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• Danie J. Garcia

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA MÓDULO DE MICROBIOLOGÍA I Chávez Hernández Ana María García Villegas Daniela Jazmín Hernández Villalva Claudia González Olmos Arianna Equipo 3 Grupo 1602 Asesor: Beatriz Arellano Análisis Microbiológico del agua •|| OBJETIVO ||• Aprender la manera correcta de realizar el análisis microbiológico del agua y su importancia en el ámbito de la salud pública. •|| RESUMEN ||• Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por el agua, es necesario analizarla en busca de microorganismos principalmente de coliformes. Para esto se realizan las pruebas de Número Más Probable (NMP), que es una prueba presuntiva de la presencia de coliformes, aislamiento en agar EMB e IMViC que son pruebas confirmatorias para coliformes. Solo se realizo NMP, la muestra fue de agua de garrafón de purificadora, debido a que es agua potable la NOM-127-SSA1-1994 reporta cual es la carga microbiana permitida. Se obtuvo 460 NMP/100mL. •|| INTRODUCCION||• El agua es el elemento de contagio directo o indirectamente de los agentes productores de enfermedades y con el fin de garantizar el mayor grado posible de inocuidad del agua destinada al consumo

público, la mayoría de los países han establecido normas de potabilidad tanto físicas, químicas y bacteriológicas. Bajo el aspecto bacteriológico la elección de gérmenes indicadores de contaminación, esencial para la interpretación de la calidad de las aguas objeto de examen, ha sido y es motivo de debata bajo la luz que proporcionan las nuevas técnicas analíticas, los medios de cultivo más selectivos y el mejor conocimiento epidemiológico, que permiten conceder a cada indicador bacterianos el crédito de confianza que real y verdaderamente merece. A continuación de acuerdo a la NOM127-SSA1-1994 se describirán los parámetros establecidos para que el agua sea potable y así poder hacerla apta para su uso y consumo humano. El agua deberá estar libre de coliformes, dicho en otras palabras ausencia de microorganismos Gram (-), cocobacilos, catalasa (+), oxidasa (-) que pertenecen a la familia de las Enterobacterias, fermentan lactosa con producción de H2S y CO2 y son facultativos. Para la determinación de presencia de coliformes se utilizan los siguientes métodos: Número más probable (NMP), también conocido como el método de los ceros de Poisson, es una forma de obtener datos cuantitativos en concentraciones de elementos discretos a partir de datos de incidencia positiva/negativa. Es una estrategia eficiente para estimar densidades de

población que se emplea cuando una evaluación cuantitativa de elementos individuales. Consiste en sembrar tres alícuotas de la muestra original seriadas en 9 o 15 tubos con medio apropiado el número de microorganismos se determina utilizando las tablas convencionales del NMP. Entre sus ventajas tiene que es relativamente sencillo y barato y que mediantes el uso apropiado de medios selectivos y diferenciales se puede determinar el número de microorganismos pertenecientes a grupos específicos. IMViC es una prueba utilizada en biología para la identificación bacterias. Se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de metilo, VogesProskauer y Citrato. El resultado de este test se expresa mediante símbolos de positivo o negativo (+ o -) según el resultado de cada prueba, siguiendo siempre el orden establecido por las iniciales del método. Así por ejemplo, el IMViC de la bacteria Salmonella y Citrobacter es -++. Para E.coli es ++-y para Klebsiella y Enterobacter es --++. Cuenta en placa: Cosiste en una serie de diluciones que se realiza en tubos con solución salina isotónica, para después cada dilución vaciarla en placa en agar nutritivo, la cantidad de microorganismo se calcula multiplicado el número de UFC/mL por el reciproco de la dilución. Filtración por membrana: Consiste en hacer pasar una cantidad previamente determinada de agua a través de una membrana (celulosa o policarbonato) con un diámetro de poro de 0.45 µ que retiene a las bacterias, pero que permite

