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UNIDAD 2. PRUEBAS BIOQUÍMICAS

CARRILLO LOPEZ TANIA MONSERRAT

CARRILLO LÓPEZ TANIA MONSERRAT

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UNIDAD 2. PRUEBAS BIOQUÍMICAS

PRUEBA BIOQUÍMICA MALONATO

PRINCIPIO

OBJETIVO

BIOQUÍMICA

Esta prueba determina la capacidad que tiene una bacteria de desaminar la fenilalanina y de utilizar el Malonato como única fuente de carbono.

Que la bacteria utilice el malonato de sodio como única fuente de carbono con la consiguiente alcalinidad.

El Malonato es inhibidor enzimático que inhibe la acción catalítica de la succinato deshidrogenasa El ácido malonico inactiva la enzima por un proceso denominado inhibición competitiva. El ácido malonico es estructuralment e análogo al acido succínico y compiten por el lugar de la enzima.

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MEDIO DE CULTIVO/REACTIVOS EMPLEADOS

INTERPRETACIÓ N DE RESULTADOS

MEDIO: Caldo Malonato; (de Ewing Modificado) es para diferenciación de coliformes y otros microorganismos en especial Enterobacter y Escheric hia coli,basándose en el consumo de malonato.

PRUEBA POSITIVA: el color azul claro a azul de Prusia intenso en todo el medio es debido a la utilización del malonato como única fuente de carbono PRUEBA NEGATIVA: el medio permanece verde porque no se utilizó el malonato o cambia a amarillo porque hubo fermentación de glucosa.

REACTIVOS: Extracto de levadura Sulfato de amonio Fosfato de amonio Fostafo monopotásico Cloruro de sodio Malato de sodio Glucosa Azul de bromotimol Ph final 6.7.

PRECAUCIONE S/ INTERFERENCI AS Sembrar solo cepas en tubos de caldo de malonato por asa suspendida e incubar los tubos a 37 °C durante 48 horas.

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HIDROLISIS DE ALMIDON

LIA

Tiene como principio la producción de exoenzimas alpha-amilasa

Hay bacterias que utilizan los alimentos macromoleculares y los hidrolicen para su aprovechamiento usando enzimas extracelulares como la amilasa esta prueba tiene como propósito el aislado de tales microorganismos.

El almidón es producido por plantas superiores, está compuesto de amilasa y amilopectina. Diversas enzimas amiloliticas hidrolizan almidón y sus productos.

Esta prueba se hace para determinar si el microorganism o es capaz de descarboxilar el amino acido lisina por medio de la enzima la lisina descarboxilasa, y a la vez producirH2S,po r medio de la enzima

medio de cultivo ampliamente utilizado para la diferenciación de bacilos Gram negativos entéricos, especialmente miembros del género Salmonella con capacidad de fermentación de lactosa, sobre la base de la producción de H2S

Las peptonas y el extracto de levadura aportan aminoácidos y nutrientes esenciales, la dextrosa constituye una fuente de energía. El citrato de amonio ferrico y el tiosulfato de sodio actúan como

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MEDIO: El medio de agar-almidón es utilizado en la selección de microorganismos productores de amilasas y también en los cultivos de hongos. REACTIVOS: Agar de almidón Sustrato: almidón (polímero de glucosa) Enzima: Amilasa Glucosa Lugol El lugol con el almidón forman un complejo café- purpura que desaparece cuando el almidón ha sido degradado. MEDIO: Características del medio Medio preparado: color violeta. Almacenamiento Medio deshidratado: a 10-35 ºC. Medio preparado: a 2-8 ºC. REACTIVOS Extracto de levadura 3.00 Digesto pancreático de gelatina: 5.00 Dextrosa 1.00 L-lisina HCL 10.00 Citrato de Amonio Ferrico: 0.50 Tiosulfato de sodio: 0.04 Púrpura de

