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• Karen Jasmin Jaramillo

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PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS. RECUENTO DE COLONIAS CON ASA CALIBRADA. Maycol Andrade (218095012); Karen Jaramillo(218095141); Johan Mejía (218095177); Camilo Obando (218095226); Laura Valdés (218095337) Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Nariño, Sede Torobajo. RESUMEN El objetivo de este laboratorio fue conocer e identificar los géneros y especies de la familia de enterobacterias y hacer un recuento de colonias con asa calibrada. En el laboratorio se llevaron a cabo, la primera en la que los microorganismos cultivados en EMB como Salmonella, Kebsiella, E. Coli y Proteus se aplicó pruebas bioquímicas como: TSI, LYS, UREASA, MIO Y CITRATO, también se llevó el cultivo al medio CLED para el recuento de colonias. Los resultados obtenidos para estos microorganismos se presentan en las tablas y el recuento de colonias. Por consiguiente, se realizó la interpretación de cada prueba que permitió conocer cualitativamente las propiedades bioquímicas del microorganismo estudiado, y cuantitativamente el recuento de colonias. PALABRAS CLAVE: Enterobacteriaceae, Salmonella, Escherichia Coli, Proteus, Kebsiella, pruebas bioquímicas. INTRODUCCION Enterobacterias: Esta familia comprende un número muy variado de géneros y especies bacterianos cuyo hábitat natural es el tubo digestivo del hombre y los animales. No todos los bacilos Gram negativos que tienen este hábitat forman parte de la familia Enterobacteriaceae. Se los encuentra en el suelo, agua, frutas, vegetales y otras plantas y en los animales desde los insectos al hombre. La familia está definida por un conjunto de características fenotípicas (bioquímicas, fisiológicas e inmunológicas) a las que se han agregado posteriormente otros elementos establecidos por técnicas de hibridización de ácidos nucleicos que miden distancias evolutivas y han definido mejor la interrelación de todos los microorganismos integrantes de la familia. Son bacilos Gram negativos rectos, con un

diámetro de 0.3 a 1.5 micras. Si son móviles, presentan flagelos perítricos. No forman esporos. Desarrollan en presencia o en ausencia de Oxígeno (aerobios-anaerobios facultativos). Desarrollan rápidamente en medios simples, no siendo exigentes desde el punto de vista nutricional. Algunos desarrollan en glucosa como única fuente de carbono, mientras otros requieren el agregado de vitaminas y/o minerales en el medio de cultivo. Son quimioorganotrofos, poseen metabolismo fermentativo y respiratorio. Son catalasa positivos y oxidasa negativos; reducen los nitratos a nitritos. El contenido de Guanina + Citosina del DNA total es de 38 a 60 moles %. En los medios de cultivo forman colonias lisas, convexas y circulares de bordes definidos. Algunas especies desarrollan colonias más

mucoides que otra (por ejemplo la Klepsiella).

- La investigación de la utilización de un substrato como única fuente de C.

Caracteres bioquímicos

Factores determinantes de patogenicidad

Los bacilos Gram negativos que integran esta Familia pueden identificarse por medio de la expresión fenotípica de algunos caracteres genéticos. Los métodos utilizados tienen como principio:

-La cápsula tiene propiedades de adhesina y es antifagocitaria.

- La investigación de la fermentación de azucares o alcoholes en un medio peptonado con el agregado de un indicador de pH para detectar la producción de metabolitos ácidos.

- Las fimbrias permiten la adherencia a la célula huésped e impiden el barrido por las barreras mecánicas de defensa del organismo.. -Exotoxinas: no todas las especies las producen. Sólo son producidas por las patógenas obligadas y poseen efectos específicos. [1]

METODOLOGIA

Siembra bacilos Gram Negativos en EMB, incubar por 24 horas a 37°C.

De estos mismos caldos tomar una asada con el asa calibrada para recuento de colonias e inocular cuatro estrías por agotamiento en agar CLED. Incubar por 24 horas a 37°C.

De las colonias lactosa positivas, aisladas de manera axénica, sembrar en las siguientes pruebas bioquímicas:

TSI-GAS- PRODUCCION DE H2S LISINA DESCARBOXILASA. UREA DE CHRISTENSEN. MIO: MOVILIDAD, INDOL, ORNITINA. CITRATO DE SIMMONS.

Imagen 1: Resultados para proteus y salmonella en medio CLED

Imagen 2: Recuento de colonias para Proteus (lactosa negativa).

Raya N⁰1: 6cm completa Raya N⁰2: 8,5 cm completa Raya N⁰3: 8,5 cm completa Raya N⁰4:8.0 cm completa

Determinación de No de UFC a partir de un asa calibrada (10 microlitros) Estría No 1: 6 cm (completa), teniendo en cuenta que una estría completamente formada equivale a 25000 UFC o 25x103 se tomara como base para realizar los respectivos cálculos siendo la estría más larga de 8,5 cm será tomada como referencia, la cual poseen 25000 UFC.

