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Ruby N. Gutiérrez 5.1

II PARCIAL LAB N°8: BACILOS GRAM (-) FERMENTADORES Y NO FERMENTADORES Tinción de Gram Enterobacterias: - Bacilos cortos gram negativos no esporulados. - Pueden o no tener motilidad. - Anaerobios facultativos o anaeróbicos - Oxidasa (-) - Pseudomona = - Glucosa (+) enterobacteria - Citrato (+) o Oxidasa (+) o Glucosa (-) o Citrato (-)

Bacilo

Gram

(-)

pero

no

MEDIOS DE CULTIVO EN PLATO - Escherichia coli - Pseudomona aeruginosa - Klebsiella pneumoniae - Salmonela sp - Shigella flexneri - Enterobacter cloacae - Proteus vulgaris

MacConkey  Fermentación - Medio selectivo por contener sales biliares y violeta cristal que inhiben el crecimiento de bacterias no entéricas. - Medio diferencial porque contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro). Las bacterias capaces de fermentar lactosa producirán un cambio en el pH del medio por liberación de productos ácidos. Como consecuencia sus colonias aparecerán de color fucsia/violeta, contrastando con la coloración amarillenta de las colonias incapaces de fermentar la lactosa.

SS

Salmonella

Medio de cultivo selectivo para Salmonella y Shigella. Compuesto x sales biliares y violeta cristal q inhiben el crecimiento de coliformes, lactosa y rojo neutro (indicador de pH). Las colonias fermentadoras de lactosa producirán ácidos y cambiará el color del medio a rosa. Como Shigella (lactosa negativa) y Salmonella no utilizan este azúcar forman colonias transparentes. El tiosulfato es la fuente de azufre para la producción de ácido sulfhídrico de las bacterias sulfato-reductoras. Este ácido reacciona con la sal de hierro y se forma sulfuro de hierro de color negro. Las colonias de Salmonella se observan transparentes con un precipitado negro (ácido sulfhídrico) en el centro.

EMB (eosin methylene blue)  Fermentación - Contiene sucrosa y lactosa. - Utiliza como inhibidor e indicador a eosina azul de metileno. - Prueba negativa: si se mantiene igual color al medio (rojo), indicativo de la no fermentación de azúcares. - Escherichia coli produce un color verde metálico característico para esta prueba positiva.

Medio con citrato de Simmons  Shigella; Enterobacter - Indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato. Contiene citrato como única fuente de carbono, fosfato de amonio como única fuente de Salmonella fosfato y azul de bromotimol como como indicador de pH. - Únicamente las bacterias capaces de metabolizar citrato podrán multiplicarse en este medio, al utilizar los fosfatos presentes liberan iones amonio (básicos) que junto con la eliminación de citrato (ácido) generará una fuerte basificación del medio que será aparente con un cambio de color del indicador de pH de verde a azul.

Prueba de urea  Detección de enzimas

Klebsiella

- Indicador de pH utilizado es el rojo fenol. - Esta prueba detecta la presencia de la enzima ureasa en el metabolismo bacteriano, la cual al hidrolizar urea forma productos amoniaco que alcalinizan el medio y se evidencia con el cambio de color del medio desde un amarillo pálido hasta un rojo fucsia. - Proteus

Prueba SIM (sulfuro indol motilidad)  motilidad (+) = turbiedad sin observación del inoculo - Se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en bacterias, que degrada el aminoácido triptófano a indol. - Al añadir el reactivo de Kovac o de Ehrlich que contiene p-dimetilaminobenzaldehído, reacciona tanto con el indol como con el triptófano produciendo compuestos de color rojizo. - Motilidad indica presencia de flagelos - Proteus = SIM +

E. coli

TSI (triple sugar iron)  Podemos evaluar fermentación, producción de gas y producción de H2S - Medio diferencial complejo (de color rojo) compuesto por 3 azúcares: 10% lactosa, 10% sucrosa y 1% dextrosa y un ligador que es en este caso el hierro. La siembra se realiza tanto en la superficie del agar (aerobiosis) como en la profundidad de éste (anaerobiosis). - Medio K (alcalino) de color rojo. Medio A (ácido) de color amarillo. - K/A: bacteria metaboliza sólo la glucosa: En la superficie la utilizará por vía respiratoria, y donde la tensión de oxígeno disminuya lo suficiente, empleará una pequeña proporción por vía fermentativa. Esto generará una pequeña cantidad de ácidos que serán neutralizados por las aminas derivadas de la decarboxilación oxidativa de las proteínas. Como resultado, el medio mantendrá su color rojo en la superf, al no haber cambiado de pH. Por el contrario, las bacterias crecidas en la profundidad emplearán