POSITIVO: Se muestra un área clara alrededor del cultivo Negativo: color negro alrededor del cultivo

Esta prueba no es una reacción química ya que no se producen sustancias nuevas. Es importante usar reactivo para identificar el almidón se una solución de lugol, con yodo y yoduro de potasio

1.- Producción de H2S Resultado positivo: el desarrollo microbiano produce coloración negra en el medio de cultivo en todo el tubo. Resultado negativo: ausencia de coloración

El Agar LisinaHierro (L.I.A.) es un medio de cultivo diferencial, por lo que su uso está recomendado para la taxonomia bacteriana basada en pruebas bioquímicas. No se

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tiosulfato reductasa.

y la actividad de la enzima Lisina decarboxilasa..

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marcadores de la producción de H2S, en este caso se observa el desarrollo de sulfuro de hierro negro en el tubo.. El agar actúa como agente gelificante Los cambios en el pH se verifican gracias al contenido de púrpura de bromocresol: la producción de ácido se ve como cambio del color a amarillo con valores de pH inferiores a 5.2, en tanto que la alcalinización como cambio del indicador hacia el púrpura con valores de pH sobre 6.8. La actividad de la lisina

Bromocresol: 0.02 Agar Bacteriológico 13.50 pH final medio de cultivo listo para el uso: 6.5 +/- 0.2

negra. 2.- Lisina decarboxilasa: Resultado positivo: se verifica como alcalinización (K) del medio de cultivo con un viraje hacia el púrpura en todo el tubo, o como medio de cultivo neutro. Resultado negativo: se observa acidificación (A) con viraje hacia el amarillo en la columna del tubo, y alcalinización (color púrpura) en la zona inclinada. 3.Lisina deaminasa: Resultado positivo: producción de color rojo granate (R) en la

recomienda su uso para aislamiento general o selectivo, ni para manutención de cepas. Los resultados obtenidos deben complementars e con otras pruebas bioquímicas para obtener la identificación de especie bacteriana.

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LICUEFACCIO N DE LA GELATINA

La prueba de licuefacción de gelatina se utiliza como medio de cultivo gelatina nutritiva, en esta prueba se pretende determinar la capacidad de un microorganism

Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo proteolítico (gelatinasas) que lisan la gelatina

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descarboxilasa se observa como un viraje hacia el color púrpura en todo el medio de cultivo, o bien como medio de cultivo sin cambio (neutro) en la columna de agar, en tanto que la ausencia de la enzima produce un viraje hacia el color amarillo en la columna y neutro en la zona inclinada. La gelatina es una proteína que tiene la capacidad de gelificar, cuando es hidrolizada por la gelatinasa en los aminoácidos que la componen pierde su característica de gelificar. Se

superficie inclinada. Resultado negativo: ausencia de color rojo granate.

MEDIO: Gelatina nutritiva sólida REACTIVOS Gelatina Nutritiva Sustrato: Gelatina (proteína). Enzima: Gelatinasa (Proteasa, exoenzima). Producto: Aminoácidos. Revelador: No requiere o puede emplearse el carbón activado en polvo. Agua destilada Peptonas

POSITIVO: a) Medio licuado b) Tubo control: medio sólido NEGATIVO: a) El medio se mantiene sólido , volver a incubar durante un periodo adicional b) Tubo control: medio sólido

Observar si hay crecimiento (turbiedad) y licuefacción. Al término de cada periodo de 24 h, colocar los tubos en un baño de hielo durante un periodo de 2 horas, para

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o de producir enzimas de tipo proteolíticas (gelatinasas) que licuan/hidroliza n la gelatina o muestran cambios característicos debido a los productos de degradación.

