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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERU

FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AGUA

CATEDRA:

ANALISIS QUIMICO CUANTITATIVO ORGANICO CATEDRATICO:

Dr. ANDRES CORCINO ROJAS QUINTO ALUMNOS:

 ROJAS MOYA, Estephany Mayruth (I.Q.G.N.E)  SOLIER ESTEBAN, Sabrina (I.Q.A.)

HUANCAYO-PERU 2017

RESUMEN El agua es la fuente de toda la vida en la Tierra. Su distribución es muy variable: en algunas regiones es muy abundante, mientras que en otras escasea tiene muchas propiedades que hacen que se le llama disolvente universal y es fuente de vida el Ministerio de Salud y La Protección Social, establece que el agua potable es aquella que por cumplir las características físicas, químicas y microbiológicas, en las condiciones señaladas en decreto y demás normas que la reglamenten, es apta para consumo humano, por ello la necesidad de analizar en qué condiciones está el agua que se va utilizar esto hace que el tratamiento de las aguas residuales sea complicado. Por esta razón, al querer adentrarse en el amplio mundo del conocimiento de las aguas residuales industriales o no se tiene que conocer los componentes que hay en ella por ejemplo Varios organismos patógenos de transmisión fecal-oral pueden estar presentes en el agua cruda, entre ellos bacterias como la Salmonella, coliformes fecales y totales, las cuales han sido encontradas en abastecimientos de agua potable. La verificación de la calidad microbiológica del agua de consumo incluye el análisis de la presencia de Escherichia coli, un indicador de contaminación fecal. No debe haber presencia en el agua de consumo Para el caso de estudio se trabajó con método Colilert, esta prueba se encuentra patentada por IDEXX, se utiliza para la detección de coliformes totales y Escherichia Coli en un periodo de 24 horas, Colilert Quanti-Tray es una prueba diseñada específicamente para el recuento NMP (Numero Más Probable) de E. coli y bacterias coliformes a partir de muestras de agua potable u otras aguas de características similares. Se alcanzaron los resultados siguientes: Se llegó a conocer el análisis microbiológico de agua de riego por el método colilert Se llegó a conocer y entender el funcionamiento de los equipos como también el procedimiento para hacer el análisis microbiológico del agua de riego. Se verifico y contabilizo los resultados de coliformes totales y escherichia coli del agua de riego.

INDICE RESUMEN ...................................................................................................................................... 2 I.

INTRODUCCION ................................................................................................................... 43

II.

OBJETIVOS .......................................................................................................................... 54

III.

MARCO TEORICO................................................................................................................. 65 3.1.

EL AGUA ...................................................................................................................... 65

3.1.1.

PROPIEDADES FISICOQUIMICAS ......................................................................... 86

3.1.2.

TIPOS DE AGUA ................................................................................................... 98

3.2.

MICROORGANISMOS INDICADORES DE LA CALIDAD EN EL AGUA: ....................... 1312

3.2.1.

COLIFORMES TOTALES: .................................................................................. 1412

3.2.2.

COLIFORMES FECALES: .................................................................................. 1513

3.3.

METODOS: ............................................................................................................... 1614

3.3.1.

MÉTODO DE LA MEMBRANA FILTRANTE: ....................................................... 1614

3.3.2. MÉTODO ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA CON ASPIRACIÓN DIRECTA 1715 3.3.3.

TÉCNICA DE NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)................................................ 1816

3.3.4.

METODO COLILERT: ........................................................................................ 1917

IV.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL............................................................................... 2220

4.1.

MATERIALES ........................................................................................................... 2220

4.2.

EQUIPOS .................................................................................................................. 2220

4.3.

REACTIVOS .............................................................................................................. 2220

4.4.

PROCEDIMIENTO ..................................................................................................... 2220

V.

RESULTADOS .................................................................................................................. 2422 5.1.

CONTEO DEL NUMERO DE POCILLOS POSITIVOS: ................................................. 2422

5.2.

DETERMINACION DEL NMP PARA CADA MICROORGANISMO:................................ 2523

VI.

DISCUSION DE RESULTADOS ...................................................................................... 2624

VII.

CONCLUSIONES .......................................................................................................... 2725

VIII.

BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................. 2826

IX.

ANEXOS ....................................................................................................................... 2927

Formatted: Centered Formatted: Font: Arial Narrow, Bold, Font color: Text 1

I.

