• Author / Uploaded
• Leydi Yudith Angarita Bautista

• Categories
• Pregunta
• Integridad
• Ventas
• Empleo
• Entrevista

Citation preview

MEDIOS DE AISLAMIENTO Y ENRIQUECIMIENTO Si se desea recuperar determinados m.o. de sus ecosistemas naturales (agua, tierra, alimentos, etc.) puede recrearse en el laboratorio un medio ambiente artificial que favorezca el crecimiento de ellos frente a otros m.o. que los acompañen en ese ecosistema. Se puede emplear un medio de cultivo y condiciones de incubación (atmósfera, temperatura, pH) considerando las características fisiológicas del m.o. buscado, para otorgarle ventajas frente al resto de m.o. de ese ecosistema. Pretendemos inhibir la mayor cantidad posible de m.o. no deseados, de manera que estos no interfieran durante el aislamiento de los que sí interesan. Un esquema general para el enriquecimiento, aislamiento e identificación de m.o. es el siguiente:

Fuente de inóculo

Caldo de enriquecimiento

Aislamiento

Identificación

Debemos realizar las siguientes consideraciones si deseamos detectar y aislar un determinado tipo de m.o. y simultáneamente minimizar la interferencia de otros: Muestra Elegir la muestra adecuadamente. El m.o. que se está buscando debe ser factible de estar presente, ya sea si lo estamos buscando per se, o como contaminante. Debemos considerar si es útil someter la muestra a un tratamiento previo. Cuanto mayor selección se realice en este paso inicial, menos selectivos deberán ser los medios de cultivo a utilizar. ¿Debemos comenzar con un enriquecimiento o aislar la muestra directamente? Si el m.o. que deseamos aislar está en un bajo número, se siembra la muestra en un caldo de cultivo que favorezca su multiplicación (enriquecimiento). Cuando un enriquecimiento se realiza en un medio formulado para frenar el desarrollo de m.o. acompañantes no deseados, se denomina enriquecimiento selectivo. Cuando el m.o. deseado está en alto número, no se necesita realizar un enriquecimiento, y se puede sembrar la muestra en un medio sólido adecuado directamente. Medio de cultivo Debemos realizar una formulación adecuada de los medios de cultivo empleados. En general en las primeras etapas se utilizan medios de cultivo selectivos. Dicha selectividad se puede determinar ya sea, a) agregando un inhibidor de la flora acompañante, o b) haciendo el medio restrictivo al incluir un nutriente que sólo el m.o. deseado sea capaz de utilizar. Debemos utilizar las condiciones de incubación adecuadas: temperatura, luz, atmósfera (aerobia o anaerobia, atmósfera con concentración de CO2, etc.). Los componentes del medio de cultivo que se pueden manejar son: • Fuente de carbono. A modo de ejemplo, se podrían quitar todos los compuestos orgánicos para permitir el crecimiento de m.o. autótrofos que son capaces de obtener su fuente de carbono del CO2 (que difunde de la atmósfera al medio o por agregado de bicarbonato). O incluir exclusivamente una fuente de carbono particular, por ej, fenol si queremos aislar degradadores de ese compuesto. • Fuente de nitrógeno. Se puede omitir el agregado de fuente nitrogenada (orgánica u inorgánica) para permitir el crecimiento de fijadores libres de nitrógeno, que son capaces de obtener su fuente de nitrógeno del N2 atmosférico. • Fuente de energía. Si no se agrega ningún compuesto capaz de ser utilizado como fuente de energía y se incuba a la luz, sólo crecerán los m.o. fotosintéticos que usan la luz como fuente de energía. • Se pueden agregar o no compuestos que sean utilizados como factores de crecimiento (vitaminas, aminoácidos, ácidos nucleicos, ácidos grasos, etc.) según se necesiten o no.

Pág. 28

PRUEBAS BIOQUÍMICAS INDOL Introducción El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de m.o. Principio La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo del reactivo de Kovacs descrito más adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano. Medios y reactivos Caldo triptofano Peptona o digerido pancreático de caseína Cloruro de sodio Agua destilada Reactivo de Kovacs Alcohol amílico o isoamílico p-dimetilaminobenzaldehído HCl conc.

