos mayoritarios presentes; d Existen diversas clases de fosfolípidos; de cada uno de ellos se presentan muchas formas debido a la variabilidad de los ácidos grasos entre las especies y las condiciones de crecimiento.

a

Requerimientos nutricionales • Las sustancias en el ambiente utilizadas por los organismos para el anabolismo y el catabolismo se denominan nutrientes. • Nutriente. Sustancia requerida por los organismos para la síntesis de materiales celulares y para la generación de energía y que es obtenida del ambiente • Los nutrientes se pueden dividir en dos clases: – Macronutrientes, los que se requieren en grandes cantidades. – Micronutrientes, aquellos que se necesitan en pequeñas cantidades.

• Funciones de algunos nutrientes – para síntesis de macromoléculas o estructuras – como generadores de energía sin ser directamente incorporados al material celular – algunos nutrientes pueden jugar los dos papeles.

Macronutrientes en la naturaleza y en los medios de cultivo Elemento Forma habitual del nutriente en el ambiente

Forma química utilizada en medios de cultivo

Carbono

CO2, Compuestos orgánicos

Glucosa, malato, acetato, piruvato, extracto de levadura, peptona, etc.

Oxígeno Nitrógeno

H2O, Compuestos orgánicos NH3, NO3-, N2, Compuestos orgánicos nitrogenados Compuestos orgánicos PO43H2S, SO42-, Compuestos orgánicos azufrados, sulfuros metálicos (FeS, CuS, ZnS, NiS, etc.) K+ en solución o como sal Mg2+ en solución o como sal Na+ en solución o como sal Ca+ en solución o como sal Fe2+ o Fe3+ en solución o como FeS, Fe(OH)3, u otras sales

H2O, Compuestos orgánicos Inorgánicos: NH4CL, (NH4) SO4, KNO3, N2 Orgánicos: aminoácidos, bases nitrogenadas de nucleótidos, compuestos con nitrógeno KH2PO4, Na2HPO4 Na2SO4, Na2S2O7 Na2S, Compuestos orgánicos azufrados

Fósforo Azufre

Potasio Magnesio Sodio Calcio Hierro

KCl, KH2PO4 MgCl2, MgSO4 NaCl CaCl2 FeCl2, FeSO4, soluciones de Fe quelado con EDTA o citrato

Micronutrientes necesarios para los microorganismos Elemento Cromo

Función Celular

Requerido por los mamíferos en el metabolismo de la glucosa, no se conoce algún microorganismo que lo requiera Vitamina B12, Transcarboxilasa (bacterias del ácido láctico) Cobalto Lo requieren como cofactor algunas proteínas implicadas en la respiración Cobre (citocromo c oxidasa), la fotosíntesis (plastocianina) y las destoxificación de radicales libres (superóxido dismutasa) Manganeso Varias enzimas lo requieren como cofactor. Por ejemplo, la superóxido dismutasa, la fotoliasa del fotosistema II. Molibdeno Presente en enzimas que contienen flavina. También presente en la nitrogenasa, nitrato reductasa, sulfito oxigenasa, DMSO y TMAO reductasas, formato deshidrogenasas, etc. Níquel La mayoría de las hidrogenasas, coenzima F430 de las metanógenas, deshidrogenasa de monóxido de carbono, ureasa, etc. Selenio Formato deshidrogenasa, selenocisteína Tungsteno Formato deshidrogenasas, oxotransferasas de termofílicos Vanadio nitrogenasa, bromoperoxidasa Vanadio Anhidrasa carbónica, alcohol deshidrogenasa, DNA y RNA polimerasas y Zinc proteínas que se unen al DNA Citocromos, catalasas, peroxidasas, proteínas con hierro y azufre (ferredoxina), Hierro oxigenasas, nitrogenasas

Constituyentes de los microorganismos • Las cuatro principales macromoléculas que constituyen a los microorganismos: –Proteínas –Ácidos nucleicos –Lípidos –Carbohidratos

Requerimientos de los microorganismos •De acuerdo con los requerimientos de energía y carbono, los microorganismos se clasifican en: Fotoautótrofos (luz + CO2) Fotoheterótrofos (luz + compuestos químicos) Quimioautótrofos (compuestos químicos + CO2) Quimiohetrerótrofos (compuestos químicos)

Definición de medio de cultivo • Sustrato o solución de nutrientes en donde se cultivan microorganismos en un laboratorio. Es la imitación de las condiciones favorables para el desarrollo de los microorganismos.