INTRODUCCION

El agua es una necesidad universal y es el principal factor limitante para la existencia de la vida humana, a través de la historia el hombre ha necesitado de un suministro adecuado de agua para su alimentación, seguridad y bienestar a través de la tecnología conocida como captación “cosecha o almacenamiento “del agua se puede asegurar el abastecimiento del agua para el uso de toda la persona, la captación consiste en recolectar y almacenar agua proveniente de diversas fuentes para su uso benéfico. el agua captada de la cuenca y conducida a estanques reservorios puede aumentar su suministro Toda agua natural contiene cantidades variables de otras sustancias en concentraciones que varían de unos pocos mg/litro en el agua de lluvia a cerca de 35 mg/litro en el agua de mar. A esto hay que añadir, en las aguas residuales, las impurezas procedentes del proceso productor de desechos, que son los propiamente llamados vertidos. Las fuentes de agua que son utilizados en diversos procesos que el hombre realiza tienen microorganismos presentes de diversos grupos o familias. Una de las razones más importantes para tratar las aguas residuales o servidas es la eliminación de todos los agentes patógenos de origen humano presentes en las excretas con el propósito de evitar una contaminación biológica al cortar el ciclo epidemiológico de transmisión. Estos son: Coliformes totales, Coliformes fecales Salmonella, Escherichia Coli. Para ello, para su utilización es necesario conocer que tan contaminado esta y de ello muchos métodos de determinación de microorganismos (Escherichia Coli y coliformes) y uno de los métodos con valores altos de acierto es el método Colilert aprobada por la EPA de los Estados Unidos; análisis en 24 horas para aguas potable y sin tratar. Las aprobaciones internacionales incluyen las de la AOAC, IBWA y EBWA. Millones de análisis realizados en todo el mundo cada año. Y eso nos da confiabilidad en los resultados.

I.II.

OBJETIVOS

 Conocer el análisis microbiológico del agua por el método colifert.  Conocer y entender el funcionamiento de los equipos de análisis microbiológico del agua.  Verificar y contabilizar los resultados de coliformes totales y escherichia coli del agua de riego.

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II.III.

MARCO TEORICO

3.1. EL AGUA 2.1.

Según la Real Academia Española, el agua (del latín aqua) es la “sustancia formada por la combinación de un volumen de oxígeno y dos de hidrógeno, líquida, inodora, insípida, en pequeña cantidad incolora y verdosa o azulada en grandes masas. Es el componente más abundante en la superficie terrestre y más o menos puro, forma la lluvia, las fuentes, los ríos y los mares; es parte constituyente de todos los organismos vivos y aparece en compuestos naturales, y como agua de cristalización en muchos cristales”. Pero cabe señalar que desde el punto de vista científico, esta definición no tiene en cuenta los isótopos de hidrógeno y oxígeno, existiendo de esta forma, junto a la forma esencial del agua, H2O, el agua pesada, D2O, el agua hiperpesada, T2O y el agua semipesado HDO. A esto hay que añadir también la existencia de tres isótopos del oxígeno, O 16, O17 y O18, y tres isótopos del hidrógeno, H1, H2 o D (Deuterio) y H3 o T (Tritio) con lo que el líquido que comúnmente llamamos agua se trata de una mezcla de 18 cuerpos posibles, aunque en la práctica sea una mezcla de agua ligera (H2O) y de muy pequeñas cantidades de agua pesada y agua hiperpesada. El agua es considerada como uno de los recursos naturales más fundamentales para el desarrollo de la vida, y junto con el aire, la tierra y la energía, constituye los cuatro recursos básicos en que se apoya el desarrollo. Como hemos comentado, es el compuesto más abundante, cubriendo las tres cuartas partes de la superficie terrestre. Sin embargo, diversos factores limitan la disponibilidad de agua para uso humano, dejando de lado en este trabajo los factores económicos, sociales y políticos. Se sabe que más del 97 % del agua total del planeta se encuentra en los océanos y otras masas salinas y que podemos considerarla como inservible, ya que apenas están disponibles para ningún propósito. Del 3 % restante, un 2,38 % aproximadamente, se encuentra en estado sólido, resultando prácticamente inaccesible. El resto,

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un 0,62 %, se encuentra en ríos, lagos y aguas subterráneas. Como apreciamos, la cantidad disponible de agua es verdaderamente escasa, aunque mayor es el problema de la distribución irregular en el planeta. Diagrama de fases del agua

Diagrama de fases del agua

Formatted: Font: 14 pt

FUENTE: Wikipedia FUENTE: Wikipedia

Criterios ecológicos de la calidad del agua Criterios ecológicos de la calidad del agua

NMP=Numero más probable

NMP=Numero más probable

Formatted: Font: 14 pt

2.1.1.3.1.1.

PROPIEDADES FISICOQUIMICAS

Formatted: Font: Arial Narrow, Bold, Font color: Text 1

El agua es un disolvente polar. Como tal, disuelve bien sustancias iónicas y polares; no

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disuelve apreciablemente sustancias fuertemente apolares, como el azufre en la mayoría

