• Author / Uploaded
• Raissa Lorena Heredia

Citation preview

PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA ENTEROBACTERIAS

1.

TSI.- AGAR CON AZUCAR TRIPLE Y HIERRO a. Objetivo

Determinar la capacidad de un microorganismo fermentar la glucosa, lactosa y sacarosa, con producción de gas o sin ella y la producción de acido sulfihidrico (H2S). b.

Indicador

Rojo Fenol:   

Alcalino: Rojo Acido: Amarillo Medio sin sembrar: naranja-rojizo c.

Fundamento

En este medio, el extracto de carne y pluripeptona aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano. Los hidratos de carbono fermentables son: glucosa (0.1%), lactosa (1%) y sacarosa (1%). El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de H2S y el sulfato de hierro y amonio es el indicador de H2S. El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que existan dos cámaras de reacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada expuesta en toda su superficial oxigeno es aerobia y la porción inferior está protegida del aire es la anaerobia. La fermentación tiene lugar tanto en anaerobiosis como en anaerobiosis. En el pico de flauta, el monosacáridos glucosa es catabolizado por la vía metabólica Embed-Meyerhof-Parnas para producir es acido piruvico. El acido piruvico es degradado luego a través del ciclo de Krebs, para rendir C0 2, H2O y energía. En el fondo existen condiciones anaerobias de forma que la glucosa se metaboliza por la vía de Embed-Meyerhof-Parnas a ATP y acido piruvico que luego se convierte en acido láctico y otros ácidos orgánicos. 

Fermentación solo de glucosa: El pico de flauta es rojo (alcalino) porque al principio se degrada aerobicamente la glucosa pero debido a su baja concentración se agota y el microorganismo empieza a usar las peptonas liberando Amoniaco y alcalinizando el medio. Sin embargo, el fondo es amarillo debido a la fermentación de la glucosa por la vía metabólica Embed-Meyerhof-Parnas que da productos finales ácidos, esta reacción acida se mantienen en el fondo debido a la baja concentración de O2.



Fermentación Lactosa, Sacarosa: la sacarosa y lactosa se degradan aerobicamente, lo que produce un medio acido (amarillo) en el pico, esta reacción se mantiene por la alta concentración de lactosa y sacarosa. La lactosa es degradadada a glucosa por la enzima “β- galactosidasa”. La sacarosa mediante la enzima “sacarosa sintasa o invertasa” da lugar a la glucosa.



Ausencia de fermentación: los microorganismo incapaces de fermentar la glucosa, lactosa ni sacarosa, degradan aerobia y anaeróbicamente la peptona lo que alcaliniza el medio.



Formación de H2S: el tiosulfato de sodio es el sustrato que en medio acido forma H 2S, el cual se combina con los iones férricos (Fe+3) y da lugar al sulfuro de hierro (negro).



Formación de gas: Se debe a la degradación aerobia y anaerobia de la glucosa por vía metabólica Embed-Meyerhof-Parnas dando lugar al acido piruvico, el cual por el ciclo de Krebs va a rendir C02. d.

Reacciones

Fermentación de Glucosa Pico Aerobico

Peptonas

NH3 (Alcalino)

Fondo Glucosa

E-M-P / Aerobio

Ac. Orgánicos (Acido)

Fermentación de Lactosa, sacarosa y glucosa Pico Lactosa

Β-galactosidasa / aerobia

Acidos

Sacarosa

Sacarosa invertasa /Aerobico

Acidos

Glucosa

E-M-P Aerobico

Fondo Ac. Orgánicos (Acido)

Ausencia Fermentación Pico/fondo Peptona

NH3

Aerobio/anaerobio

Formación H2S Tiosulfato de sodio

e. 

Medio Acido

H2S + Fe+3

Sulfuro Ferroso (Precipitado)

Lectura

Pico Alcalino (rojo) /Fondo Acido (amarillo)

GLU (+), LAC (-), SAC (-)

   

Pico Acido (amarillo) / Fondo Acido (amarillo)  GLU (+), LAC (+), SAC (+) Pico Alcalino (rojo) / Fondo Alcalino (rojo)  GLU (-), LAC (-), SAC (-) Ennegrecimiento  H2S (+) Burbuja  GAS (+)

2.

LIA ( AGAR CON LISINA Y HIERRO) a.

Objetivo

Determinar la capacidad enzimática de un microorganismo de descarboxilizar/desaminar la lisina y la capacidad de producir H2S. b.

Indicador

Purpura de Bromocresol   

Acido: Amarillo Alcalino: Purpura Medio sin sembrar: purpura c.

