PRUEBAS BIOQUIMICAS

PRUEBAS BIOQUIMICAS Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cual

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PRUEBAS BIOQUIMICAS Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes en un determinado cultivo. Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una vía metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no. Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de múltiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio. Entre las pruebas bioquímicas de mayor relevancia encontramos: Prueba de la Oxidasa En microbiología la prueba de la oxidasa se utiliza como una característica fenotípica en la identificación de cepas bacterianas pues determina si la bacteria produce citocromo oxidasa y por lo tanto utiliza oxígeno en la cadena de transporte de electrones. El objetivo de la prueba “Oxidasa” es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa. Esta se detecta utilizando el tetraparafenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida cambia a color púrpura.

 

Identificar todas las especies de Neisseria (+) Diferenciar Pseudomonas de los miembros las enterobacterias.

oxidasa

negativos

de

Prueba Catalasa La catalasa es una enzima perteneciente a la categoría de las oxidorreductasas que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno (H202) en oxígeno y agua; El peróxido de hidrógeno es un residuo

Pruebas bioquímicas para bacterias. MICROBIOLOGIA. Esp. Aura M. Muñoz

La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para

del metabolismo celular de muchos organismos vivos y tiene entre otras una función protectora contra microorganismos patógenos, principalmente anaerobios, pero dada su toxicidad debe transformarse rápidamente en compuestos menos peligrosos. Esta función la efectúa esta enzima que cataliza su descomposición en agua y oxígeno. La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxígeno.

Prueba Coagulasa

La coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se llama estafilotrombina, y permite que la enzima proteasa convierta el fibrinógeno en fibrina. Esto hace que se coagule la sangre. La prueba de la coagulasa se usa para diferenciar el Staphylococcus aureus del coagulase-negative staphylococci. S.aureus produce 2 formas de coagualasa (por ejemplo, coagulasa ligada y coagulasa libre). La coagulasa ligada se puede detectar mediante la realización de una prueba de portaobjetos y la coagulasa libre con una prueba de coagulasa de tubo. Prueba del portaobjetos se hace conjuntamente con un control negativo para descartar auto aglutinación. Se ponen 2 gotas de solución salina en el portaobjetos microscópico rotulado con un número de muestra, Test (T) y control (C). Las 2 gotas son emulsionadas con la prueba de organismo mediante el uso de un palo de madera. Se pone una gota de plasma (plasma de conejo con anticoagulante EDTA), en la gota de solución salina inoculada correspondiente a la prueba y se mezcla bien con un una varilla de madera. Agitar el portaobjeto con cuidado unos 10 segundos. 

Si es positivo: Se podrá observar aglutinación macroscopica en el plasma en los 10 segundos mientras que no se observara aglutinamiento en la gota de solución salina.

Pruebas bioquímicas para bacterias. MICROBIOLOGIA. Esp. Aura M. Muñoz

La coagulasa es una proteína producida por varios microorganismos que permite la conversión del fibrinógeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distingir entre diferentes tipos de Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo indica que la muestra contiene S. aureus.



Si es negativo: No se observara aglutinamiento.

NOTA: Si la prueba de la coagulasa de portaobjetos fuera negativa, deberìa hacerse una prueba de tubo como confirmación. El aglutinamiento en las dos gotas es un indicativo de auto aglutinación y por lo tanto debemos descartar la prueba de tubo.

Prueba del tubo de ensayo: se utiliza plasma que ha sido incoculado con una colonia de staphylococcal; Luego el tubo se incuba a 37 grados Celsius en 1½ horas. Si es negativo entonces continuamos la incubación por unas 18 horas.



Si sale positivo (por ejemplo, la colonia problema es S. aureus), el suero coagulará, dando como resultado un coágulo (a veces el coágulo esta tan desarrollado que el líquido se solidifica completamente). Si sale negativo, el plasma permanece líquido.

Prueba IMVIC El IMVIC se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de metilo, VogesProskauer y Citrato. Su finalidad es identificar un organismo del grupo de los coliformes. La presencia de estos indica contaminacion fecal. La prueba del indol: es una prueba bioquímica realizada en especies bacterianas para determinar la habilidad del organismo de romper el indol del aminoácido triptófano. Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante el enzima triptofanasa. Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptófano). Para la posterior detección del indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede preparar con los siguientes ingredientes:

Pruebas bioquímicas para bacterias. MICROBIOLOGIA. Esp. Aura M. Muñoz



  

Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alc.butílico)........150ml p-dimetilamino-benzaldehído..........................................................10g HCl (concentrado).........................................................................50ml

Se disuelve primero el aldehído en el alcohol y después se agrega lentamente a esta mezcla el ácido. Para el control de calidad del reactivo se pueden utilizar cultivos conocidos. Las más convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas las especies de Klebsiella (indol-).