Formatted: Font: Arial Narrow, Bold, Font color: Text 1

 Disolvente

de sus formas, y es inmiscible con disolventes apolares, como el hexano. Esta propiedad es de gran importancia para la vida.  Densidad La densidad del agua líquida es altamente estable y varía poco con los cambios de temperatura y presión. A presión normal de 1 atmósfera, el agua líquida tiene una mínima densidad a 100 ºC, cuyo valor aproximado es 0,958 Kg/l. Mientras baja la temperatura va aumentando la densidad de manera constante hasta llegar a los 3,8 °C donde alcanza una densidad de 1 Kg/l. Esta temperatura representa un punto de inflexión y es cuando alcanza su máxima densidad a presión normal. A partir de este punto, al bajar la temperatura, disminuye la densidad aunque muy lentamente hasta que a los 0 °C alcanza 0,9999 Kg/l. Cuando pasa al estado sólido ocurre una brusca disminución de la densidad, pasando a 0,917 Kg/l.  Polaridad La molécula de agua es muy dipolar. Los núcleos de oxígeno son muchos más electronegativos (atraen más los electrones) que los de hidrógeno, lo que dota a los dos enlaces de una fuerte polaridad eléctrica, con un exceso de carga negativa del lado del oxígeno, y de carga positiva del lado de los hidrógenos.  Cohesión La cohesión es la propiedad con la que las moléculas de agua se atraen a sí mismas, por lo que se forman cuerpos de agua adherida a sí misma, las gotas. Los puentes de hidrógeno mantienen las moléculas de agua unidas, formando una estructura compacta que la convierte en un líquido casi incompresible. Estos puentes se pueden romper fácilmente con la llegada de otra molécula con un polo negativo o positivo dependiendo de la molécula, o con el calor.  Adhesión El agua, por su gran potencial de polaridad, cuenta con la propiedad de la adhesión, es decir, el agua generalmente es atraída y se mantiene adherida a otras superficies, lo que se conoce comúnmente como “mojar”. Esta fuerza está también en relación con los

puentes de hidrógeno que se establecen entre las moléculas de agua y otras moléculas polares y es responsable, junto con la cohesión, del llamado fenómeno de la capilaridad.  Capilaridad El agua cuenta con la propiedad de la capilaridad, que es la propiedad de ascenso, o descenso, de un líquido dentro de un tubo capilar. Esto se debe a sus propiedades de adhesión y cohesión. Cuando se introduce un capilar en un recipiente con agua, ésta asciende por el capilar como si trepase “agarrándose” por las paredes, hasta alcanzar un nivel superior al del recipiente, donde la presión que ejerce la columna de agua se equilibra con la presión capilar.  Tensión superficial Por su misma propiedad de cohesión, el agua tiene una gran atracción entre las moléculas de su superficie, creando tensión superficial. La superficie del líquido se comporta como una película capaz de alargarse y al mismo tiempo ofrecer cierta resistencia al intentar romperla; esta propiedad contribuye a que algunos objetos muy ligeros floten en la superficie del agua.  Calor específico También esta propiedad está en relación con los puentes de hidrógeno que se crean entre las moléculas de agua. El agua puede absorber grandes cantidades de calor que utiliza para romper los puentes de hidrógeno, por lo que la temperatura se eleva muy lentamente. El calor específico del agua es de 1 cal/°C g.  Conductividad La conductividad eléctrica de una muestra de agua es la expresión numérica de su capacidad para transportar una corriente eléctrica. Esta capacidad depende de la presencia de iones en el agua, de su concentración total, de su movilidad, de su carga y de las concentraciones relativas, así como de la temperatura. 3.1.2. TIPOS DE AGUA 2.1.2. 3.1.2.1. AGUAS RESIDUALES URBANAS (ARU) 2.1.2.1.

Son los vertidos que se generan en los núcleos de población urbana, como consecuencia de las actividades propias de estos. Los aportes que generan esta agua son:

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

Aguas negras, fecales o aguas sanitarias son las aguas mezcladas con las

exoneraciones corporales. Es el agua que una vez ha sido utilizada por el hombre ha quedado polucionada. Es una combinación de las aguas procedentes de los retretes de las viviendas, de los centros comerciales, etc. Situación actual del estado de la depuración biológica. Explicación de los métodos y sus fundamentos. 

Aguas de lavado doméstico, son las llamadas aguas grises, que según el

Diccionario Técnico del Agua son “las procedentes de los usos domésticos antes de mezclarse con las aguas fecales. Proceden del lavado de ropa, limpieza de la casa, desperdicios de comida, etc.” Contienen materia en suspensión formadas por tierra, arena y diversas materias insolubles, materia orgánica, grasas, detergentes y sales diversas. 

Aguas de drenaje de calles. Estas aguas presentan, en general, un volumen muy

pequeño, y su contaminación depende de las condiciones locales.  Agua de lluvia y lixiviados. Es el agua que cae de las nubes en forma líquida o sólida. Es un agua que nunca es pura. Contiene disueltos distintos gases, además de determinados iones que se encuentran en la atmósfera en forma de polvo y que son resultado o consecuencia de diversos fenómenos que en ella se producen. Esto es, particularmente notable, en las zonas industriales y en las grandes aglomeraciones urbanas, en la que la atmósfera que los rodea está extraordinariamente polucionada. Principales microorganismos transmitidos por el agua