PROTOLOLIS DE LECHE

Se utiliza para la demostración de la hidrolisis de la caseína por microrganismo aerobios. La caseína proteasa es excretada al medio para la degradación de proteínas es la

pueden emplear varios medios que permiten la visualización macroscópica como la gelatina adherida a carbón activado

Permite diferenciar organismos sobre la base de sus múltiples reacciones metabólicas en un medio lácteo como la fermentación de la lactosa, caseolisis y la coagulación de la caseína

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Las proteasas son excretadas al medio para la degradación de proteínas, la caseína es la proteína de la leche que le confiere el color blanco, cuando la caseína es hidrolizada desaparece el

determinar si se ha producido o no la digestión de la gelatina (licuefacción) Controlar los tubos diariamente, hasta 2 semanas a menos que la licuefacción suceda antes de tiempo.

REACTIVOS Agar Leche Descremada Sustrato: Caseína (proteína). Enzima: Casinas (Proteasa, exoenzima). Producto: Aminoácidos. Revelador: No requiere.

POSITIVA: Presenta halos transparentes alrededor de las colonias NEGATIVO: no presenta color ni cambios de color o pH.

Si no existe proteinasas no se presenta crecimiento bacteriano Ayuda a la diferenciación de especies sobre todo del genero Clostridium

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HEMOLISIS AGAR SANGRE

que le proporciona el color blanco a la leche y cuando se hidroliza desaparece el color blanco alrededor del crecimiento bacteriano. Medio de cultivo general, diferencial y de enriquecimient o con la adición de sangre, las bacterias que producen hemolisinas presentan un halo transparente alrededor de las colonias a consecuencia de la lisis de los hematíes específica para Staphylococcus.

color blanco alrededor del crecimiento microbiano

Identificar a los microorganismos hemolíticos que liberan enzimas (hemolisinas) al medio que destruyen los glóbulos rojos apareciendo halos de hemólisis.

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Se siembra por agotamiento en estría en placas de agar sangre y se incuba. Hemólisis alfa. Hemólisis beta. Hemólisis gamma. La hemólisis alfa se refiere a una lisis parcial de eritrocitos que produce una coloración verde que se observa alrededor de las colonias (debido a la liberación de un producto de degradación de

MEDIOS: Combinación de un agar base (agar nutritivo) con el agregado de 5 % de sangre ovina, también puede usarse sangre humana, para cultivos en una placa de Agar. REACTIVOS: Base de Agar sangre generalmente suplementada con sangre de carnero, conejo o caballo al 5-10% Infusión de musculo de corazón Peptona de caseína Levaduras Cloruro de sodio Agar solidificante .

Observado los halos hemolíticos alrededor de las colonias se determina el tipo de hemolisis que posee: Hemolisis de streptococcus spp. Halos verdosos en hemolisis parcial Hemolisis total: halos incoloros Sin hemolisis inexistencia de halos

La reacción de hemólisis junto con otra de las características fisiológicas es suficiente para una identificación clínica presuntiva. Entre otras bacterias que pueden tener hemolisinas se incluye Streptococcus salivaris, Micrococcus luteus, Bacillus cereus, E.coli, Klebsiella

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la hemoglobina llamado biliverdina); la hemólisis beta se refiere a un halo de hemólisis completamente claro y la hemólisis gama se refiere a la ausencia de hemólisis. Los estreptococos del grupo A y B son beta hemolíticos, mientras que D es generalmente alfa o gamma.

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pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa.

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OXIDASA

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxida sa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana

Esta prueba está basada en la identificación de una enzima bacteriana llama da citocromoC oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa.

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El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidas a sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalment e, en algún microaerófilo, pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Se investiga la presencia del enzima citocromooxidasa en la bacteria en estudio.

MEDIOS: Colonias bacterianas crecidas en medio de cultivo sólidos. REACTIVOS Utilizamos tiras de papel impregnadas con el reactivo para-amino-N-dimetil-anilina, que se oxida por la citocromooxidasa. El procedimiento consiste en impregnar la zona coloreada de la tira reactiva con una masa de bacterias.