Requerimientos de un medio de cultivo • • • • • •

Fuente de carbono Fuente de nitrógeno Fuente de energía Agua Sales minerales Factores de crecimiento

Etapas para la preparación de medios de cultivo Sólidos

Líquidos Pesar

Pesar Mezclar

Solubilizar

Calentar para solubilizar

Envase Esterilización Prueba de esterilidad Pruebas de funcionalidad

Adición de substancias termolábiles estériles

Envase Esterilización Solidificación Pruebas de esterilidad

Tipos de medios de cultivo por su composición química En microbiología se usan dos grandes grupos de medios de cultivo: • Químicamente definidos – se preparan añadiendo agua destilada a cantidades precisas de compuestos orgánicos o inorgánicos altamente purificados. Por ello se conoce la composición química exacta. • Indefinidos o complejos – Emplean lisados de caseína, de carne, de soya, de levadura o cualquier otra sustancia altamente nutritiva (químicamente indefinida) como por ejemplo la sangre, el suero, jugos de verduras, frutas etc. Entonces los medios complejos no se conoce con precisión la composición química ni la cantidad exacta de cada uno de los nutrientes.

Ejemplos de medios de cultivo por su composición química • Medios complejos o indefinidos

• Medios definidos • Medio E de Vogel y Bonner. • Medio de Knop • Medio de Fowell para ascosporas

• • • • • •

BHI Gelosa sangre Caldo nutritivo Medio PDA Medio Luria Bertani Medio Baird Parker

Tipos de medios de cultivo por su consistencia • Líquidos • Sólidos o semisólidos – poseen además agentes solidificantes que pueden ser agar, gelatina ó sílica gel. El agar proviene de las algas rojas Gelidium, Gracilaria, Acanthopeltis, Ceramium y Pterocladia y químicamente es un polímero de azúcares que posee interesantes propiedades que lo hacen ideal para el cultivo de una gran variedad de microorganismos. Se funde a altas temperaturas (87oC) y solidifica a 40-45oC. Además no es degradado por la mayoría de las bacterias. Se usa a una concentración del 1.5-2% – La gelatina tiene el inconveniente de que se licúa a temperaturas relativamente bajas y muchos microorganismos la utilizan como fuente de carbono y nitrógeno. Se utiliza a una concentración del 510%. – La sílica gel se emplea para algunos microorganismos que se inhiben en presencia de agar.

Tipos de medios de cultivo por su uso Los medios de cultivo dependiendo de su uso pueden ser: • Simples • Enriquecidos • Selectivos • Diferenciales • De enriquecimiento • De transporte

Medios Simples • Los medios simples son medios comunes, que sólo tienen un tipo de infusión o extracto además de otros componentes. Son medios para fines generales porque mantienen el crecimiento de muchos microorganismos que no son muy exigentes. • Ejemplos: la gelosa nutritiva, el PDA, el caldo simple o caldo nutritivo.

Medios Enriquecidos • Constituidos por algunas sustancias que los hacen más nutritivos. En estos medios puede crecer una gran variedad de microorganismos. – – – –

Sangre Suero plasma extractos nutritivos (levadura, carne)

• Ejemplos: el BHI, gelosa sangre, medio Eugon, gelosa chocolate, agar Columbia, medio Infusión de hígado, etc.