FUENTE: Moro, 2011 3.1.2.2. AGUA POTABLE 2.1.2.2. El decreto 1575 de 2007 emitido por el Ministerio de Salud Y La Protección Social, establece que el agua potable es aquella que, por cumplir las características físicas, químicas y microbiológicas, en las condiciones señaladas en el presente decreto y demás normas que la reglamenten, es apta para consumo humano. Se utiliza en bebida directa, en la preparación de alimentos o en la higiene personal. (Decreto 1575 de 2007). Puede provenir de distintas fuentes como lo son manantiales, ríos, pozos, y demás esta agua es captada y tratada para cumplir con la reglamentación vigente para el consumo humano. El agua de consumo inocua (agua potable), no ocasiona riesgos significativos para la salud cuando se consume durante toda una vida, teniendo en cuenta las diferentes vulnerabilidades que pueden presentar las personas en las distintas etapas de su desarrollo. Las personas que presentan mayor riesgo de contraer enfermedades transmitidas por el agua son los lactantes y los niños de corta edad, las personas debilitadas o que viven en condiciones antihigiénicas y los ancianos. El agua potable es adecuada para todos los usos domésticos habituales, incluida la higiene personal. (Guías

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para la calidad del agua potable, OMS). El peligro más común relativo al agua potable es el de su contaminación, la cual puede ser directa o indirecta, debido al efecto de aguas residuales, de otros desechos o de las excretas del hombre o los animales. Si dicha contaminación es reciente y entre los factores que contribuyen a ella se hallan agentes portadores de enfermedades entéricas transmisibles, es posible que estén presentes los organismos causantes de dichas enfermedades. Beber agua contaminada o emplearla en la preparación de bebidas o alimentos puede producir mayor número de casos de infección. (OPS, 1997). Características físicas

FUENTE: resolución 2015 de 2007 Características químicas

FUENTE: resolución 2015 de 2007 3.1.2.3. AGUAS RESIDUALES INDUSTRIALES 2.1.2.3. Son aquellas que proceden de cualquier actividad o negocio en cuyo proceso de producción, transformación o manipulación se utilice agua. Presentan características muy distintas de las aguas residuales urbanas. Son enormemente variables en cuanto a caudal y composición, difiriendo las características de los vertidos, no sólo de una industria a otra, sino también dentro de un mismo tipo de industria. A veces, las industrias no emiten vertidos de forma continua, sino únicamente en determinadas horas del día o incluso

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únicamente en determinadas épocas del año, dependiendo del tipo de producción y del proceso industrial. También son habituales las variaciones de caudal y carga a lo largo del día. Están más contaminadas que las aguas residuales urbanas, además, con una contaminación mucho más difícil de eliminar. Su alta carga unida a la enorme variabilidad que presentan, hace que el tratamiento de las aguas residuales sea complicado. Por esta razón, al querer adentrarse en el amplio mundo del conocimiento de las aguas residuales industriales, se corre el peligro de equivocarse al querer simplificar el problema, intentando generalizar e incluso querer extrapolar, aplicando las técnicas que se aplican en las aguas residuales urbanas. Por esta razón es necesario un estudio específico en cada caso. De acuerdo con la posibilidad de biodegradación de la materia orgánica presente, se pueden distinguir tres clases de aguas: o Aguas residuales industriales que contienen materia orgánica 

Con aporte de nitrógeno y fósforo



Sin aporte de nitrógeno y fósforo

o Aguas residuales industriales que sólo contienen sustancias minerales 

Con sustancias tóxicas



Sin sustancias tóxicas

o Aguas residuales mixtas 3.1.2.4. AGUAS AGRÍCOLAS 2.1.2.4. Actualmente, aproximadamente 3 600 km3 de agua dulce son extraídos para consumo

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humano, es decir, 580 m3 per cápita por año. El diagrama de barras adjunto muestra queque, en todas las regiones, con excepción de Europa y América del Norte, la agricultura es obviamente el sector que consume más agua, representando globalmente alrededor del 69 por ciento de toda la extracción, el consumo doméstico alcanza aproximadamente el 10 por ciento y la industria el 21 por ciento.

2.2.3.2. MICROORGANISMOS INDICADORES DE LA CALIDAD EN EL AGUA: Varios organismos patógenos de transmisión fecal-oral pueden estar presentes en el agua cruda, entre ellos bacterias como la Salmonella sp, Shighella sp, coliformes fecales y totales, las cuales

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han sido encontradas en abastecimientos de agua potable. (Ocasio y López, 2004). La verificación de la calidad microbiológica del agua de consumo incluye el análisis de la presencia de Escherichia coli, un indicador de contaminación fecal. No debe haber presencia en el agua de consumo de E. coli, ya que constituye una prueba concluyente de contaminación fecal reciente. En la práctica, el análisis de la presencia de bacterias coliformes termo tolerantes puede ser una alternativa aceptable en muchos casos E. colie es un indicador útil, pero tiene limitaciones. Los virus y protozoos entéricos son más resistentes a la desinfección; por tanto, la ausencia de E. coli no implica necesariamente que no haya presencia de estos organismos. En ciertos casos, puede ser deseable incluir en los análisis microorganismos más resistentes, como bacteriófagos o esporas bacterianas, por ejemplo, cuando se sabe que el agua de origen que se usa está contaminada con virus y parásitos entéricos, o si hay una incidencia alta de enfermedades virales y parasitarias en la comunidad. (Guías para la calidad del agua potable, Vol.1, OMS).