ser atravesada por el agua. La membrana se coloca posteriormente en una caja Petri en la que se ha depositado un medio de cultivo adecuado y sometida a continuación a incubación a 35-37º C, para coliformes y a 44-45 ºC para coliformes fecales durante 20 horas. Al cabo de este periodo se observan las colonias aparecidas. Si es necesario, las colonias individuales recogidas son sometidas a subcultivos en caldo lactosado y observación microscópica previa tinción de Gram. •|| METODOLOGIA ||• Se prepararon 9 tubos de caldo Rojo de fenol + lactosa, de tres en tres a diferentes concentraciones. Los primeros 3 tubos contenían 10 mL de una solución a doble concentración, los siguientes tres contenían 9 mL de una disolución a una concentración normal y los últimos tres contenían 9.9 mL también a una concentración normal. Cada uno de los tubos se le agregó previamente una campana de Durham, la cual es útil para observar la producción de gas. Después de añadir las cantidades antes mencionadas a cada tubo, se agitaron volteándolos de cabeza y colocándolos bien de nuevo para propiciar que el líquido se colocara dentro de la campana de Durham también. Después se procedió a añadir la muestra de agua a analizar, siendo 10 mL de muestra para los tubos que contenían 10 mL de la solución a doble concentración, un mL de muestra para los tubos que contenían 9 mL a concentración normal y 0.1 mL para los tubos que contenían 9.9 mL de la solución a concentración normal. Se colocaron los tubos en la incubadora a 37°C durante 24 hrs y se procedió a leer

los resultados obtenidos con ayuda de las tablas de McCrady para NMP. NOTA: solo se realizaron las pruebas presuntivas, las pruebas confirmativas no se llevaron a cabo y por lo tanto no se reporta morfología colonial debido a la falta de material (placa de agar EMB), tampoco fue posible realizar la prueba de IMViC para la identificación de los coliformes presentes en el agua analizada, también por falta de material.

•|| RESULTADOS||•

Producci ón de gas

Producci ón de acido

Interpret ación

10 ml Concentr ación de lactosa doble

Positiva

Positiva

(+) Ac/ (+)Gas

1 ml Concentr ación de lactosa normal

Positiva

Positiva

(+) Ac/ (+)Gas

Serie

NMP (3 tubos)

0.1 ml Concentr ación de lactosa normal

Número de tubos positivos 1 2 3 NMP= 460/dL

1 Positivo 2 negativo

Positiva

(+) Ac/ (+)Gas (+) Ac/ (-)Gas

10 ml

1.0 ml

0.1 ml

+ + +

+ + +

+ -

•|| ANALISIS DE RESULTADOS||• Ana María: El método de los tubos múltiples es uno de los más utilizados para la detección y numeración de organismos coliformes en exámenes sanitarios que se realizan para determinar la calidad del agua potable. Se realizó solamente la prueba presuntiva para 3 grupos de 3 tubos con caldo lactosado, inoculando en cada grupo 1, 10 y 0.1ml de la muestra de agua a analizar. Tal prueba dio positiva, al observarse un cambio de color, de rojizo a amarillo, debido a la producción de acido y CO2 por la fermentación de la lactosa, característica de organismos coliformes, pero a pesar de dar “positiva”, se requiere de la realización de la prueba confirmativa debido a que tal fermentación pudo ser provocada por otros microorganismos no coliformes. Se utiliza agar EMB para inocular a partir de cada tubo y si se observan colonias verde brillante se confirma la presencia de coliformes, y se diferencia el género de la bacteria con ayuda de pruebas IMViC (Indol, Rojo de Metilo, Vogues Proskauer y Citrato) la cual arroja resultados diferentes para:  Klebsiella sp  Escherichia sp  Citrobacter sp  Enterobacter sp Desafortunadamente no fue posible realizar las pruebas confirmativas debido a falta de material (places EMB y tubos para las pruebas IMViC). Conclusión: Se aprendió a realizar el análisis microbiológico del agua, a pesar de no poder realizar algunas pruebas y se confirma lo importante que es en el ámbito de la salud pública, que se cumpla con lo establecido en la NOM-

127-SSA1-1994, sobre la cantidad de microorganismos coliformes permitidos para no poner en riesgo la salud, por un mal tratamiento de purificación del agua.