Fundamento

En este medio, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo de la bacteria. La glucosa es el único hidrato de carbono fermentable. La lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de la enzima descarboxilasa o desaminasa. El tiosulfato es el sustrato para la producción de H2S y el citrato de hierro y amonio es el revelador. La descarboxilacion de la lisina tiene lugar en medio acido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada acidificando el medio; el aminoácido lisina es descarboxilado por la acción de la enzima “lisina descarboxilasa” para formar una diamina denominada Cadaverina y CO2, que alcaliniza el medio (purpura). En cambio la desaminacion de la lisina produce un acido –ceto-carbonico, el cual con la sal de hierro y bajo la influencia del oxigeno forma un color rojo en la superficie. Para la formación de H2S, el tiosulfato de sodio en medio acido produce H2S, el cual se combina con los iones férricos (Fe+3) del citrato de hierro y amonio para producir u n precipitado negro de sulfuro de hierro. Los microorganismo que no producen “lisina descarboxilasa”, pero que son fermentadores de la glucosa producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hrs. de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de peptonas, y el fondo amarillo. d.

Reacciones

Descarboxilacion 1.

2. Lisina

Glucosa

E-M-P

Lisina Descarboxilasa / H+

Medio Acido

Cadaverina (Alcalino)

Desaminacion 1.

Glucosa

E-M-P

Lisina Desaminasa / H+

2. Lisina

Medio Acido

Acido ceto-carbonico

Producción H2S Tiosulfato de sodio

H+

H2S + Fe+3

Sulfuro Ferroso (Precipitado negro)

 

e. Lectura Descarboxilacion lisina o Positivo  Pico Alcalino (purpura) / Fondo Alcalino (purpura) o Negativo  Pico Alcalino (purpura) / Fondo Acido (Amarillo) Desaminacion lisina  Pico Rojizo / Fondo Amarillo Producción H2S  Ennegrecimiento

3.

CITRATO



a.

Objetivo

Determinar si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono y energía, como alcalinidad resultante. b.

Indicador

Azul de Bromotimol   

Acido: amarillo (no observado) Alcalino: Azul de Prusia oscuro Medio no Inoculado: verde c. Fundamento

En el medio, el fosfato de amonio es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono/ el magnesio es el co-factor enzimático. El metabolismo del citrato se realiza en presencia de la enzima “citrasa o citrato permeasa” a través de la vía metabólica del acido tricarboxilico, la citrasa para actuar necesita un catión divalente (Mg 2+). El desdoblamiento del citrato da lugar, progresivamente, oxalacetato y piruvato. El piruvato en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos carbónicos que al ser utilizados como fuente de carbono producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El microorganismo que puede utilizar el citrato como única fuente de carbono, también utiliza las sales de amonio como única fuente de nitrógeno. El fosfato de amonio es degradado a amoniaco lo que alcaliniza más el medio al producir hidróxido de amonio.

d.

Reacciones

1. Citrasa /Mg+2

Citrato

Oxacelato

OH-

Piruvato

Ac. Carbonico (energia) Acetato + format (Alcalino)

Ac. Carbonicos 2.

  4.

Piruvato + CO2

Fosfato de amonio

NH3+

NH4OH (Aumenta alcalinidad)

e. Lectura Positivo  Crecimiento y azul Negativo  El medio permanece verde UREA a.

Objetivo

Determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar la urea por la acción de la enzima ureasa. b.

Indicador

Rojo Fenol   

Acido: Amarillo Alcalino: Rojo Medio sin siembra: Naranja-rojizo c.

Fundamento

En este medio, el extracto de levadura es la única fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y aporta los nutrientes especiales para el desarrollo bacteriano, las sales de fosfato constituyen el sistema buffer y la urea es el sustrato de la enzima ureasa. El sustrato urea es una diamida del acido carbónico. Aquellas bacterias que poseen la enzima “ureasa” pueden utilizar el nitrógeno proveniente de la urea, la hidrolizan liberando dos moléculas de amoniaco y CO 2. Estos productos alcalinizan el medio. d.

Reacciones Urea + 2 H2O

 

e. Lectura Positivo  Rosado Negativo  Amarillo

Ureasa

CO2 + 2 NH3

5.

SIM a.

Objetivo

En el agar SIM, se determina la capacidad de un microorganismo de moverse, producir indol y H 2S. b.

Revelador

Reactivo de Kovacs (para indol) c.

Fundamento

El triptófano es un aminoácido que puede ser hidrolizado por las bacterias que poseen un sistema de enzimas denominada “Triptofanasa” para formar indol, acido piruvico y amoniaco. El indol producido se combina con el p-dimetilamina-benzaldehido del reactivo de Kovacs para originar un compuesto de color rojo. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de H2S, el cual se combina con los iones ferricos (Fe+3) y da lugar a un precipitado negro de sulfuro ferroso. d.

Reacciones Triptofanasa

Triptofano

Indol + Acido Piruvico + NH3

Indol + P- dimetilamina benzaldehido

Compuesto Color Rojo

Formación H2 S Tiosulfato de sodio

     

H+

H2S + Fe+3

H+

Sulfuro Ferroso (Precipitado Negro)

e. Lectura Movilidad  Turbidez más allá de la siembra. Inmovilidad  Crecimiento solo en la línea de siembra H2S (+)  Ennegrecimiento H2S (-)  Sin cambio de color Indol (+)  Anillo Rojo (al agregar Reactivo Kovacs) Indol (-)  Sin anillo (al agregar Reactivo Kovacs)