3.2.1. COLIFORMES TOTALES: 2.2.1. Los coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y constituyen un grupo de bacterias que se definen más por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios taxonómicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y 14 gas, más o menos rápidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubación comprendida entre 30-37ºC.). Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo coliforme forman parte varios géneros: Escherichia, Enterobacter,Klebsiella, Citrobacter, etc. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero también en otros ambientes: agua, suelo, plantas, cáscara de huevo, etc. Una elevada proporción de los coliformes que existen en los sistemas de distribución no se debe a un fallo en el tratamiento en la planta, sino a un recrecimiento de las bacterias en las conducciones. Dado que es difícil distinguir entre recrecimiento de coliformes y nuevas contaminaciones, se admite que todas las apariciones de coliformes son nuevas contaminaciones, mientras no se demuestre lo contrario. La prueba más relevante usada para la identificación del grupo coliformes es el hidrolisis de la lactosa. El rompimiento de este disacárido es catalizado por la enzima B-D-Galactosidasa. Ambos monosacáridos (la lactosa después es transformada en glucosa por reacciones bioquímicas) posteriormente son metabolizados a través del ciclo glicolitico y ciclo del citrato. Los productos metabólicos

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de estos ciclos son ácidos y/o CO2. Para la determinación de la B-Galactosidasa se utilizan medios cromógenos tales como chromocult. 3.2.2. COLIFORMES FECALES: 2.2.2. Los coliformes fecales también denominados coliformes termo tolerante, llamado así porque

Formatted: Heading 3, Left, Indent: Left: -0.01", Hanging: 0.4", Outline numbered + Level: 3 + Numbering Style: 1, 2, 3, … + Start at: 1 + Alignment: Left + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.75"

soportan temperaturas de hasta 45ºC, comprenden un grupo muy reducido de microorganismos los cuales son indicadores de calidad, ya que son de origen fecal. En su mayoría están representados por el microrganismo E. Coli, pero se pueden encontrar entre otros menos frecuentes Citrobacterfreundii y Klebsiellapneumoniae, estos últimos hacen parte de los coliformes termo tolerante, 15 pero su origen se asocia generalmente con la vegetación, y solo ocasionalmente aparecen en el intestino. (Hayes, 1993). Los coliformes fecales integran el grupo de los coliformes totales, pero se diferencian de los demás microorganismos que hacen parte de este grupo, en que son indol positivo, su rango de temperatura óptima de crecimiento es muy amplio (hasta 45ºC) y son mejores indicadores de higiene en alimentos y en aguas, la presencia de estos indica presencia de contaminación fecal de origen humano o animal, ya que las heces contienen dichos microorganismos, presentes en la flora intestinal y de ellos entre un 90% y un 100% son E. Coli mientras que en aguas residuales y muestras contaminadas este porcentaje disminuye a un 59%. (Gómez, 1999).

3.2.2.1. ESCHERICHIA COLI 2.2.2.1. E. coli es una de las especies bacterianas más minuciosamente estudiadas, y no solamente por sus capacidades patogénicas, sino también como sustrato y modelo de investigaciones metabólicas, genéticas, poblacionales y de diversa índole (Neidhardt, 1999). Forma parte de la familia Enterobacteriaceae (Ewing, 1985). Son coliformes capaces de producir indol, a partir de triptófano, en 21 ±3 horas a 44 ±0.5ºC. También poseen la enzima B-Galactosidasa, que reacciona positivamente en el ensayo del rojo de metilo y puede descarboxilar el ácido L-Glutámico, pero no son capaces de usar citrato como única fuente de carbono o de crecer en un caldo con cianuro de potasio (KCN).

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2.3.3.3. METODOS: 3.3.1. MÉTODO DE LA MEMBRANA FILTRANTE: 2.3.1. Este método se fundamenta en determinar el número y tipo de microorganismos presentes en una muestra de agua de proceso, por medio de la filtración de la misma a través de una membrana filtrante con poros de tamaño adecuado (0,45 μm de diámetro), la consiguiente retención de los microorganismos sobre dicha membrana y el cultivo de los mismos en diferentes agares de acuerdo al tipo de microorganismoMATERIALES 

Muestra de agua de proceso



Agua peptonada al 0,1 %



Placas estériles con medio ENDO



Placas estériles con agar Sabouraud



Placas estériles con agar Cetrimide



Placas estériles con agar MacConkey



Placas estériles con agar para



Recuento en Placa (Agar Standard Methods)



Equipo de filtración (Millipore)



Membranas filtrantes estériles



Bomba de vacío



Pinzas estériles



Estufa

PROCEDIMIENTO a) Colocar una membrana filtrante estéril, bajo condiciones asépticas, sobre el centro del portade la porta filtro, usando pinzas estériles, con la superficie cuadriculada hacia arriba. b) Ensamblar el equipo, colocando el dispositivo de filtración y asegurando con una pinza c) Verter 100 mL de la muestra de agua, en el porta filtro y proceder a filtrar. d) Lavar el embudo con aproximadamente 100 mL de agua peptonada al 0,1%. e) Remover la parte superior de la porta filtro, y con una pinza estéril transferir la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo correspondiente al