Ejemplos de medios enriquecidos

• Gelosa sangre

Medios Selectivos Favorecen el crecimiento de microorganismos particulares debido a que poseen un inhibidor o sustancia específica, que nos permite escogerlos o seleccionarlos. • Agentes Inhibidores: Las sales biliares o los colorantes como la fucsina básica, el cristal violeta, la eosina o el verde brillante permiten el crecimiento de las bacterias Gram negativas, mientras que inhiben el crecimiento de las Gram positivas. • Incubándolos con nutrientes que puedan utilizar de forma específica. Un medio que contenga celulosa será efectivo para aislar bacterias que digieran celulosa o bien la adición de sustancias tales como el NaCl o la sacarosa a concentraciones relativamente altas logrará el propósito de aislar microorganismos definidos. • Ejemplos de medios selectivos son el agar EMB (Eosina Azul de Metileno), agar ENDO, agar MacConkey, S-110, SS, gelosa Rosa de Bengala, agar Biggy, agar Verde Brillante, etc.

Medios diferenciales • Distinguen, separan, diferencian grupos distintos de bacterias e incluso permiten una identificación tentativa de los microorganismos según sus características metabólicas. • Ejemplos de medios diferenciales son el Gelosa sangre, SS (Salmonella-Shigella), agar MacConkey, agar BairdParker, agar XLD, agar Vogel Johnson, Citrato de Simmons, LIA, Kligler, Verde Brillante, etc. Nótese que algunos de estos medios son además selectivos.

MacConkey: medio selectivo y diferencial • Sustancias que lo hacen selectivo (rojo neutro y cristal violeta) que permitirán el crecimiento de bacterias Gram y diferencial (lactosa) que definirá entre aquellos microorganismos que fermentan la lactosa (colonias rojas) de los que no pueden utilizar este azúcar (colonias incoloras, amarillas o blancas).

Agar Sal manitol (ASM), medio selectivo y diferencial

• Desarrollan microorganismos capaces de crecer en concentraciones de NaCl del 7.5%, además diferencia a aquellos que fermentan el manitol provocando el vire del indicador de pH (rojo de fenol) de rojo a amarillo.

Medio de gelosa sangre: enriquecido y diferencial

Gelosa sangre, medio de cultivo enriquecido y diferencial • El medio de gelosa sangre medio enriqucido que estimula el crecimiento de microorganismos denominados “fastidiosos”, además permite diferenciar la capacidad de las bacterias de utilizar los eritrocitos • la parcial llamada alfa (α), • hemólisis total o beta (β) • no utilizan a los eritrocitos y que no provocan ningun cambio en el medio y se conoce como hemólisis gamma (γ).

SS ejemplo de un medio selectivo y diferencial • En esta imagen se observa el desarrollo de tres tipos de colonias crecidas en medio SS (Shigella-Salmonella). Las colonias rojas pertenecen a bacterias capaces de fermentar la lactosa (Lac+), las incoloras son bacterias que no fermentan este azúcar (Lac-) y las negras son las que producen ácido sulfhídrico (H2S).

Medios de enriquecimiento • Enriquecer significa, en este caso, proporcionar al microorganismo que se desea aislar todos los elementos nutritivos necesarios para que alcance su óptimo crecimiento. • Se usan para aumentar el número relativo de organismos de un tipo en relación al total. Por ejemplo, enriquecer un patógeno minoritario particular presente en una muestra altamente contaminada con otros microorganismos irrelevantes desde el punto de vista médico. • Ejemplos de estos medios son: caldo tetrationato de Müeller, caldo selenito de sodio, caldo selenito, caldo urea, caldo tioglicolato, agua peptonada, Monsur, etc.