Proteus

E. coli

Control

-

Salmonella

-

Shigella

-

Pseudomona

-

desde el primer momento la glucosa x vía fermentativa, generando ácidos q no serán neutralizados, provocándose un descenso del pH y el color del medio en el fondo del tubo cambiará a amarillo. o Indicador: Rojo fenol o Shigella A/A: la bacteria fermenta dextrosa y sacarosa o lactosa (fermenta 2 azúcares): los ácidos producidos modificarán también el pH de la superficie del medio. Las aminas no son capaces de neutralizar la cantidad de ácidos producidos en esta fermentación, ya que la lactosa se encuentra en el medio a mayor concentración que la glucosa. El color del medio en la superficie cambiará a amarillo. o E. coli K/K: la bacteria es aerobia estricta (no fermentadora), el medio permanece de color rojo. Los azúcares son respirados, degradándose completamente hasta CO2, que se elimina y no modifica el pH. o Pseudomona aeruginosa A/A (g): aparición de burbujas, rotura o elevación del agar del fondo del tubo. o E. coli K/A (H2S): aparición de un precipitado de color negro en el fondo del tubo. Algunas bacterias respiradoras anoxobiónticas son capaces de emplear el tiosulfato sódio como aceptor final de electrones en la cadena transportadora. Este compuesto se reduce a ácido sulhídrico que reacciona con el hierro Fe2+ presente en el medio formando un precipitado negro de sulfuro de hierro. o Dextrosa fermentada o Salmonella

Reacción Aeróbica

A/A (g)

K/K

K/A

K/A H2S

A/A Reacción H2S Anaeróbica

Klebsiella Prueba de fermentación de azúcares -

Indicador = Rojo fenol Lactosa + o Klebsiella o Enterobacter cloacae

Medio MRVP (rojo metilo Voges-Proskauer) - La liberación de ácidos orgánicos generará un acusado descenso del pH que podrá ser detectado añadiendo al medio un indicador de pH como el rojo de metilo (rojo a pH 4.0). Escherichia coli - vía catabólica - fermentación mixta de ácidos - Si la fermentación que se ha llevado a cabo produce acetoína puede ser detectada añadiendo al medio: 1º KOH y 2ºalfa-naftol que reaccionarán con este compuesto produciendo rojo característico. - vía anabólica - Klebsiella pneumoniae

Prueba de fenilalanina  Detección de enzimas - En este medio, el aminoácido presente es la fenilalanina, empleado para determinar la presencia de la enzima fenilalanina desaminasa en bacterias. Proteus - La acción de esta enzima se evidencia por la aparición del producto resultado (ácido fenilpirúvico) que se detecta mediante adición de cloruro férrico, resultando un compuesto de coloración verde oscuro.

Prueba de oxidasa - Se basa en la capacidad del colorante tetrametil-p-fenilendiamonio de oxidarse al ceder electrones al citocromo c en su presencia, produciendo formas coloreadas (azul/morado). - Permite diferenciar el grupo Enterobacteriaceae (que carecen de citocromo c) del género Pseudomonas (que posee citocromo c). - Taxo N + agua  halo púrpura