2g 0,5 g 100 ml

150 ml 10 g 50 ml

Procedimiento Inocular el caldo triptofano con el m.o. en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo. Interpretación El desarrollo de un color rojo intenso en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y un resultado de la prueba positiva. Controles Escherichia coli: positivo Klebsiella pneumoniae: negativo (mayoría de las cepas)

ROJO DE METILO - VOGES-PROSKAUER (RM VP) Principio Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen dos tipos generales: la fermentación ácido-mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta. El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia Pág. 29

Medios y reactivos Caldo RM/VP Peptona Glucosa Fosfato dipotásico Agua destilada

7g 5g 5g 1L

pH = 6,9 ± 0,1 Indicador de pH rojo de metilo Rojo de metilo 0,1 g en 300 mL de etanol 95° Agua destilada 200 ml Revelador VP alfa-naftol (solución al 5% en etanol 95°) Solución de KOH al 40% en agua destilada Procedimiento Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del m.o. en estudio. Incubar a 35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 mL del caldo a un tubo limpio para VP. En el caldo restante revelar RM agregando unas 4 - 8 gotas del indicador rojo de metilo. Para revelar VP agregar 0,6 ml (10 gotas) de alfa-naftol al 5% y 1 gota de KOH al 40%. Agitar cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. Interpretación La prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo estable. Esto indica que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el m.o. fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo. La prueba VP es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia luego de 15 minutos, que indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína. Controles RM positivo, VP negativo: Escherichia coli RM negativo, VP positivo: Enterobacter aerogenes UTILIZACIÓN DE CITRATO Introducción La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias. Principio La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

Pág. 30

Medios y reactivos Medio de Simmons Fosfato diácido de amonio Fosfato dipotásico Cloruro de sodio Citrato de sodio Sulfato de magnesio Agar Azul de bromotimol Agua destilada c.s.p.

1g 1g 5g 2g 0,2 g 15 g 0,08 g 1L

pH = 6,9 Procedimiento Se inocula la superficie del agar inclinado con una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. Interpretación El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul. Controles Positivo: Klebsiella spp. Negativo: E.coli DESCARBOXILACIÓN DE LISINA Y ORNITINA Introducción La descarboxilación de aminoácidos es llevada a cabo por descarboxilasas y se forman aminas y CO2. Cada descarboxilasa es específica para un aminoácido y la reacción es completa e irreversible. Los aminoácidos ensayados habitualmente para la identificación son lisina, ornitina y arginina. Principio El caldo descarboxilasa de Moeller es el medio base más comúnmente usado para la determinación de las descarboxilasas en enterobacterias. Se prepara un tubo con el medio conteniendo el aminoácido a ensayar y un tubo control con medio base sin aminoácido. Se cubren con una capa de aceite mineral (vaselina líquida) para hacer el medio anaerobio de manera que ocurra la fermentación de la glucosa que contiene. Durante las primeras etapas de la incubación en ambos tubos se observará viraje del indicador de pH del medio al ácido, por la fermentación de la glucosa. Luego, si el aminoácido es descarboxilado, se forman aminas que provocan un retorno al color original del medio o un viraje al alcalino. Medios y reactivos Base de Moeller Peptona Extracto de carne Glucosa Piridoxal Púrpura de Bromocresol Rojo de cresol Agua destilada c.s.p.

5g 5g 0,5 g 0,005 g 0,01 g 0,005 g 1L

Pág. 31

pH final = 6,0 Caldo Lisina o Ornitina de Moeller: Preparar igual al medio base y agregar 10 g del aminoácido (1% de concentración final de la forma levo, utilizar el doble si se usa la forma dl del aminoácido ya que solo la levo es activa). Agregar aceite mineral para formar una capa de 1 cm de espesor. Procedimiento Inocular con un cultivo puro de 24 horas un tubo de base de Moeller con el aminoácido a estudiar (lisina u ornitina) y un tubo de la base (control sin aminoácido). Incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Interpretación El ensayo puede ser leído si en el tubo control se observa crecimiento y viraje del indicador al amarillo indicando que se dio la fermentación de la glucosa y un descenso de pH que permite la activación de las descarboxilasas. El retorno al color azul-violeta en el tubo que contiene el aminoácido indica una reacción positiva debida a la liberación de aminas por descarboxilación. Controles Descarboxilación de lisina positiva: Enterobacter aerogenes Descarboxilación de lisina negativa: Enterobacter cloacae Descarboxilación de ornitina positiva: Serratia spp Descarboxilación de ornitina negativa: Klebsiella spp.

FENILALANINA DESAMINASA Introducción La fenilalanina es un aminoácido que por desaminación oxidativa forma un cetoácido, el ácido fenilpirúvico. Sólo los géneros Proteus y Providencia poseen la fenilalanina desaminasa, lo que permite diferenciarlas del resto de las Enterobacterias. Principio La prueba de la fenilalanina se basa en la detección del ácido fenilpirúvico luego del desarrollo del m.o. en un medio que contiene fenilalanina. Para eso se agrega cloruro férrico que forma un complejo de color verde con el ácido fenilpirúvico. El medio de cultivo no puede contener extractos de carne o peptonas por su contenido variable en fenilalanina. Medios y reactivos Agar fenilalanina DL fenilalanina Extracto de levadura Cloruro de sodio Fosfato de sodio Agar Agua destilada c.s.p.

2g 3g 5g 1g 12 g 1L

pH = 7,3 Cloruro férrico Cloruro férrico HCl concetrado Agua destilada c.s.p.