Rojo de Metilo: es un indicador de pH. Actúa entre pH 4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar la formación de ácidos orgánicos que se producen durante la fermentación de un carbohidrato. El microorganismo en estudio se cultiva en un caldo de cultivo con algún carbohidrato fermentable, el más común es la glucosa aunque se pueden utilizar otros carbohidratos como lactosa, sacarosa, manitol, etc, adicionado con el rojo de metilo como indicador de pH. Una reacción positiva, es decir, el viraje del medio a un color rojo, indica que el microorganismo realiza la fermentación de la glucosa por la vía ácido-mixta y el pH del medio se torna hasta 4.2 por la gran cantidad de ácidos orgánico producidos. Una prueba negativa no cambia el color del medio (color amarillo)

Pruebas bioquímicas para bacterias. MICROBIOLOGIA. Esp. Aura M. Muñoz

Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio 5 gotas del reactivo de Kovacs, se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba será considerada positiva. Si esto ocurre después de 24 horas, la prueba se considera completa, pero si es negativo deberá incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba. Por ello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo incubado sino en una porción de unos 2ml que se retira de él asépticamente.

Citrato (C): Sirve para determinar si un microorganismo puede crecer utilizando citrato como única fuente de carbono debido a la síntesis de la enzima citrato permeasa la cual permite la introducción del citrato al interior de la célula, una vez dentro, el citrato es incorporado al ciclo de los ácidos tricarboxilicos o ciclo de Krebs. Se hace crecer al microorganismo en estudio en caldo citrato. Un resultado positivo es cuando se observa turbidez en el tubo, debido al crecimiento bacteriano. Un resultado negativo es cuando no se observa crecimiento. Actualmente el medio más utilizado es el Agar Citrato de Simmons un medio sólido en tubo con pico de flauta el cual posee un indicador de pH (azul de bromotimol) si el microorganismo es capaz de crecer, producirá ácidos orgánicos provenientes de la utilización del citrato, el medio se alcaliniza y el indicador vira a color azul, esto será un resultado positivo, el medio sin inocular es de color verde, de esta manera un resultado negativo no habrá crecimiento y el color seguirá siendo verde.

Pruebas bioquímicas para bacterias. MICROBIOLOGIA. Esp. Aura M. Muñoz

Voges-Proskauer (VI): Algunos microorganismos producen acetoína o acetil metil carbinol por descarboxilación de dos moléculas de ácido pirúvico (producto final de la glucólisis). La acetoína es un producto intermedio de la fermentación, la cual en un medio fuertemente alcalino (NaOH o KOH) y en presencia de Oxígeno se oxida a diacetilo. El diacetilo reacciona con compuestos que contengan núcleos de guanidina, como la arginina, presente en el medio (peptona por ejemplo), y da un compuesto color rojo-rosadovioláceo. Esta prueba caracteriza a ciertas especies de las Enterobacteriaceae, e indicará que la glucosa es fermentada por la vía butanodiólica.

Prueba Agar TSI Esta prueba se recomienda para la identificación de patógenos entéricos gram negativos. Se emplea para detectar la fermentación de lactosa, sacarosa y glucosa, con formación de ácido y gas, y también para detectar producción de ácido sulfhídrico. En este medio la concentración de glucosa es la décima parte de la concentración de la lactosa y la sacarosa, lo cual permite determinar cuándo éste es el único glúcido fermentado. La pequeña cantidad de ácido producido por la fermentación de la glucosa es rápidamente oxidado en el bisel donde hay abundancia de oxígeno, quedando el color rojo correspondiente a un medio alcalino; por el contrario, en el taco donde la tensión de oxígeno es baja, la reacción ácida se mantiene. Para que las reacciones antes indicadas ocurran, el medio tiene que estar en un tubo que permita un fácil acceso del aire, por lo que debe estar provisto de un tapón de algodón flojo. Procedimiento Realice una punción en el taco y una estría en el bisel. Incube a 35°C. Observar a las 18-24 horas, ni menos ni más. Resultados Taco ácido (amarillo): Glucosa fermentada. Bisel ácido (amarillo): Lactosa y/o sacarosa fermentada. Taco ácido (amarillo): Glucosa fermentada.

Taco alcalino (rojo) y bisel alcalino (rojo): Ninguno de los tres glúcidos es fermentado La aparición de burbujas en el taco indica que la fermentación se ha efectuado con producción de gas y un ennegrecimiento en el medio indica la producción de ácido sulfhídrico

A. Glucosa, lactosa y/o sacarosa fermentada

Pruebas bioquímicas para bacterias. MICROBIOLOGIA. Esp. Aura M. Muñoz

Bisel alcalino (rojo): Lactosa y/o sacarosa no fermentada.

B. Glucosa fermentada con producción de ácido sulfídrico y gas C. Glucosa fermentada con producción de ácido sulfídrico D .Ninguno de los tres azúcares es fermentado.

Prueba de ureasa Medio utilizado para la identificación de microorganismos, en base a la actividad ureásica. Es particularmente útil para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae. Fundamento Algunas bacterias son capaces de emplear la urea como única fuente de nitrógeno. En tal caso la bacteria ha de poseer un enzima, la ureasa, capaz de atacar la urea. Al descomponerse se libera amoniaco que alcaliniza el medio.