LAB N°9 – MICROBIOLOGÍA DE AGUA Y ALIMENTOS -

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ETA: Enfermedad Transmitida por Alimentos Tipos o Microorganismos o Toxinas o Objetos Caso de ETA: 1 persona Brote de ETA: 2 ó + personas que presentan una enfermedad similar después de consumir alimentos del mismo origen , y q éstos sean el vehículo de la enfermedad Infecciones alimentarias: ETAs x ingestión de alimentos o agua contaminadas con agentes infecciosos (If  Shigella, S. aureus) Intoxicaciones alimentarias: ETAs x ingestión de toxinas (Ix  Salmonella, B. cereus) Homogenización de muestras  Stomacher Plato Petrifilm: medio de cultivo q contiene un nutriente Bilis rojo violeta (Violet Red Bile, VRB), un agente gelatinizante soluble en agua fría, un indicador de la actividad de la glucoronidasa, y un indicador de tetrazolio q facilita la enumeración de las colonias Colilert  prueba para determinar coliformes totales o fecales en líquidos + luz UV o Reactivo con una formulación a base de sales, y sustratos con nitrógeno y carbono q son específicos para los coliformes totales. Las bacterias no coliformes son inhibidas y no pueden metabolizar los nutrientes indicadores.  Durante la metabolización de estos nutrientes, se produce un color amarillo y fluorescencia, con lo cual queda confirmada la presencia de coliformes totales y de E. coli, respectivamente. o Resultados  Incoloro = (-) coliformes totales y E. coli (único indicador de contaminación fecal)  Amarillo = (+) coliformes totales  Fluorescencia = (+) E. coli (coliformes fecales) Salmonella typhimurium  período de incubación: 6 a 72 horas Shigella o Inoculo de 10 bacterias o Shigalike toxin o Período de incubación: de 5 a 6 días o Causa disentería Escherichia coli diarrea del viajero (E. coli enterotoxigénica) Clostridium botulinum = botulismo Staphylococcus aureus o Período de incubación: 1 a 6 horas o Enterotoxina termorresistente x la mala refrigeración Bacillus cereus o Toxina diarreica  Período de incubación: 10 a 12 horas o Toxina emética  Período de incubación: 1 a 6 horas

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Coliformes o Escherichia o Klebsiella o Enterobacter o Citrobacter * HACCP = Hazard Analysis and Critical Control Points o Concentra el control en los puntos críticos para la inoculidad del producto alimentario evaluado, valoriza la comunicación entre la industria y la inspección. Agua apta para consumo humano o Incolora o Inodora o Insabora o No sedimentos o Concentración de cloro = 102/ ml

LAB N°10 – INFECCIONES CAUSADAS POR MICROORGANISMOS ANAEROBIOS -

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Bacilos gram + o Olor fétido o Medio hecho de carne o Infección de origen exógeno o Esporulados  Clostridium perfringes  Clostridium botulinum (botulismo)  Clostridium difficile (colitis pseudomembranosa)  Gangrena gaseosa  Clostridium tetani (tétano) Bacilos gram – o Bacteroides o Fusobacterium Cocos gram + o Peptostrepstococos Anaerobios estrictos o Bajo ritmo de multiplicación o Carecen de citocromo oxidasa, superóxido dismutasa y catalasa o Factores predisponentes  Traumatismos  Cirugías  Mordeduras o quemaduras  Obstrucciones o Presencia de abscesos o tejidos necróticos o Difíciles de controlar o Infecciones por anaerobios  Bacteroides forsythus infecciones mixtas  Sí produce superóxido dismutasa  Peritonitis o Flora normal en boca e intestinos o Enfermedades dentales:  Caries  Periodontitis  Enfermedades periodontales necrosantes Clostridium perfringes o Enterotoxina A o Exógeno o Anaerobio poco estricto o No móvil o Espora oval subterminal o Doble hemólisis (alpha y beta hemolítico) o Suelo, agua, tracto intestinal Clostridium tetani o Produce H2S, fermenta y tiene motilidad

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o Esporas terminales o Parálisis del músculo o Tétano generalizado Clostridium botulinum o Espora subterminal o Toxinas termolábiles o A, B, E (toxinas en humanos) o Bloquea la emisión de acetilcolina  parálisis flácida (inhibe la contracción del músculo) o Neurotoxina o Botox o Diagnóstico  Clínico  Microbiológico  intoxicación alimentaria Clostridium difficile o Produce toxina responsable de la enfermedad gastrointestinal asociada a antibióticos o Produce diarrea benigna o Toxina A (enterotoxina) y B (citotoxina) o Esporas germinan en el colon o Espora oval subterminal o Móvil o Tratamiento  Drenaje quirúrgico  Clindamicina y metronidazol Cultivo o Jarra de anaerobios o Medios complejos o Putresinas y cadaverinas  aminas de Clostridium sp Resultados o Infección endógena: producida por la reactivación de organismos previamente latentes o Infección exógena: se desarrolla a partir de una bacteria que se encuentra generalmente fuera del cuerpo y que ha penetrado el mismo. o Mantener los cultivos alejados del oxígeno para mejores resultados

Método de jarra y vela Se necesita un frasco con tapón de rosca y una vela. Una vez sembradas las placas y los tubos, se colocan en el interior del frasco junto con la vela encendida y se cierra el frasco herméticamente. Cuando la vela consume todo el O2 del frasco, se apaga consiguiendo una atmósfera de 5-7% O2 (microaerofílico).