Técnicas de enriquecimiento • Consiste en ajustar las condiciones de cultivo para seleccionar el microorganismo que nos interesa aislar. • Ejemplo 1: Nos interesa aislar bacterias fotoautótrofas. Tomamos un matraz con agua y sales y lo incubamos a la luz, de manera que crezcan las bacterias fotoautótrofas. • Ejemplo 2: Queremos aislar bacterias quimiolitótrofas del azufre; ponemos azufre, CO2 como fuente de carbono (disuelto en agua) e incubamos en la oscuridad para eliminar fotoautótrofos. • Para incubar enterobacterias como Enterobacter hay que incubar a 37º, mientras que para incubar otra enterobacteria, E. coli, hay que incubar a 45º

Medios de transporte • Se utilizan para el transporte de diversas muestras biológicas evitando la muerte de los microorganismos de interés. • Su composición permite la viabilidad de los microorganismos pero no permite su multiplicación • Ejemplos de estos medios son los medios de Stuart, de agua peptonada para Vibrio, Cary y Blair, Glicerol-Solución Salina, Amies y Douglas, Hajna, Caldo de Fildes etc.

Aislamiento y Selección • Uso de procedimientos que permiten la selección y aislamiento de solo aquellos microorganismos de interés, entre una gran población microbiana. • Selección Primaria (Primoaislamiento). • Selección Secundaria (Resiembra).

TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS FUENTE NATURAL

CULTIVO

SUELO AGUA AIRE SUPERFICIES ALIMENTOS BIOTA NORMAL HUMANA PRODUCTOS BIOLÓGICOS

TUBO PLACA MATRÁZ GARRAFÓN FERMENTADOR CULTIVO CELULAR

TÉCNICAS COMUNES DE AISLAMIENTO ESTRÍA CRUZADA (CUALITATIVA)

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

CULTIVO PURO O AXÉNICO IDENTIFICACIÓN CONSERVACIÓN

DILUCIONES CUALITATIVA Y CUANTITATIVA

Presión de selección • • • • • • •

Factores Nutricionales. pH. Atmósfera (Oxígeno). Temperatura. Osmolaridad y Aw. Inhibidores. Potencial Redox

Aislamiento

permiten obtener cultivos axénicos a partir de cultivos mixtos

Métodos Cualitativos Estria Cruzada ECONÓMICO, RÁPIDO, POCO MATERIAL, FÁCIL.

AISLAMIENTO EN PLACA POR ESTRÍA CRUZADA Consiste en: • cargar el asa con la muestra y hacer estrías paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa; • se quema el asa, • se enfría, • se gira la placa aprox. 45° • se vuelve a estriar tocando 3 ó 4 veces el área sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de placa. • Por último sin quemar el asa, se estría el resto de la superficie sin sembrar

AISLAMIENTO EN PLACA POR ESTRÍA CRUZADA

Métodos Cuantitativos Dilución y Dispersión con varilla acodada

MÁS TARDADO, MÁS CARO, MÁS ADIESTRAMIENTO TÉCNICO, MÁS MATERIAL

Aislamiento por dilución en medio sólido • Técnica de dispersión en superficie: 1) Se colocan 0.1 mL de la dilución de la muestra con pipeta estéril en el centro de la placa y se distribuye con un varilla de vidrio acodada estéril

Aislamiento por dilución en medio sólido • Técnica de diluciones y vaciado en placa: 1) Se coloca 1 mL de la muestra en una placa estéril vacía, en el centro de la misma. Sobre ella se vierte 12-15 mL del medio de cultivo fundido a una temperatura de 45ºC, luego se incorpora el inóculo girando la placa en una superficie horizontal moviéndola 6 veces en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido antihorario, 6 veces de arriba abajo y 6 de izquierda a derecha.

TÉCNICA DE LAS DILUCIONES 2) También se puede preparar las diluciones directamente en tubos de agar fundido a temperatura de 45ºC, se agita por rotación entre las manos y se vierte en cajas de Petri estériles.