Formatted: Font: Bold, Font color: Text 1 Formatted: Heading 2, Left, Indent: Left: -0.05", Outline numbered + Level: 2 + Numbering Style: 1, 2, 3, … + Start at: 1 + Alignment: Left + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.5" Formatted: Font: Bold, Font color: Text 1 Formatted: Heading 3, Left, Indent: Left: -0.01", Hanging: 0.4", Outline numbered + Level: 3 + Numbering Style: 1, 2, 3, … + Start at: 1 + Alignment: Left + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.75"

microorganismo que se va a identificar: Coliformes en agarendo, bacterias aerobias mesófilas en agar para recuento en placas, mohos y levaduras en agar Sabouraud y Pseudomonas aeruginosa en agar cetrimide. f) Al colocar la membrana, evitar la formación de burbujas entre ésta y el medio de cultivo. g) Esperar aproximadamente 20 minutos, para permitir la adhesión de la membrana al medio. h) Con excepción de las placas de agar Sabouraud, incubar las placas en forma invertida, a las diferentes temperaturas y tiempos, de acuerdo al microorganismo investigado.

2.3.2.3.3.2. MÉTODO ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA CON ASPIRACIÓN DIRECTA Este método de ensayo establece la metodología para el análisis de magnesio total mediante espectrofotometría de absorción atómica. Este método, es aplicable para la determinación del contenido de magnesio, según lo establecido en la norma NCh 409/1- Of. 2005. PRINCIPIOS Una fracción de muestra previamente digerida es aspirada hacia una llama aire - acetileno posicionado en el paso óptico de un espectrofotómetro de absorción atómica. La muestra en estas condiciones es atomizada. 3.2 La población de átomos al estado elemental absorbe radiación característica proveniente de una fuente de emisión de líneas atómicas de Mg, la relación entre potencia incidente y potencia transmitida es una medida de la concentración del elemento en la muestra. REACTIVOS 

Agua grado reactivo para análisis, clase 1 o 2 según NCh 426/2, exenta de magnesio



Ácido clorhídrico, HCl 37 % v/v.



Ácido nítrico, HNO3, 65 % v/v.



Estándar comercial de Mg, de 1000 mg/L, alternativamente varilla de magnesio.



Cloruro de lantano 5.1.6 Aire



Acetileno

Soluciones de calibración estándar.

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Preparar una serie de soluciones de calibración en el rango óptimo de trabajo, a partir de diluciones apropiadas del estándar de 1000 mg/L, preparado anteriormente. Almacenar en envases de polietileno de alta densidad debidamente etiquetados. La condición de acidez final para estándares es 10 % v/v HCl. Solución blanco término cero. La solución término cero debe ser preparada con agua para análisis grado reactivo exenta de Mg y en un medio 10 % HCl v/v. Equipos e instrumentos  Balanza analítica, de sensibilidad igual o mayor a 0,1 mg  Campana, con sistema de extracción de gases.  Espectrofotómetro de absorción atómica, dotado con quemador aire acetileno, y corrector de deuterio.  Fuente de emisión, de líneas atómicas de Mg.  Plancha calefactora, con regulación de temperatura o digestor microondas (opcional).  Material de uso habitual en laboratorio, vasos de precipitado, dispensadores, pipetas graduadas y otros. 3.3.3. TÉCNICA DE NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) 2.3.3. Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcione como indicador de contaminación fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y debe de ser capaces de desarrollarse extra intestinalmente.

Soluciones

 Frascos gotero con reactivo de Erlich o Kovace  Frascos gotero con indicador rojo de metiloe.  Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1e.  Frascos gotero con solución de hidróxido de potasio al 40 % VP2e  COLORANTES

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3.3.4. METODO COLILERT: 2.3.4. Esta prueba se encuentra patentada por IDEXX, se utiliza para la detección de coliformes totales y Escherichia Coli en un periodo de 24 horas, Colilert Quanti-Tray es una prueba diseñada específicamente para el recuento NMP (Numero Más Probable) de E. coli y bacterias coliformes a partir de muestras de agua potable u otras aguas de características similares, ya sea tratada o sin tratar. Se basa en la Tecnología de Sustrato. Cuando las bacterias coliformes metabolizan el nutriente indicador ONPG, el color de la muestra se vuelve amarilla. Cuando E. Coli metaboliza un segundo nutriente indicador (MUG), la muestra emite fluorescencia con luz UV. Colilert permite la detección simultánea de estas bacterias en 24 horas, a una concentración de 1ufc/100 ml y en presencias de números tan elevados de bacterias heterótrofas como 2x106/100 ml de muestra. Además de ONPG Y MUG, sustratos que son usados como fuentes de carbono, el Colilert contiene sulfato de amonio como fuente de nitrógeno, sales minerales y sulfito de sodio que ayudan a reparar los coliformes dañados. La norma UNE-EN ISO 9308-2, describe el método para la detección y/o recuento de E. coli y bacterias coliformes en aguas según el método NMP (Número más Probable). La detección de E. coli se basa en la expresión de la enzima ß-D-glucoronidasa. El producto Colilert-18/Quanti-Tray, fabricado por la empresa Idexx, ha sido reconocido como método de referencia en esta UNE-EN ISO 9308-2, incluida en la actual Directiva sobre Aguas de