NoUFC =

25𝑥103 𝑥6 =18x103UFC/0.01 8,5

ml

18𝑥103 1𝑥10−2

= 18𝑥105 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙

Estría No 2: 8,5 cm (completa) de la misma manera, está al ser la estría más grande y completa equivale a 25x103 UFC en 0,01 ml lo que será la referencia para las demás. 25𝑥103 1𝑥10−2

= 25𝑥105 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙

Estría No 3: 8,5cm (completa), de igual forma que la anterior, al ser de las mismas proporciones y tamaño que la anterior esta también equivale a 25x103UFCen 0,01ml que será usado como referencia para las demás 25𝑥103 1𝑥10−2

= 25𝑥105 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙

Estría No 4: 8,0 cm (completa),usando la misma relación, que fue usada en el estriado 1 se realizara el mismo procedimiento NoUFC =

25𝑥103 𝑥8 =23,5x103UFC/0.01 8,5

ml

23,5𝑥103 1𝑥10−2

= 23,5𝑥105 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙

Imagen 3: Recuento de colonias para Salmonella.

Raya N⁰1: 5,6cm total – 0.5(fragmento pequeño de la línea)cm incompleta Raya N⁰2: 7,5 cm completa Raya N⁰3: 8,5 – 0.1 cm incompleta

Raya N⁰4:7,0cm completa Estría No 1: 5,6 cm (incompleta un fragmento pequeño), teniendo en cuenta que una estría completamente formada equivale a 25000 UFC o 25x103 se tomara como base para realizar los respectivos cálculos siendo la estría más larga de 7,5 cm será tomada como referencia, la cual poseen 25000 UFC. NoUFC =

25𝑥103 𝑥5,6 =19x103UFC/0.01 7,5

19𝑥103 1𝑥10−2

ml

= 19𝑥105 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙

Estría No 2: 7,5 cm (completa) de la misma manera, está al ser la estría completa equivale a 25x103 UFC en 0,01 ml lo que será la referencia para las demás. 25𝑥103 1𝑥10−2

= 25𝑥105 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙

Estría No 3: 8,5cm (incompleta), de igual forma, a pesar de ser la más larga no es la más completa por ende se realizará el mismo procedimiento que el anterior lo cual debería ofrecer resultados más grandes que la estría referencia. NoUFC =

25𝑥103 𝑥8,5 =28,3x103UFC/0.01 7,5

ml

28,3𝑥103 1𝑥10−2

= 28,3𝑥105 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙

Estría No 4: 7,0 cm (completa),usando la misma relación, que fue usada en el estriado 1 se realizara el mismo procedimiento NoUFC =

25𝑥103 𝑥7 =23,3x103UFC/0.01 7,5

23,3𝑥103 1𝑥10−2

ml

= 23,3𝑥105 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙

PRUEBAS BIOQUIMICAS El análisis cualitativo para las pruebas bioquímicas se empezó haciendo una clasificación de las pruebas aplicadas de TSI, CITRATO, UREASA, LISINA, MIO. para cuatro especies de Enterobacteriaceae (E. Coli, Salmonella, Kebsiella, Proteus), se profundizó en que consiste en cada prueba con el fin de realizar un análisis para cada especie de enterobacterias. Tabla 1: Propiedades bioquímicas de Enterobacteriaceae. REACCION

E. Coli

Salmonella

Kebsiella

Proteus

TSI

A/K

K/A

A/A

K/A

TSI(H2S)

N

N

N

P

GAS

P

P

P

N

C. SIMONS

N

P-N

P

P-N

LIS

K/A

K/A

A/A

K/A

UREASA

N

N

P

P

MOVILIDAD

P

P

P

P

INDOL

N

N

N

N

ORNITINA P N P P K: reacción alcalina- A: reacción acida- P: Resultado Positivo – N: Resultado negativo.

Tabla 2. Resultados experimentales de pruebas bioquímicas para Escherichia Coli.