10 g 2,5 g 100 ml

Pág. 32

Procedimiento Inocular el agar en pico de flauta con un cultivo puro de 24 horas e incubar a 35°C durante 18-24 horas. Luego de transcurrido el período de incubación, agregar 4 o 5 gotas de reactivo de cloruro férrico, directamente sobre la superficie del agar. Interpretación La aparición inmediata de un color verde intenso indica la presencia de ácido fenilpirúvico y una prueba positiva. Controles Positivo: Proteus Negativo: Escherichia coli

TSI (TRIPLE SUGAR IRON) Introducción El agar triple azúcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. También permite la detección de la producción de H2S. Es un medio útil para la identificación de enterobacterias. Principio El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que existan dos cámaras de reacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada (pico) expuesta en toda su superficie al oxígeno es aerobia y la porción inferior (fondo) está protegida del aire y es relativamente anaerobia. Al crecer un m.o. en el TSI, el pico tiende a virar al pH alcalino (color rojo por el rojo fenol) por la producción de aminas, debido a la utilización aerobia de las peptonas. En el fondo del tubo -donde no hay oxígeno- la degradación de peptonas es menor y no se generan aminas, de manera que se pueden detectar la producción de pequeñas cantidades de ácido (color amarillo por el rojo fenol). Si se inoculan m.o. no fermentadores no se formarán ácidos, pero por la producción de aminas en el pico, todo el medio quedará rojo. La glucosa en el TSI está en una proporción 10 veces menor que la lactosa y la sacarosa. Si el TSI es inoculado con una bacteria fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, la cantidad de ácido producida por fermentación será baja (porque la cantidad de glucosa inicial es baja). En las primeras horas (10 a 16 hs) de incubación se producirá viraje del indicador al amarillo en todo el tubo (pico y fondo), pero al continuar la incubación, el pico del tubo retornará al rojo por la producción de aminas debida a la degradación aerobia de las peptonas antes descrita. Si el m.o. fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones de estos azúcares son 10 veces mayores a la glucosa, se producirá gran cantidad de ácido (que no puede ser neutralizado por la producción de aminas en la superficie), por lo tanto todo el tubo (pico y fondo) virará al color amarillo (ácido). La producción de H2S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por precipitación del sulfuro ferroso (negro). Como esta reacción se da preferencialmente en medio ácido, un ennegrecimiento del fondo del tubo (que puede cubrir todo el fondo del tubo y enmascarar el color amarillo) se lee como fermentación de algunos de los azúcares del medio. Además puede observarse la producción de gas (H2 y CO2), ya sea como burbujas en el fondo del tubo, por ruptura del agar o desplazamiento del mismo hacia la superficie.

Pág. 33

Medios y reactivos TSI Extracto de carne Extracto de levadura Peptona Proteosa peptona Lactosa Sacarosa Glucosa Cloruro de sodio Sulfato ferroso Tiosulfato de sodio Agar Rojo fenol Agua destilada

3g 3g 15 g 5g 10 g 10 g 1g 5g 0,2 g 0,3 g 12 g 0,024 g 1L

pH = 7,4 ± 0,2 Procedimiento Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35 °C durante 18-24 hs, pero no más de 24 hs.. Interpretación y Controles Para el TSI siempre se informa el resultado en el siguiente orden: pico, fondo, producción de gas y H2S. Pico alcalino/fondo alcalino (Alc/Alc/gas-/H2S-) No hay fermentación de azúcares. Característica de bacterias no fermentadoras como Ej. Pseudomonas sp Pico alcalino/fondo ácido (Alc/A/gas-/ H2S-) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay producción de gas ni de H2S. Ej. Shigella spp. Pico alcalino/fondo ácido (Alc/A/gas-/ H2S+) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay producción de gas, si de H2S. Ej. Salmmonella typhi. Pico alcalino/fondo negro (Alc/A/gas+/H2S+) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de gas y producción de ácido sulfhídrico. Ej. Salmonella spp. (la mayoría de las especies de Salmonella). Pico ácido/fondo ácido (A/A) Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H2S o no. E.coli (A/A/H2S -) A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas. Ej. A/A/gas+/H2S-.