Formatted: Font: Bold, Font color: Text 1 Formatted: Heading 3, Indent: Left: -0.01", Hanging: 0.4", Outline numbered + Level: 3 + Numbering Style: 1, 2, 3, … + Start at: 1 + Alignment: Left + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.75"

Consumo Humano (CEE 2015/1787), la cual será traspuesta a la legislación española antes del 27 de octubre de 2017. Colilert-18 es un método muy sencillo, rápido y con confirmación directa. Para la determinación de presencia/ausencia, únicamente es necesario añadir a 100 ml de la muestra problema, el reactivo Colilert-18. Tras homogeneizar y disolver el reactivo, se incuba la muestra durante 18 horas a 35 ºC. Transcurrido ese tiempo, la presencia de coliformes vendría dada por una coloración amarilla de la muestra, mientras que la presencia de E. coli estaría marcada por la fluorescencia en la muestra cuando ésta es observada bajo una luz UV a 365 nm. Cuando se requiere cuantificación, la muestra con el reactivo se vierte en un blíster de 51 pocillos el cual, una vez sellado, se incuba tal y como se ha descrito anteriormente. En este caso, se contarán los pocillos que desarrollan coloración amarilla y fluorescencia, datos que se llevarán a unas tablas de NMP para la cuantificación de coliformes y E. coli en la muestra de agua. VENTAJAS Identifica E. coli específicamente, lo que elimina las notificaciones públicas innecesarias debidas a resultados positivos falsos inducidos por Klebsiella pneumoniae.  • Suprime hasta 2 millones de heterótrofos por cada 100 ml  • Elimina la interpretación subjetiva de los métodos tradicionales • Detecta un coliforme o E. coli viable individual por muestra  Esta celda se utiliza en el método cuando ya la muestra está preparada. Al igual que esta hay otro similar que sirve para introducir al equipo para que lo selle. Celda para la muestra

Celda para la muestra

FUENTE: Wikipedia

FUENTE: Wikipedia

Tabla de NMP (número Tabla demás NMPprobable) (número más probable)

FUENTE: Wikipedia

FUENTE: Wikipedia

III.IV.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1. MATERIALES 3.1.  Probeta  Fiola  Vaso de precipitado

Formatted: Font: 16 pt, Font color: Text 1 Formatted: Heading 1, Centered, Outline numbered + Level: 1 + Numbering Style: I, II, III, … + Start at: 1 + Alignment: Left + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.75" Formatted: Font: Bold, Font color: Text 1 Formatted: Heading 2, Indent: Left: -0.05", Outline numbered + Level: 2 + Numbering Style: 1, 2, 3, … + Start at: 1 + Alignment: Left + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.5"

 Tableta para análisis QUANTY TRAY  Fresco esterilizado (2) uno para muestra y otro para análisis. 4.2. EQUIPOS 3.2.  Selladora QUANTY TRAY modelo 200 INDEX  Incubadora QUANTY TRAY modelo 200 INDEX

Formatted: Font: Bold, Font color: Text 1 Formatted: Heading 2, Indent: Left: -0.05", Outline numbered + Level: 2 + Numbering Style: 1, 2, 3, … + Start at: 1 + Alignment: Left + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.5"

 Equipo de rayos Uv para el análisis de E. Coli. 4.3. REACTIVOS 3.3.  Muestra de riego (100 mL)  Pastilla colilert (comida de bacterias) 4.4. PROCEDIMIENTO 3.4.  Se esteriliza el frasco donde se introducirá la muestra para evitar la proliferación de bacterias.  Se realiza la toma de muestra respectiva en nuestro caso la muestra que se tomo es de riego.

Formatted: Font: Bold, Font color: Text 1 Formatted: Heading 2, Indent: Left: -0.05", Outline numbered + Level: 2 + Numbering Style: 1, 2, 3, … + Start at: 1 + Alignment: Left + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.5"

Formatted: Font: Bold, Font color: Text 1 Formatted: Heading 2, Left, Indent: Left: -0.05", Outline numbered + Level: 2 + Numbering Style: 1, 2, 3, … + Start at: 1 + Alignment: Left + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.5"