TSI

CITRATO

UREA

LIS

MIO

Escherichia Coli es un bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo con un metabolismo tanto fermentativo como respiratorio. Puede ser inmóvil o móvil por flagelos peritricos. Es miembro de la familia Enterobacteriaceae, y aunque la mayoría de las cepas de E. coli no son patógenas, pueden ser patógenos oportunistas que causan infecciones en el hospedador inmunocomprometido. Fisiológicamente, E. coli es versátil, está adaptado a las características del hábitat y puede crecer en un medio con glucosa como única fuente orgánica. Puede crecer en presencia o ausencia de O2 y bajo condiciones anaeróbicas puede proliferar por fermentación, produciendo una mezcla de ácidos y gas como productos finales. Puede también crecer por medio de una respiración anaeróbica ya que es capaz de utilizar NO3, NO2 o fumarato como aceptores finales de electrones mediante procesos respiratorios de transporte de electrones. [7] Una vez teniendo el fundamento de la E. Coli se realizó un análisis detallado las diferentes pruebas, con TSI donde el fondo fue rojo (K: reacción alcanina) y el pico amarillo (A: reacción acida, lo que significa que fermentó la glucosa, produjo gas que se reflejó en la producción de burbujas, y no produjo H2S . 2 Con la prueba de citrato se obtuvo color verde (negativo) concluyendo que la E.coli no reacciona teniendo un compuesto químico como el citrato de sodio como única fuente de carbono y el fosfato monoámoniaco como fuente de nitrógeno.3 Para la prueba Urea no presentó un cambio de color amarillo a rojo lo que significa que la E. Coli carece de la enzima ureasa por lo que no le permite liberar amoniaco y CO2..En la prueba lisina se obtuvo una superficie violeta (K: reacción alcalina) fondo amarillo (A: reacción acida) lo que concluye que la e. Coli no descarboxila la lisina.5 La prueba para E. Coli donde se puede observar una turbidez en el medio lo que significa que hay movilidad, para la producción indol no se logró apreciar el anillo rojizo, en la ornitina si se aprecia un color amarillo fuerte.4

Tabla 2: Resultados experimentales de pruebas bioquímicas para Salmonella

TSI

CITRATO

UREA

LIS

MIO

Los miembros del genero salmonella son bacilos Gram-negativos fermentadores de lactosa , anaerobios facultativos, no esporulados, generalemnte móviles por flagelos peritricos con la expecion de salmonella gallinarum salmonella pollorum, responsables de la tifoidea aviar y pullorosis respectivamente. Poseen metabolismo fermentativo y oxidativo, fermentan glucosa con producción de acido y gas.[8] Ahora bien, en este análisis se hará hincapié en aquellas pruebas que presentaron algún tipo de confusión en el momento de interpretar sus resultaos, ya que anteriormente se presentó la clasificación de las pruebas y el análisis respectivo para cada prueba que siguen el mismo parámetro para todas. En la prueba citrato se pudo observar un azul verdoso, lo que impedía dar una clasificación si fue negativa o positiva; sin embargo, remitiéndose a literatura se encontró que la salmonella si puede tener el citrato de sodio como fuente de carbono, sabiendo esto se esperaría un color azul fuerte, una limitación que se pudo analizar fue el tiempo de incubación o un error del analista en la técnica de siembra.

Tabla 3: Resultados experimentales de pruebas bioquímicas para Proteus. TSI

CITRATO

UREA

E. MIO

LIS

El género Proteus forma parte de la familia Enterobacteriaceae. El Bergey’s Manual of Deteminative Bacteriology define este género como bacilos gramn egativos, móviles, con flagelos perítricos, aerobios y facultativos anaerobios. Tradicionalmente a este género se le ha encuadrado en la tribu Proteae que incluye también a los géneros Providencia y Morganella. Todos ellos se caracterizan por su capacidad para desaminar la fenilalanina trasformándola en ácido fenilpirúvico debido a la producción de fenilalanina desaminasa, hidrolizar la tirosina, desdoblar en casi todos los casos la urea y ser resistentes a la colistina. [9] En esta especie se presentó al igual que en la Salmonella un verde al fondo y un azul en la superficie lo que significaría que necesitaba más tiempo para que reaccione completamente. En la prueba TSI se puede observar el fondo negro lo que significa la producción de H2S. Tabla 4: Resultados experimentales de pruebas bioquímicas para Klebsiella. TSI

CITRATO

UREA

LIS

MIO

La principal especie de este género es Klebsiella pneumoniae, muy expandida en la naturaleza. Se la aísla frecuentemente de materias fecales del hombre y los animales, pero también de aguas, vegetales y alimentos. Son bacilos Gram negativos inmóviles, a menudo capsulados. La cápsula es de naturaleza polisacarídica.. Desde el punto de vista antigénico, es útil en epidemiología la determinación de los antígenos capsulares. Existen más de 70 tipos capsulares diferentes. Pueden existir reacciones cruzadas con antígenos capsulares de otras especies bacterianas. El poseer cápsula otorga a estas bacterias un aspecto colonial mucoide. Se trata de patógenos oportunistas, pueden provocar diversos cuadros clínicos en el hombre: infecciones urinarias, bacteriemias, neumonías, infecciones hepato-biliares, etc. Un porcentaje elevado de aislamientos de Klebsiella, particularmente aquellos de infecciones nosocomiales, contienen plásmidos de resistencia a los antibióticos. En las pruebas bioquímicas para Kebsiella en la prueba lisina no se pudo apreciar el violeta con mayor concentración, sin embargo, se observó una mínima coloración, lo que puso ocasionar esto fue que se inoculo de una manera inadecuada.