COLONIA BACTERIANA

CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS PROVENIENTES DE UNA CÉLULA , UN GRUPO DE ELLAS O UNA ESPORA EN UN MEDIO SÓLIDO. EL TÉRMINO UTILIZADO CUANDO SE DETERMINA LA CANTIDAD POR UNIDAD DE VOLUMEN ES EL DE: UNIDAD FORMADORA DE COLONIA (UFC) / mililitro o gramo

• UNA COLONIA TIENE ORGANISMOS QUE COMPARTEN CARACTERÍSTICAS GENOTIPICAS Y FENOTIPICAS YA QUE PROVIENEN DE LA MISMA CÉLULA • LAS COLONIAS AISLADAS CON DIFERENTES CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS, ES DECIR CON DIFERENTES CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS, SE PUEDEN DISTINGUIR DEBIDO A QUE CADA GRUPO FILOGENÉTICO DE MICROORGANISMOS TIENE CARACTERÍSTICAS PECULIARES QUE SE VEN INFLUENCIADAS POR LAS CONDICIONES DEL MEDIO DE CULTIVO (TÉCNICA CUALITATIVA). • LA ESTIMACIÓN DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS CULTIVABLES PRESENTES EN UNA MUESTRA (TÉCNICA CUANTITATIVA) SE PUEDE CALCULAR MEDIANTE LA SIGUIENTE ECUACIÓN:

UFC=Unidades Formadoras de Colonias Cuenta de Colonias. Escoger la dilución que tenga entre 25 y 250 colonias. Aplicar la formula:

UFC/ml

10-6

10-7

10-9

10-8

10-10

Escherichia

CÁLCULOS V (diluyente) + V (muestra) = V (total) 9mL + 1mL = 10mL Se divide entre el volumen de la muestra

9mL

+

Dilución

1mL 1mL

= 10mL 1mL 1:10

• AISLADAS • DE 25-250 EJEMPLO: DILUCIÓN: 10-8 250)

10-8

ALÍCUOTA: 0.1mL

N°COL. : 198 (cumple el intervalo de 25-

UFC/mL = 198.5 (1/0.1mL) (1/ 10-8) UFC/mL = 198.5 X 10 X 108 UFC/mL = 198.5 X 109 UFC/mL = 19.8510 UFC/mL = 1.985X1011

Diluciones en tubo: Número Más Probable • Técnica estadística se basa: – mientras es mayor el número de bacterias en una muestra debe realizarse una dilución mayor para reducir la densidad hasta un punto en donde no quede ninguna bacteria capaz de crecer en una serie de tubos. • El método del NMP es muy útil: – cuando los microorganismos que se cuentan no son capaces de crecer en medio sólidos, como es el caso de la bacterias nitrificantes quimioautótrofas – también es útil cuando el crecimiento de las bacterias en un medio líquido y diferencial se utiliza para identificar ciertos microorganismos.

TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)

Clasificación de Bacterias

Bacterias Aerobias  Aquellas capaces de crecer con la concentración de oxígeno que existe en la atmósfera (21%).  Sistema enzimático de desintoxicación de radicales libres del metabolismo del oxígeno. Radicales libres: H O , O -, OH., O .  Enzimas contenidas en las bacterias aerobias. Catalasa, peroxidasa, Superóxido dismutasa 2

2

2

2

Relación de los microorganismos con el oxígeno • Microorganismos aerobios: El oxígeno actúa como aceptor final de electrones en la respiración aeróbica. Existen dos grupos de organismos aerobios: • Aerobios estrictos: Requieren oxígeno en concentraciones similares a la atmosférica (20%) • Aerobios microaerofílicos: Requieren oxígeno en concentraciones inferiores a las atmosféricas; 5-10%. Presentan enzimas como la hidrogenasa, que son activas a las presiones parciales de oxígeno. La hidrogenasa proporciona energía para el crecimiento. En concentraciones atmosféricas, la hidrogenasa no es activa y por ende la célula no crece y muere.