 Se esteriliza los siguientes materiales: probeta, vaso de precipitado para el uso correspondiente.  Se toma 100 ml de la muestra en una probeta o fiola.  Se abre el frasco que viene con el kit, para ello se le quita el seguro que es la línea roja y se vacía en ello.  En seguida se debe verificar que la muestra este un poco por encima de la línea que está en el frasco para asegurar que llene todos los cubitos decubitos de la tableta.  Se agrega la pastilla al contenido del frasco (muestra) para ello se sigue las siguientes indicaciones se chanca con los dedos a la envoltura de la pastilla para evitar desperdicio, se fragmenta en dos partes y se vacía el contenido.  Se agita el frasco durante minutosdurante minutos para que se disuelva por completo.  En seguida se toma la tableta y se abre para vaciar la muestra, se vacía la muestra por completo y se golpea con los dedos a los cubitos para evitar burbujas ya que estas contienen oxígeno y para este tipo de análisis debemos evitar cualquier presencia de oxígeno en la tableta y evitar que vivan las bacterias.  Con mucho cuidado se lleva esta tableta a la selladora, se coloca en el molde y se introduce suavemente con los dedos hasta que la maquina lo jale, se espera a la salida para obtener la tableta. En seguida se lleva a la incubadora modelo QUANTY-TRAY 2Y INDEX a una temperatura constante de 35°C por 24 horas. 

IV.V.

RESULTADOS

Formatted: Font: 16 pt, Font color: Text 1 Formatted: Heading 1, Centered, Outline numbered + Level: 1 + Numbering Style: I, II, III, … + Start at: 1 + Alignment: Left + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.75"

Figura 1: Coloración de muestra patrón

Figura 12: Coloración de muestra analizada después de la incubación (24h)

Figura 3: Coloración por Exposición a rayos UV

5.1. CONTEO DEL NUMERO DE POCILLOS POSITIVOS: COLIFORMES TOTALES(Coloracion amarilla) 

Numero de pocillos grandes :49



Numero de pocillos pequeños :48

ESCHERICHIA COLI(coloracion amarilla+coloracion fluorescente) 

Numero de pocillos grandes :49



Numero de pocillos pequeños :48

Formatted: Font color: Text 1, Check spelling and grammar Formatted: Heading 2, Left, Indent: Left: -0.05", Outline numbered + Level: 2 + Numbering Style: 1, 2, 3, … + Start at: 1 + Alignment: Left + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.5"

5.2. DETERMINACION DEL NMP PARA CADA MICROORGANISMO: Para la determinacion del NMP de los microorganismos analizados se emplea la tabla IDEXX Quanti-Tray®/2000. La interseccion del # de pocillos grandes y el # de pocillos pequeños nos dara este resultado. COLIFORMES TOTALES NMP/100Ml(49x48) = >2419.6 ESCHERICHIA COLI NMP/100Ml(49x48) = >2419.6

Formatted: Font color: Text 1, Check spelling and grammar Formatted: Heading 2, Left, Indent: Left: -0.05", Outline numbered + Level: 2 + Numbering Style: 1, 2, 3, … + Start at: 1 + Alignment: Left + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.5"

V.VI.

DISCUSION DE RESULTADOS

En la comparacion de la coloracion amarillo con la muestra patron ,se observa que cada uno de los pocillos de la tableta grandes y pequeños han adquirido la coloracion amarilla(fig.2) igual e incluso mas intensa.Ademas en la fig.3 para escherichia coli,de la misma forma todos los pocillos toman coloracion fluorescente .El resultado obtenido por lectura de la tabla fue ,>2419.6, un agua que supera el 1000/100ml máximo de coliformes para riego dado por la OMS. Por lo tanto el agua usada para riego en esta zona no esno es apta para este uso; pues representa un riesgo alto, para potenciales consumidores de los productos obtenidos, trabajadores y familiares.

Formatted: Font: 16 pt, Font color: Text 1 Formatted: Heading 1, Centered, Outline numbered + Level: 1 + Numbering Style: I, II, III, … + Start at: 1 + Alignment: Left + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.75"

VI.VII.

CONCLUSIONES

 Se llegó a conocer el análisis microbiológico de agua de riego por el método colifert.  Se llegó a conocer y entender el funcionamiento de los equipos como también el procedimiento para hacer el análisis microbiológico del agua de riego.  Se verifico y contabilizo los resultados de coliformes totales y escherichia coli del agua de riego.

Formatted: Font: 16 pt, Font color: Text 1 Formatted: Heading 1, Centered, Outline numbered + Level: 1 + Numbering Style: I, II, III, … + Start at: 1 + Alignment: Left + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.75"

VII.VIII. 

BIBLIOGRAFIA

Alves NC, Odorizzi AC, Goulart FC.Análisis microbiológica de aguas de minerales y de residuales.



Agua potable de abastecimiento, Marília, SP. Revista Salud Pública, v. 36, n. 6, p. 74951.



Feng P, and P. Hartman 1982. Fluorogenic assay for immediate confirmation of E. coli. Appl. Environ. Microbiol. Vol 43: 1320-1329.



Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número más probable.



Norma Oficial Mexicana NOM-201-SSA1-2002, Productos y servicios. Agua y hielo para consumo humano, envasado y a granel. Especificaciones sanitarias.

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VIII.IX. ANEXOS

Formatted: Font: 16 pt, Font color: Text 1 Formatted: Heading 1, Centered, Outline numbered + Level: 1 + Numbering Style: I, II, III, … + Start at: 1 + Alignment: Left + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.75"