Daniela: Para la determinación de coliformes en agua se realizó el método del número más probable, los tubos después de la incubación se observaron amarillos, lo cual indica que el medio se acidifico y había presencia de gas (burbujas) en la gran mayoría de los tubos. La presencia de coliformes es evidente sin embargo no se realizaron las pruebas de identificación de los microorganismo presentes, debido a una confusión que se realizó en la práctica no hubo una placa de EMB disponible para poder sembrar y posteriormente poder realizar de una colonia aislada IMViC, pero se sabe que si en la placa de EMB hubiera habido crecimiento bacteriano de colonias verde brillante u oscuras, serian colonias sospechosas y entonces se hubiera realizado la prueba de identificación IMViC en la que se inocula una colonia perfectamente aislada en SIM, Rojo de Metilo, Vogues Proskauer y Citrato, después de inocular se incuban a 44.5 ºC por 24 horas para saber si son coliformes fecales y para coliformes totales se incuba a 37ºC ,

los posibles resultados son los siguientes:

Finalmente se reportan los resultados de cada prueba y podríamos saber de qué m.o se trata, ya que cada uno tiene una clave, Salmonella y Citrobacter es -+-+.Para E.coli

es ++-- y para Klebsiella y Enterobacter es -++

Conclusión: Se aprendió a realizar la prueba de control microbiológico del agua (NMP) y la importancia que tiene, además de las pruebas que requiere para su identificación, la muestra de agua proporcionada de una purificadora se rechaza ya que no es potable, al no cumplir con la higiene y sanitación para el consumo humano. No se determinó si la presencia de coliformes era total o fecal, ni de que microorganismo estaban contaminadas, sin embargo se sabe que son coliformes. Arianna: Debido a que no se pudieron realizar las pruebas confirmativas por falta de material sólo se pudieron obtener los resultados de la prueba presuntiva de Número más probable para coliformes, Al observarse el vire de color en todos los tubos, se puede determinar que posiblemente existen bacterias coliformes en la muestra analizada, ya que esta formación de ácido se da gracias a la fermentación de la lactosa, que es el disacárido contenido en el medio. Sin embargo, no solo los coliformes pueden fermentar los disácaridos, sino que otras bacterias mesófilas aerobias también pueden degradar la lactosa por lo que era indispensable la realización de las pruebas confirmativas para determinar la presencia de coliformes, ya que el medio agar EMB es selectivo y diferencial para bacterias Gram negativas, y siendo que las bacterias coliformes son entéricas la mayoría de estas son Gram negativas, buscándose principalmente la presencia de E. coli (Gram negativa), la cual es el principal indicador de contaminación por coliformes; y la prueba de IMViC era

necesaria para poder confirmar la presencia de E. coli que de haber sido aislada en el medio agar EMB y sembrada en el medio antes mencionado hubiese presentado, según la literatura, los siguientes resultados: Indol positivo, Rojo de Metilo positivo, Vogues-Proskauer negativo y Citrato negativo . También se presentó la formación de gas, que tiene la misma causa que la formación de ácido, ya que entre los productos finales de la fermentación también se encuentran el CO2. Conclusión: Se determinó que posiblemente existan bacterias coliformes en la muestra de agua analizada. Claudia: Al solo realizar la prueba de número más probable que es una prueba presuntiva la determinación de coliformes no es confiable. La determinación del número más probable del microorganismo coliforme al fermentar la lactosa produce acido y gas que es lo observable en esta prueba ya que el medio tubo un vire del indicador y en la campana de Durham quedaron atrapadas burbujas. Por una distribución probabilística se obtuvo en número de NMP. La NOM-127-SSA1-1994 menciona que la cantidad permitida de coliformes presentes en la muestra de agua potable debe ser de 2NMP/100mL; al obtener 460 NMP/100 mL la muestra de agua de garrafón, tiene un elevado número de microorganismos, al cual para confirmar que eran de origen fecal se realizan las pruebas confirmativas, estas no fueron realizadas a causa de falta de material. Conclusión: La determinación de microorganismos en el agua permite

determinar si esta tiene la posibilidad de causar alguna enfermedad. Aunque solo sea posible de que el agua analizada tenga coliformes, se recomienda no consumirla. •|| REFERENCIAS||• 

Secretaria de Salud, NOM-127SSA1-1994, “Salud ambiental, agua



para uso y consumo humano, límites permisibles”, México D.F., 1994. Koneman E.W. “Diagnostico microbiológico: texto y atlas” Editorial Medica Panamericana, 2001.