Relación de los microorganismos con el oxígeno • Microorganismos anaerobios: Son aquellos organismos que no requieren el oxígeno: – Anaerobios facultativos: Crecen en ausencia y presencia de oxígeno, pero crecen mejor con oxígeno. En ausencia realizan la fermentación y en presencia, la respiración aeróbica. – Anaerobios estrictos: Aquellos que, no sólo no requieren el oxígeno, sino que su presencia los destruye. Su metabolismo no requiere oxígeno, y realizan fermentación o respiración anaeróbica. – Anaerobios aerotolerantes: Aquellos que no requieren oxígeno pero lo toleran; no mueren en su presencia. Son microorganismos fermentativos y se diferencian de los facultativos en que no crecen más en presencia del oxígeno.

Formas tóxicas del oxígeno Bacteria aerobia

O2

Metabolismo

Productos Tóxicos O2OH. O2. H2O2

Rutas detoxificantes 1. Superóxido dismutasa 2. Catalasa 3. Peroxidasa

Productos no tóxicos H2 O O2

Bacteria anaerobia O2

Metabolismo

Productos Tóxicos O2OH. O2. H2O2

No hay rutas detoxificantes

Muerte bacteriana

Relación de los microorganismos con el oxígeno Grupo

Requerimiento de O2

Metabolismo

Ejemplo

Hábitat

Obligados

Si

Respiración aeróbica

Micrococcus luteus

Piel, polvo

Facultativos

No

Respiración aeróbica y anaeróbica, fermentación

Escherichia coli

Intestino

Si, baja tensión

Respiración aeróbica

Spirillum volutans

Lagos

No

Fermentación

Streptococcus pyogenes

Tracto respiratorio

Letal

Fermentación, repiración anaeróbica

Methanobacterium formicicum

Diverso

Aerobios:

Microaerofílicos Anaerobios: Aerotolerantes Obligados

Cultivo de microorganismos aerobios • En cajas de Petri sobre medios sólidos. La superficie del medio de cultivo está en contacto con el oxígeno atmosférico, luego no hay ningún problema para cultiva este tipo de microorganismos. • En medio líquido, el microorganismo crece en la disolución, donde la concentración de oxígeno es menor y disminuye en función del crecimiento del microorganismo. Para evitar esa disminución de oxígeno, utilizamos dos recursos: • Agitación • Adición de aire u O2 estéril mediante burbujeo.

Cultivo de microorganismos anaerobios estrictos • En medio líquido, añadimos al medio de cultivo agentes reductores que toman el O2 disuelto en el agua y forman H2O. Estos agentes son: cisteína, tiglicolato. • Caldo tioglicolato: medio reductor. Contiene un indicador de óxido-reducción (Resazurina), la cual cuando está oxidada es de color rojo e incolora cuando está reducida. – Contiene agar en pequeñas concentraciones (0.5%), dándole consistencia semisólida, previene el movimiento de los organismos inoculados y de la introducción de oxígeno. – Otra forma para cultivar en medios líquidos es bombeando un gas inerte (N2) libre de O2, mediante burbujeo.

Técnicas de cultivo de anaerobios • Caldo carne cocida (extracto de corazón de bovino) con sello de nujol. Agente reductor; aminoácidos azufrados de la carne. • Medio Leche-Fierro con sello de nujol. Agente reductor; Fierro. Sustrato e indicador; Leche. • Jarra de anaerobiosis. Sistema de sustitución de oxígeno de la jarra por CO2 e H2. • Cámara de anaerobiosis: Cámara hermética saturada con gas libre de oxígeno como el nitrógeno o el hidrógeno.

Cultivo de anaerobios en medio sólido • En medio sólido, se emplean jarras de anaerobiosis o jarras de Gas Pak. Su tamaño es similar al de un termo. En su interior se colocan las cajas de Petri invertidas. El recipiente se cierra con una tapa hermética. En la parte inferior hay un agente desecante (sílica gel) y en la tapa se encuentra el catalizador (Pd). Para conseguir la anaerobiosis, introducimos sobres generadores de anaerobiosis, que contienen Na2CO3 y NaBH4. Al añadir agua al sobre, se libera H2 y CO2.