Pág. 34

LIA (LYSINE IRON AGAR) Introducción Este ensayo permite diferenciar los m.o. que producen descarboxilación o desaminación de la lisina. Se puede detectar además la producción de H2S. Es muy utilizado en las técnicas de búsqueda de Salmonella, principalmente para descartar otras bacterias que dan colonias de aspecto similar en los medios diferenciales utilizados durante el aislamiento selectivo. Principio Durante las primeras etapas de la incubación el fondo virará el indicador de pH del medio al ácido (amarillo) por la fermentación de glucosa. Luego, si el aminoácido es descarboxilado se formarán aminas que provocan un retorno al color original del medio o hacia un viraje al básico (color violeta). En la desaminación se produce un ácido carboxílico y NH3 y se visualiza en la superficie la aparición de un color rojo intenso. La producción de H2S a partir de tiosulfato se visualiza por la precipitación de sulfuro ferroso de color negro. Medios y reactivos Peptona Extracto de levadura Glucosa L-lisina HCl Citrato férrico amónico Tiosulfato de sodio Púrpura de bromocresol Agar Agua destilida

5g 3g 1g 10 g 0,5 g 0,04 g 0,02 g 15 g 1L

pH = 6,7 ± 0,2 Interpretación y controles pico alcalino/fondo alcalino/H2S +, descarboxilación de lisina positiva. Ej.: Salmonella choleraesuis. pico rojo/fondo ácido/H2S-, desaminación de lisina positiva, descarboxilación de lisina negativa. Ej.: Proteus mirabilis. pico alcalino/fondo ácido/H2S- descarboxilación de lisina negativa. Ej. E. coli pico alcalino/fondo ácido/H2S+ descarboxilación de lisina negativa, producción de H2S. Ej. Citrobacter freundii.

PRODUCCIÓN DE PIGMENTOS PARA PSEUDOMONAS SP. Introducción La capacidad para producir pigmentos como pioverdina (fluoresceína) y piocianina es una característica importante para la identificación de especies de Pseudomonas. Algunas de ellas elaboran sólo fluoresceína (ej. Ps. fluorescens) y otras ambos pigmentos (ej. Ps. aeruginosa). La piocianina solamente es producida por Ps. aeruginosa aunque no todas las cepas de esta especie la producen. Se han diseñado medios de cultivo que potencian la elaboración de uno de los pigmentos e inhiben la formación del otro. Principio El medio King A (o Pseudomonas Agar P) potencia la elaboración de piocianina mientras que el King B (o Pseudomonas Agar F) potencia la elaboración de fluoresceína e inhibe parcialmente la de piocianina. Estos pigmentos son solubles en agua y difunden al medio. La piocianina es un pigmento azul-verde mientras que la fluoresceína es amarillo-verdoso y fluoresce cuando es expuesto a la luz UV (λ=254 nm). Existen pigmentos amarillo-verdosos producidos por algunas especies de Pseudomonas que no fluorescen. Pág. 35

Medios y reactivos King A Peptona 20 g Glicerol 10 g K2SO4 10 g MgCl2 1,4 g Agar 15 g Agua 1L

King B Proteosa Peptona Glicerol K2HPO4 MgSO4.7H2O Agar Agua

20 g 10 g 1,5 g 1,5 g 15 g 1L

Los medios se reparten en tubos, se esterilizan a 121ºC durante 15 minutos y se dejan solidificar inclinados. Procedimiento Inocular los tubos por estrías. Incubar a 35ºC durante 24 hs. Interpretación Observar al UV, la producción de pigmento azul-verdoso en el medio King A y la de pigmento amarillo-verdoso, en el King B Controles Pseudomonas aeruginosa: King A + P. fluorescens: King A P. fluorescens: King B + P. stutzeri: King B -

DNASA - DESOXIRRIBONUCLEASA Introducción La actividad desoxirribonucleasa (DNAsa) se ha demostrado fundamentalmente en los géneros Staphylococcus y Serratia y consiste en la propiedad de degradar el ADN a fracciones de menor peso molecular. Esta característica se ha utilizado para identificar las especies de Serratia marcescens y Staphylococcus aureus. Weckman y Catlin demostraron la estrecha correlación entre la producción de DNAsa de los cultivos de Staphylococcus aureus con la producción de coagulasa. Principio Los m.o. DNAsa positivos degradan el DNA cuando son incubados en un medio que lo contiene. Esto puede ser visualizado de diferentes maneras: ya sea inundando las placas crecidas con HCl 0,1 N y observando zonas transparentes alrededor de las estrías o incorporando al medio indicadores como azul de toluidina o verde de metilo (viran a rosado cuando el test es positivo). Medios y reactivos DNAsa agar Triptosa ADN NaCl Agar Azul de toluidina* Agua c.s.p.

20 g 2g 5g 15 g 0,1 g 1L

* o verde de metilo Pág. 36

Procedimiento Estriar la superficie de la placa e incubar a 35°C durante 18-24 horas. Observar el viraje del indicador a rosado alrededor de las estrías. Interpretación Un resultado positivo está dado por el viraje del indicador en la zona de la estría a rosado. Controles Positivo: S.aureus y Serratia marcescens Negativo: S.epidermidis:

COAGULASA Introducción La coagulasa es una enzima proteica con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina, provocando la formación de un coágulo visible en un sistema analítico adecuado. Se cree que la coagulasa funciona in vivo, produciendo una barrera en el sitio de infección estafilocóccica. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza más comúnmente para diferenciar al Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otros Staphylococcus. Principio La coagulasa se halla presente en dos formas, “libre” y “fija”, cada una de las cuales posee diferentes propiedades que requieren el uso de técnicas de determinación diferentes: Coagulasa fija (prueba en portaobjetos): la coagulasa fija está unida a la pared celular bacteriana. Los hilos de fibrina formados entre las células suspendidas en plasma (que contiene fibrinógeno) provocan su aglutinación, indicada por la presencia de agregados visibles en el portaobjetos. Coagulasa libre (prueba en tubo): la coagulasa libre es una enzima extracelular que se halla presente en los filtrados de cultivos. Cuando una suspensión de bacterias productoras de coagulasa se mezcla en partes iguales con plasma en un tubo de ensayo, se forma un coágulo visible como consecuencia de la utilización de los factores de coagulación del plasma de manera similar a cuando se añade trombina. Medios y reactivos Plasma coagulasa (Difco, o BBL) Cultivo de Staphylococcus de 24 horas en un agar nutriente o caldo nutriente. Procedimiento Prueba en portaobjetos Colocar una gota de agua destilada sobre un portaobjetos Emulsionar suavemente el organismo en estudio en la gota de agua de manera de obtener una suspensión cargada homogénea. Agregar una gota de plasma reconstituido junto a la gota de la suspensión del m.o. Mezclar bien con el ansa. Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado, observando la formación inmediata de un precipitado granular o de grumos blancos. Prueba en tubo Colocar asépticamente 0,5 ml de plasma reconstituido en el fondo de un tubo estéril. Añadir 0,5 ml de cultivo de 24 horas (o suspensión en suero fisiológico de un cultivo en placa). Mezclar por rotación el tubo, evitando remover o agitar el contenido. Colocar en baño de agua a 37°C y observar cada hora hasta 4 horas y luego a las 24 horas, la formación de un coágulo visible.

Pág. 37

Interpretación Prueba en portaobjetos: una reacción positiva se detecta usualmente en 15 a 20 segundos por la aparición de un precipitado granular. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinación en 2 a 3 minutos. Esta prueba es solo presuntiva y todos los cultivos que den resultados negativos o positivos tardíos deben verificarse mediante la prueba en tubos ya que algunas cepas de Staphylococcus aureus no producen coagulasa fija. Prueba en tubos: 1+: pequeños coágulos no organizados. 2+: pequeños coágulos organizados. 3+: gran coágulo organizado. 4+: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando se invierte el tubo. Se consideran positivos los grados 3+ y 4+ Controles Positivo: S.aureus Negativo: S.epidermidis:

PRUEBA DE LA BILIS ESCULINA Introducción La prueba de la bilis-esculina está basada en la capacidad de ciertas bacterias, particularmente los estreptococos del grupo D, de hidrolizar la esculina en presencia de bilis al 1 o 4%. La esculina es, químicamente, un derivado de la cumarina (6-b-glucósido-7-hidroxicumarina), que por su estructura pertenece a los glucósidos. Por definición, éstos están constituídos por dos restos unidos por un puente de oxígeno. En el caso de la esculina, uno de los restos es una glucosa y el otro la 7hidroxicumarina (que no es un hidrato de carbono, y es denominado aglucona).

Pág. 38

Principio Las bacterias capaces de desarrollar en bilis y también hidrolizar esculina, producen glucosa y esculetina (7,7 dihidroxicumarina) y ésta puede visualizarse en un medio con una sal de hierro, por formación de un complejo marrón oscuro o negro. Algunos medios bilis-esculina incluyen también azida sódica para inhibir el desarrollo de organismos Gram negativos, transformándose en selectivos para estreptococos. Medios y reactivos Medio bilis-esculina Peptona Extracto de carne Bilis de buey Esculina Citrato férrico Agar Agua destilada

5g 3g 40 g 1g 0,5 g 15 g 1L

Procedimiento Se estría el organismo en estudio en placas o tubos en pico de flauta del medio bilis-esculina. Se incuba a 37°C durante 24 horas. Interpretación La esculetina difunde hacia el medio de agar por ser hidrosoluble. La reacción es positiva si se observa un ennegrecimiento difuso del tubo o un halo marrón oscuro o negro alrededor de las colonias en placa. Controles Positivo: streptococo del grupo D Negativo: estreptococo no del grupo D

UREASA Introducción La urea es una diamida del ácido carbónico que puede ser hidrolizada con liberación de amoníaco y dióxido de carbono. Principio La ureasa es una enzima que poseen muchas especies de m.o. que pueden hidrolizar urea de acuerdo a la siguiente reacción química: Urea + 2H2O

CO2 + H2O + 2NH3

El amoníaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio, produciéndose alcalinización y aumento de pH del medio. Medios y reactivos El caldo urea y agar urea de Christensen son los dos medios mas comúnmente usados en los laboratorios para la detección de la ureasa de m.o.