CONCLUSIONES 





Las pruebas bioquímicas para microorganismos son de vital importancia para reconocer los géneros y especies de microorganismos, que causan infecciones en el hombre o animales. En la practica realizada existieron confusiones que nos limitaban de una óptima interpretación de resultados, lo que nos permite concluir que es de vital importancia conocer el fundamento previamente antes del laboratorio. Se pudo comprobar la importancia del recuento de las placas para estimar el número de células presentes en función de su capacidad para dar lugar a colonias en condiciones específicas de medio, temperatura y tiempo nutriente. Teóricamente, una célula viable puede dar lugar a una colonia a través de la replicación.

CUESTIONARIO 1. Cual es papel de las enterobacterias en el tracto intestinal humano

Los miembros de este grupo forman parte de la microbiota del intestino también llamados coliformes, Tienen un papel relevante en el desarrollo del sistema inmunitario del huésped. Sus principales funciones incluyen actividades metabólicas como la producción de ácidos grasos de cadena corta y la absorción de nutrientes, efectos tróficos en el epitelio intestinal y en la estructura y la función del sistema inmunitario, y protegen al huésped frente a la invasión de microorganismos patógenos11;12. Además de ser la principales bacterias de ser productoras de lactato en diferentes rutas metabólicas del organismo siendo varias de ellas bacterias lácticas o etanolicas.

2. Por qué se afirma que algunas enterobacterias son oportunistas. Se las denomina así principalmente porque tiene exigencias nutricionales escasas, son capaces de sobrevivir en medios mínimos además de poseer un acción patogénica escasa, son los principales causantes de enfermedades asociadas a enterobacterias al ser muy fáciles de cultivar estas pueden permanecer en un estado de sueño hasta que el medio donde este sea óptimo para su desarrollo, y así poder proliferar en el organismo13.

3. Cuáles son los bacilos Gram negativos no fermentadores y porque no se incluyen en la familia Enterobacteriaceae. e Pseudomonas no-aeruginosa (P. putida, P. stutzeri. . .), Stenotrophomonas maltophilia (probablemente el agente de mayor interés en esta amplio grupo), Burkholderia cepacia complex, Chryseobacterium spp., Myroides spp., Achromobacter xylosoxidans, Ochrobactrum anthropi, Shewanella putrefaciens-algae, Sphingomonas paucimobilis, No se incluyen porque una enterobacteria debe poseer una características fermentadoras de carbohidratos y estas al no poder fermentar no se consideran de la familia del Enterobacteriaceae14.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Algorta, G; BACILOS GRAM NEGATIVOS NO EXIGENTES (ENTEROBACTERIACEAE, VIBRIONACEAE, PSEUDOMONAS) Disponible en:(http://higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2022.pdf). Fecha de consulta (15/06/2019)

2. Prueba bioquímica TSI Disponible en : (http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/tsi.pdf). Fecha de consulta(15/06/2019) 3. Prueba bioquímica citrato Disponible en: (https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a29779bd2be8.pd f) Fecha de consulta(15/06/2019) 4. Prueba bioquímica Lisina hierro agar Disponible en: (https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a282fb7b6204.pdf ) Fecha de consulta(15/06/2019). 5. Prueba bioquímica ureasa disponible en: ( https://.www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5af086c156e97.pdf ) Fecha de cocnsulta (15/06/2019). 6. Prueba bioquímica MIO disponible en : (https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a2832fb81126.pdf ) fecha de consulta (15/06/2019). 7. Escherichia coli diponible en : (http://www.aam.org.ar/descargaarchivos/Parte21Enterobacterias.pdf) fecha de consulta (16/06/2019) 8. Aislamiento de enterobacterias disponible en : (file:///C:/Users/ACER/Documents/MICROBIOLOGIA/tesis198.pdf) fecha de consulta (16/06/2019) 9. Proteus disponible en : (Rafael Cantón; Paz Sánchez Morenohttps://www.seimc.org/contenidos/ccs/revisionestematicas/bacteriologia/Ppe nneri.pdf) fecha de consulta (16/06/2019) 10. Klepsiella disponible en :( http://higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2022.pdf) fecha de consulta (16/06/2019) 11. https://www.analesdepediatria.org/es-flora-bacteriana-intestinal-articulo-13092362 12. https://es.wikipedia.org/wiki/Enterobacteriaceae

13. www.sld.cu/galerias/doc/sitios/.../enterobacterias_y_antibioticoterapia._dra_zuleica. do... Por zcg navarro 14. https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/eimc/seimc_eimc_v31n06 p402a409.pdf