Se toma con un palillo grueso de madera una muestra bacteriana a partir de una colonia aislada proveniente de un cultivo de 24h. La muestra se pone en contacto con la tira o disco impregnado. Se debe observar una coloración morada en un lapso no mayor a 30segundos para que sea POSITIVO, de lo contrario el resultado es NEGATIVO. POSITIVA: coloración morada NEGATIVA: sin coloración.

No considerar un resultado positivo después de 30 seg ya que el oxígeno molecular del ambiente oxida al reactivo. No usar asa bacteriológica metálica ya que la mayoría de estas con tienen hierro y este es capaz de oxidar el reactivo dando nos falsos positivos. No realizar la prueba de bacterias que provienen de colonias obtenidas de medios de cultivos que contienen glucosa u otro carbohidrato ya que la

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fermentación del carbohidrato inhibe a la oxidasa dando como resultado falsos negativos en la prueba. REDUCCION DE LECHE CON AZUL DE METILENO

Permite diferenciar organismos por su capacidad de reducir el azul de metileno en un medio con leche.

Esta prueba se utiliza para diferenciar los enterococos de otros miembros del género streptococcus .

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El sistema citocromo oxidasa activa la oxidación del citrocromo reducido por el oxígeno molecular que a su ve actúa como un aceptor de electrones en el periodo terminal del sistema de transferencia de electrones. Cuando existen condiciones aerobias el oxígeno es el aceptor final de hidrógeno

MEDIOS: Medio liquido en tubos de ensayo. REACTIVOS: Medio de cultivo con azul de metileno Leche descremada deshidratada Agua destilada Indicador azul de metileno.

POSITIVA: color incoloro porque presenta reducción NEGATIVA: presenta color azul no hay reducción

Otros microorganism os además de los enterococos pueden reducir el azul de metileno se debe diferenciar muy bien el género antes de utilizar esta prueba El tiempo requerido para la reducción de azul de metileno se relaciona de modo directo con la cantidad de bacterias

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produciendo agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana.

SOLUBILIDAD EN BILIS

Probar la capacidad de las células bacterianas de sufrir un proceso de lisis en presencia de sales biliares en un tiempo y una temperatura especifica.

Utilizando específicamente para diferenciar entre Streptococucus pneumoniae soluble en bilis y otras especies de Streotococcus insolubles en billis Puede ayudar en la diferenciación de especies de Haemophilus influenzae y Haemophilus aegytius.

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Sales biliares son sales de sodios de los acidos biliares que en su totalidad son sintetizados a partir de un compuesto común, el colesterol Las sales biliares que carecen de grupos hidroxilo son inactivas, mientras que las sales del ácido desoxicólico son activas en acidos trihidroxilados.

MEDIOS: Crecen en medios sólidos suplementados con 5-10 % de sangre de carnero. REACTIVOS Desoxicoloto de sodio o taurocolato de sodio 10% Sales biliares comerciales neutras Indicador de PH rojo fenol Hidroxido de sodio 10 N 40% NaCl

SOLUBLE EN BILIS: solución que se aclara en un tiempo de 3 horas INSOLUBLE EN BILIS : la solución permanece turbia

presentes cuanto más denso más inóculo del microorganism os positivos más corto es el tiempo de reducción Nunca se utilizan las palabras positivo o negativo para esta prueba Esta prueba se usa para diferenciar especies Streptococcus de Strotococcus alphahemoliticos Si se utiliza en cultivo de caldo con buffer para la prueba de solubilidad en bilis, evitar un cultivo denso

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PRUEBA DE NIACINA

La prueba de niacina detecta niacina (ácido nicotínico) en extractos acuosos de un cultivo.