Pág. 39

Caldo de Stuart Extracto de levadura Fosfato monopotásico Fosfato disódico Urea Rojo fenol Agua

0,1 g 9,1 g 9,5 g 20 g 0,01 g 1L

pH = 6,8 Agar urea de Christensen Peptona 1g Glucosa 1g Cloruro de sodio 5g Fosfato monopotásico 2 g Urea 20 g Rojo fenol 0,012 g Agar 15 g Agua 1L pH = 6,8 Procedimiento Inocular el caldo con una ansada cargada con el cultivo puro del m.o. o estriar la superficie del agar. Incubar a 35°C durante 24 hs. Interpretación Los m.o. que hidrolizan urea rápidamente pueden producir reacciones positivas en 1 a 3 hs. Las especies mas lentas pueden requerir 3 o mas días. Caldo: una coloración rojiza indica alcalinazación e hidrólisis de urea Agar: una coloración rojiza en el medio indica hidrólisis de urea positiva. Los degradadores lentos producen coloración parcial (generalmente el pico), los rápidos producen coloración en todo el tubo. Si no hay hidrólisis el medio permanece con el colo original (amarillo) y se observa crecimiento. Controles Positivo: Proteus sp Negativo: Escherichia coli

Pág. 40

PROBLEMAS TEÓRICOS GENERALIDADES La identificación de una cepa bacteriana requiere comparar las características de esa cepa con las características de las especies conocidas descritas. Esta descripción se encuentra en el Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Las propiedades que usa para clasificar los procariotas en grandes grupos (secciones del Manual de Bergey) son las morfológicas, el tipo de pared y la tolerancia al oxígeno. Esas son generalmente las características por donde se comienza la identificación de una bacteria. Puede ocurrir que esta sea una nueva bacteria, en ese caso comparando con las ya descritas sólo podremos decir que se parece mucho a una especie ya descrita pero que no pertenece a la misma. En la mayoría de los análisis de rutina en un laboratorio de microbiología el problema que se presenta no es identificar una bacteria aún no descrita, sino determinar si una cepa aislada pertenece o no a una especie de interés. El conocimiento de las propiedades de esa especie de interés se utiliza en el proceso de aislamiento para seleccionar especies con determinadas características. Por ej. si se quiere determinar si en una muestra de agua están presentes estreptococos fecales (cocos Gram positivos anaerobios facultativos) utilizará medios y condiciones de incubación tales que excluyan a otros grandes grupos de bacterias como los cocos Gram positivos anaerobios estrictos y durante su análisis incubará aeróbicamente. La información de la ecología del m.o. aislado, es decir la muestra de la cual proviene, así como el proceso de aislamiento del mismo reducen considerablemente el espectro de especies posibles. Por ello, en el proceso de identificación es posible que no necesite analizar todas las características que indica el Manual de Bergey. Otra razón por la cual el número de características a analizar puede reducirse es que en la mayoría de los análisis microbiológicos se busca confirmar o descartar que la cepa aislada pertenece a una especie dada. Si la cepa no pertenece a la especie de interés, no es necesario identificarla. Por ej. si en una muestra dada para la cual se exige ausencia de Pseudomonas aeruginosa se aisla una bacteria que pertenece al género Pseudomonas pero no es de la especie P. aeruginosa, no es necesario determinar a que especie del género pertenece. Problema I (E.coli) Antecedentes Las bacterias de la especie Escherichia coli son bastones Gram negativos que no reducen sulfato cuyo hábitat natural es el intestino humano y de animales de sangre caliente. Las cepas de E. coli generalmente no son patógenas, sino indicadores de contaminación fecal. Su presencia en una muestra implica que otros m.o. de origen fecal, incluyendo patógenos, pueden estar presentes en la misma. Sólo algunas cepas de E.coli son agentes etiológicos de infecciones gastrointestinales. Estas cepas patógenas entéricas se diferencian entre si y de las no patógenas por su biotipo, generalmente asociado a la presencia de plásmidos. En los procedimientos de rutina de análisis de especialidades farmacéuticas y de alimentos se determina la presencia o el número de bacterias de la especie E.coli pero no se determina si esas cepas son potenciales patógenos entéricos. Cuando hay sospecha de presencia de E.coli patógena se realiza una serotipificación de un numero determinado de cepas aisladas y/o se envían a Centros de referencia. La contaminación fecal puede originarse en las materias primas utilizadas en la elaboración de un producto o por contaminación durante o posteriormente al proceso de elaboración. El número de bacterias generalmente depende del tipo de producto y proceso y determina el procedimiento que se realizará para aislar bacterias que pertenezcan a la especie E.coli. El otro factor que determina el procedimiento de aislamiento es la flora acompañante: la proporción relativa de E.coli a las demás bacterias presentes y las propiedades fisiológicas de esas otras bacterias. En muestras que se preparan a partir de materias primas que no deben tener contaminación fecal (como medicamentos preparados a partir de materias primas sintéticas) o en muestras en las cuales después de su preparación se ha realizado un proceso para disminuir la carga bacteriana (alimentos pasteurizados) se podría esperar un número muy bajo de E.coli. En esas muestras se Pág. 41