Sistemas de Identificacion multipruebas (API)

La batería de pruebas API es un sistema de identificación rápida para bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram -. Básicamente consta de 21 tests bioquímicos estandarizados y miniaturizados, y una base de datos. Este sistema presenta las ventajas de ser rápido, eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API contiene 20 microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioquímica distinta. La prueba número 21, la oxidasa, se hace de forma independiente a la tira.

Pruebas bioquímicas para bacterias. MICROBIOLOGIA. Esp. Aura M. Muñoz

El medio de cultivo posee un indicador de pH que vira a un color rosa intenso cuando dicho pH se hace básico; de esta forma podemos detectar la producción de amoniaco y, en última instancia, la presencia del enzima ureasa. El medio de cultivo a emplear es el agar urea.

Prueba ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE

Reacción / Enzimas Beta-galactosidasa Arginina deshidrolasa Lisina descarboxilasa Ornitina descarboxilasa Utilización del citrato Producción de H 2 S Ureasa

TDA IND VP

Triptófano desaminasa Producción de indol Producción de acetoína (Voges-Proskauer)

GEL GLU

Gelatinasa Fermentación/oxidación de glucosa

MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX

Fermentación/oxidación de manitol Fermentación/oxidación de inositol Fermentación/oxidación de sorbitol Fermentación/oxidación de ramnosa Fermentación/oxidación de sacarosa Fermentación/oxidación de melobiosa Fermentación/oxidación de amigdalina Fermentación/oxidación de arabinosa Citocromo oxidasa

Procedimiento A patir de una colonia bien aislada del microorganismo, hacer una suspensión en 5 mL de solución salina (1% de NaCl) o 5 mL de agua estéril. Llenar con la suspensión de bacterias los tubos, no la cúpula (cada pocillo tiene un tubo y una cúpula, parte aerobia), de todos los pocillos. Llenar la cúpula de los pocillos CIT , VP, GEL con la suspensión de bacterias. Cubrir con parafina las cúpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE, H2S para obtener anaerobiosis. Poner la tira en su propia cámara húmeda de incubación. Previamente poner agua en los alvéolos de la cámara para proporcionar una atmósfera húmeda durante la incubación.

Pruebas bioquímicas para bacterias. MICROBIOLOGIA. Esp. Aura M. Muñoz

Las pruebas de que consta la galeria son las siguientes:

Incubar a 37 °C durante 18-24 h. Tras la incubación se anotan los resultados inmediatos, es decir, los que no requieren ser revelados. Determinadas pruebas requieren ser reveladas, para el revelado se tienen que tener en cuenta dos criterios: TDA: Añadir una gota de FeCl3 10 %. VP: Añadir una gota del reactivo 1 (KOH al 40%) y una gota del reactivo 2 (C2 H5 OH). IND: Añadir una cinamaldehido.

gota

de

reactivo

de

Kovacs

o

de

Dimetilamino-

Oxidasa: Añadir una gota del reactivo (tetrafenilendiamina) recién preparado.

Interpretacion

Prueba ONPG ADH LDC ODC

Reacción / Enzimas Beta-galactosidasa Arginina deshidrolasa Lisina descarboxilasa Ornitina descarboxilasa

Negativo sin color amarillo amarillo amarillo

CIT

Utilización del citrato

verde

H2S

Producción de H 2 S

URE TDA

Ureasa Triptófano desaminasa

IND

Producción de indol

VP

Producción de acetoína (Vogessin color Proskauer)

rosa-rojo

GEL

Gelatinasa

sin difusión

difusión pigmento

azul o verde

amarillo

azul o verde

amarillo

GLU MAN

Fermentación/oxidación glucosa Fermentación/oxidación manitol

Positivo amarillo rojo o naranja rojo o naranja rojo o naranja azul oscuro turquesa

o

sin precipitado precipitado negro negro amarillo rojo o naranja amarillo marrón-rojo color rosa o anillo amarillo rosa-rojo

de de

de

Pruebas bioquímicas para bacterias. MICROBIOLOGIA. Esp. Aura M. Muñoz

La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparación de los colores de cada pocillo con los de las tablas de lectura, y anotando el resultado como positivo o negativo.

INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX

Fermentación/oxidación inositol Fermentación/oxidación sorbitol Fermentación/oxidación ramnosa

de

Fermentación/oxidación sacarosa

de

Fermentación/oxidación melobiosa Fermentación/oxidación amigdalina Fermentación/oxidación arabinosa

de

de de

de de

azul o verde

amarillo

azul o verde

amarillo

azul o verde

amarillo

azul o verde

amarillo

azul o verde

amarillo

azul o verde

amarillo

azul o verde

amarillo

Citocromo oxidasa

Pruebas bioquímicas para bacterias. MICROBIOLOGIA. Esp. Aura M. Muñoz

Tira API