Esta prueba es básica para hacer la diferenciación de M. tuberculosis y M. bovis de otras micobacterias así como su diagnóstico y prevención

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La vía de degradación del dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD +) en M. tuberculosis tiene un bloqueo que la vía de barrido produce un exceso de niacina que no puede ser procesado por el organismo. Debido a esta abundancia, M. tuberculosis junto con Mycobacterium canetti y tipos variados de Mycobacterium africanum liberan el exceso de niacina en su ambiente exterior, en este caso, la placa de agar u otro medio. La niacina es

MEDIOS: Cultivo de micobacterias en medio sólido de LöwensteinJensen REACTIVOS La tira de prueba de niacina se compone típicamente de tiocianato de potasio, cloramina-T, ácido cítrico y ácido 4-aminosalicílico. En presencia de ácido cítrico, la cloramina-T y el tiocianato de potasio reaccionarán para formar cloruro de cianógeno. Este producto químico romperá el anillo de piridina de niacina para producir aldehído ycarboxi glutacónico y se unirá a una amina aromática para formar un color amarillo.

POSITIVA: Si se detectan cantidades excesivas de niacina, el líquido dentro del tubo se pondrá amarillo, una prueba positiva. NEGATIVA: Si el líquido en el tubo es transparente, no hay cantidades excesivas de niacina y la prueba es negativa.

La prueba de niacina normalmente solo se realiza en colonias granuladas de color tostado, de crecimiento lento, ya que estas son las características morfológicas de M. tuberculosis en una placa de agar. Todas las pruebas de niacina deben realizarse en un gabinete de bioseguridad con una bata completa, respirador, guantes y un laboratorio sellado para garantizar la seguridad del técnico de laboratorio que

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MIO

Es un medio de cultivo altamente nutritivo por la presencia de extracto de levadura, peptona y tripteina.

Medio utilizado para la identificación de miembros de la familia Enterobacteriacea e en base a la movilidad, producción de indol y actividad enzimática ornitina descarboxilasa.

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soluble en agua, por lo que los medios de cultivo pueden analizarse para detectar la presencia de niacina para determinar si un aislado de Mycobacterium es una de las tres especies mencionadas. La Tripteína aporta gran cantidad de triptófano, sustrato de la enzima triptofanasa a partir de la cual se forma indol que puede ser revelado con el reactivo de Ehrlich por la formación de un compuesto color rojo. La glucosa es el hidrato de

realiza la prueba.

MEDIOS: Medio de cultivo deshidratado: color beige claro, homogeno libre deslizamiento. Medio de cultivo preparado: color purpura ligeramente opalescente. REACTIVOS Glucosa Extracto de levadura Peptona Tripteina Clorhidrato de L-Ornitina Purpura de bromocresol Agar PH final 6.5 -0.2

MOVILIDAD POSITIVA: presencia de turbidez o crecimiento más allá de la línea de siembra NEGATIVA: crecimiento solamente en la línea de siembra ORNITINA DESCARBOXILAS A: POSITIVO: color purpura NEGATIVO:

Solamente para uso de diagnóstico in vitro No utilizar el producto si existen signos de contaminación o fecha de vencimiento Considerar muestras potencialment e infecciosas y manipularlas apropiadament e siguiendo

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carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la detección de la enzima ornitina descarboxilasa el purpura de bromocresol es el indicador de pH. Medio semisólido ideal para detectar la movilidad que evidencia por el enturbiamiento del medio.

Color amarillo

normas de bioseguridad.

BIBLIOGRAFIAS ANDINAMEDICA.COM.PE. (2018) [ONLINE] Available at: http://andinamedica.com.pe/wp-content/uploads/2016/08/Medio-LIA.pdf [Accessed 4 Sep. 2018]. BACTERIOLOGIA CLINICA TAXONOMIA BASICA www.qualitat.cc. http://www.qualitat.cc/sitebuildercontent/sitebuilderfiles/Taxonomia_basica.pdf PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DE IMPORTANCIA CLÍNICA By Jean F. MacFaddin https://books.google.com.mx/books?id=FYWSzy7EjR0C&pg=PA30&lpg=PA30&dq=solubilidad+en+bilis&source=bl&ots=ROMMMeJc

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