realiza un procedimiento de búsqueda, en el cual por siembra en medios de enriquecimiento se aumenta el número de bacterias para después realizar su aislamiento e identificación. En muestras de origen natural (generalmente materias primas de origen natural como leche no pasteurizada, aguas presumiblemente contaminadas) se podría esperar un número mas alto de estas bacterias. En ese caso no se realiza la etapa de enriquecimiento sino que directamente se cuenta el número de estas bacterias empleando un método de recuento de bacterias viables en un medio selectivo para E.coli. En ambos casos la etapa siguiente es determinar si las colonias aisladas pertenecen o no a la especie E.coli. Los procedimientos oficiales para su detección en alimentos y medicamentos generalmente llegan a esta etapa después del aislamiento en medios selectivos y diferenciales. Los medios selectivos mas comunes utilizan inhibidores para las bacterias de origen fecal que acompañan a E.coli (como enterococos) o para bacterias que no son de origen fecal. Los medios sólidos generalmente contienen sales biliares y cristal violeta y los medios líquidos que se emplean para el recuento por número más probable de coliformes en alimentos y agua (Caldo Lauril Sulfato, Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante y caldo Escherichia coli) contienen lauril sulfato de sodio o sales biliares y verde brillante. Estos medios son generalmente diferenciales porque tienen además lactosa - E.coli fermenta lactosa y glucosa- y un modo para detectar su fermentación (indicadores de cambio de pH) o la producción de gas en medio líquido (campanas de Durham). Las colonias aisladas en medios selectivos no necesariamente son cultivos puros debido a que el inhibidor del medio puede detener el crecimiento de los otros m.o. contaminantes sin eliminarlos. Se debe reaislar en un medio no selectivo para asegurarse de obtener un cultivo puro. En el reaislamiento se debe observar si hay colonias con una o varias morfologías y se debe proseguir el análisis sólo con las colonias con morfología macro y microscópica características de la especie que se busca aislar. EN ESTA COMO EN CUALQUIER OTRA IDENTIFICACION ES IMPORTANTE QUE CONOZCA LAS CARACTERISTICAS PRINCIPALES –DE ACUERDO AL MANUAL DE BERGEY- DEL MICROORGANISMO QUE INTENTA IDENTIFICAR. Problema En jarabes preparados a partir de extractos naturales de plantas la Farmacopea Europea exige ausencia de E.coli en 1 mL de jarabe. Para realizar dicho análisis se realiza un enriquecimiento en caldo lactosa, se aislan colonias de dos tipos en medio Mac Conkey incubado entre 43-450C: 1) colonias rojas con halo de precipitación alrededor, 2) colonias incoloras sin halo de precipitación. ¿Cuáles son las colonias que podrían pertenecer a la especie E. coli? Ud. recibirá un reaislamiento de una colonia sospechosa en medio Agar Lactosa Rojo Fenol. ¿Cómo crecería una cepa de E. coli en ese medio? ¿Que ensayos adicionales a la observación de la colonia y de sus características en el medio de cultivo debe realizar en el momento para determinar si dicha colonia puede ser E. coli? ¿Que otras propiedades puede deducir a partir de este crecimiento? De acuerdo a ellas, la cepa que tiene en ese reaislamiento podría pertenecer a la sección en la cual el Manual de Bergey ubica a E.coli? ¿En que Familia se ubica a E. coli? ¿Que propiedades debería determinar para distinguir esa Familia de las otras de la misma sección? ¿En que caso puede afirmar que tiene un cultivo puro? ¿Puede continuar con las etapas de identificación? Si no puede, ¿que procedimiento realizaría? De acuerdo a la Farmacopea Europea, la cepa sospechosa que Ud. tiene hasta ahora (colonias típicas en el medio selectivo) indica la presencia probable de E.coli. Para la confirmación se recomienda el test para la producción de indol y otras pruebas bioquímicas. ¿En qué consiste la prueba de indol? ¿Qué resultado espera para esta prueba si fuese E.coli? Utilice la tabla de pruebas bioquímicas para Enterobacterias resumida del Manual de Bergey. (recuerde que el número que aparece en la tabla es el % de cepas que dan un resultado positivo para ese test en el total de cepas analizadas)