Recipiente Gas Pak e indicador azul de metileno Consta de un soporte para placas incluido en una cubeta transparente con tapa hermética. Para crear la atmósfera anaeróbica se utiliza un sobre comercial con catalizador que contiene una tableta de borohidrato sódico y otra de bicarbonato sódico y ácido cítrico. Las placas y los tubos sembrados en el interior de la jarra junto al sobre abierto al que previamente se le han añadido 10 mL de agua destilada estéril para generar la liberación de CO2 e H2. Para confirmar el ambiente anaerobio, se coloca dentro de la jarra un papel indicador (azul de metileno) que cambia de color (de azul a blanco) en presencia de CO2. Perlas de paladio = catalizador de la reacción Tapa Brewer Anteriormente era utilizado para tapar el plato Petri y así crear un ambiente con bajo % de oxígeno.

Plato Spray Consta de una línea central que divide en 2 segmentos: en uno ácido pirogálico y en el otro NaOH que al mezclarlo en el medio de cultivo, reaccionaban formando H2O y CO2.

Cultivo en caldo de carne de Clostridium La capa de aceite mineral estéril permite que la superficie del caldo con carne molida de corazón de vaca quede totalmente cubierta para impedir la difusión de O2 al medio. Antes de inocular es conveniente hervir el medio durante 10 min para liberar el O2.

Tinción de Möeller para esporas de Clostridium

LAB N°11 - MYCOBACTERIAS, NOCARDIAS Y ACTINOMYCES -

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Bacilo Ácido Alcohol Resistente (BAAR) Alto contenido de lípidos Aerobios estrictos Pared compuesta de ácido micótico (ácidos grasos de cadena muy larga) que no permite la decoloración del gram Tinciones: o Ziehl Neelsen (carbol fucsina, alcohol ácido, azul de metileno)  si la bacteria está teñida de rojo es un BAAR o Kinyoun o Auramina-Rodamina  MFluorescencia Medios o Lowestein Jensen o Middle Brook o Castañeda o Sabouraud

Medio de Lowenstein Jensen Hecho a base de huevo, se cocina el huevo batido con extracto de papa y se le añade verde malaquita (medio selectivo), inhibidor para bacterias Gram positivas. Posee un fondo cremoso verde pálido. Asparagina = fuente de nitrógeno

Cultivo de Mycobacterium tuberculosis - No es una mycobacteria atípica. - Diagnóstico lento debido a su periodo de incubación de 3-6 semanas. - Vacuna BCG (Bacilo Cimette Guerin) que se obtiene de M. bovis.

Cultivo de mycobacterias atípicas  afectan a los inmunosuprimidos (SIDA) - MAPP (Mycobacterias del Ambiente Potencialmente Patógenas) - Según Runyon, se clasifican en: o Fotocromógenas (poseen pigmentos, amarillo, en la luz)  crecimiento lento  M. kansasii, M. marinum, M. simiae o Escotocromógenas (pueden o no presentar pigmentos, amarillo o naranja, en luz u oscuridad)  M. flavescens, M. scrofulaceum, M. gordonae o No Fotocromógenas (no pigmentadas en la luz, de crecimiento lento)  M. terrae, M. gastric, M. complejo avium-intracellulare, M. paratuberculosis o Crecimiento rápido (pueden o no tener pigmentos) crecen en menos de 1 semana  M. chelonae, M. fortuitum

Muestra de esputo BAAR (+) con tinción de Ziehl Neelsen Esta tinción demuestra la capacidad de bacterias teñidas de resistir a la decoloración por ácidos y alcoholes. Esto se correlaciona con su alto contenido en lípidos de su pared celular y presencia de ácidos micólicos que aumentan el carácter hidrófobo. Mezcla en carbol-fuscina capaz de teñir las células en caliente. El carbol facilita la penetración de fuscina en la envoltura celular. Azul de metileno como colorante de contraste. Los Bacilo Alcohol Ácido Resistente (BAAR) resisten el tratamiento orgánico y se verán teñidas de rosado/fuscia. El resto de las bacterias se decolorarán y se contrastarán con azul de metileno.

Gránulo histopatológico de Nocardia - Bacterias Gram positivas filamentosas, pueden producir BAAR (+) y confundirse con M. tuberculosis. Para aislarlo se utiliza el medio de Sabouraud a temperatura ambiente. - Se pueden observar como marañas enredadas en una biopsia pulmonar que pudieran bien confundirse con un artefacto histológico. - Crecen a temperatura ambiente en BHI, agar sangre, Lowenstein Jensen, Sabouraud Actinomyces - Bacilos gram positivos cortos - Gránulo de azufre