Pág. 42

Podría “perderse” alguna cepa de E.coli si realizara sólo esta prueba? Es decir una cepa que, siendo E.coli, no la puede identificar como tal porque la cepa da un resultado atípico en la producción de indol. La recomendación de la American Public Health Association (APHA) para el análisis de alimentos incluye tres pruebas además del indol: Rojo de Metilo, Voges –Proskauer y Citrato. Las 4 pruebas se resumen en la sigla IMViC (Indol, Metilo, Voges, Citrato). ¿Qué cree que se logra incluyendo mas pruebas bioquímicas? ¿En qué consisten estas pruebas? ¿Qué resultados espera para E.coli? Los manuales de métodos del APHA dan por identificada una cepa como Ecoli si el resultado de las pruebas IMViC es ++-- (Indol y Rojo de Metilo positivos, VP y Citrato negativos) o si es -+--. ¿Podría “perderse” una cepa de E.coli en este caso? ¿Podría darse el caso al revés, es decir que identifique como E.coli una cepa que no es? Problema II (Salmonella) Antecedentes Las bacterias del género Salmonella son bastones Gram negativos que no reducen sulfato cuyo habitat es el intestino humano y de animales. Aunque no todas las especies de Salmonella son igualmente patógenas, todas son importantes para la salud pública, y por tanto el procedimiento de análisis debe estar dirigido a recuperar cualquier especie que pertenezca a este género. En especialidades farmacéuticas y alimentos –a diferencia de muestras clínicas- se espera un número bajo de estas bacterias, que además pueden estar fisiológicamente dañadas debido al procesamiento y almacenamiento de la muestra. Debido a ello en el análisis de estas muestras se incluyen siempre etapas de enriquecimiento. El aislamiento generalmente se realiza en mas de un medio de cultivo (no todas las especies de Salmonella crecen en un solo tipo de medio sólido). Los medios selectivos más comunes utilizan inhibidores como el colorante verde brillante o sales biliares para bacterias que no son de origen fecal. Varios de estos medios son diferenciales porque tienen además lactosa o xilosa y un modo para detectar su fermentación (indicadores de cambio de pH) o lisina y la detección de la decarboxilación. La etapa siguiente es determinar si las colonias aisladas pertenecen o no al género Salmonella. Las pruebas bioquímicas y la serología se usan de rutina para la identificación presuntiva en laboratorios de análisis microbiológico. La identificación definitiva se realiza en centros de referencia por serología. Recuerde que las colonias aisladas en medios selectivos no necesariamente son cultivos puros debido a que el inhibidor del medio no elimina los otros m.o. contaminantes. Se debe reaislar en un medio no selectivo para asegurarse de obtener un cultivo puro. En el reaislamiento se debe observar si hay colonias con una o varias morfologías y se debe proseguir el análisis sólo con las colonias con morfología macro y microscópica características de la especie que se busca aislar. Problema En preparaciones farmacéuticas que contienen plantas medicinales la Farmacopea Europea exige ausencia de Salmonella en 10 g de la preparación. Para realizar dicho análisis se realizan dos etapas de enriquecimiento: una en caldo lactosa y la siguiente en un caldo selectivo con tetrationato, bilis y verde brillante. A partir de allí se aislan colonias en mas de un tipo de medio de cultivo selectivo: en uno de ellos, el Agar Verde Brillante (que tiene además lactosa, sacarosa y rojo fenol), crecen dos tipos de colonias: 1) colonias que viran el medio a amarillo, 2) colonias incoloras que no viran el medio a su alrededor. ¿Cuáles colonias podrían pertenecer al género Salmonella? Ud. recibirá un reaislamiento de una colonia sospechosa en medio Agar Lactosa Rojo Fenol. ¿Cómo crecería una cepa de Salmonella en ese medio? ¿Qué ensayos adicionales a la observación de la colonia y de sus características en el medio de cultivo debe realizar en el momento para determinar si dicha colonia puede ser una especie de Salmonella?

Pág. 43

¿Qué otras propiedades puede deducir a partir de este crecimiento? De acuerdo a ellas, ¿la cepa que tiene en ese reaislamiento podría pertenecer al grupo de bacterias en el cual el Manual de Bergey ubica a las especies de Salmonella? ¿En qué Familia se ubica a las especies de Salmonella? ¿Que propiedades debería determinar para distinguir esa Familia de las otras de la misma sección? ¿En qué caso puede afirmar que tiene un cultivo puro? ¿Puede continuar con las etapas de identificación? Si no puede, ¿que procedimiento realizaría? De acuerdo a la Farmacopea Europea, la cepa sospechosa que Ud. tiene hasta ahora (colonias típicas en los medios selectivos) indica la presencia probable de bacterias del género Salmonella. La identificación presuntiva se realiza con la prueba bioquímica llamada Tripe Sugar Iron (TSI). ¿En que consiste esta prueba? ¿Que resultados espera para las distintas especies del género Salmonella? Utilice la tabla de pruebas bioquímicas para Enterobacterias resumida. ¿Podría “perderse” alguna cepa de Salmonella? Es decir una cepa que, siendo Salmonella sp., no la puede identificar como tal porque la cepa da un resultado atípico en esta prueba. La Farmacopea Europea recomienda la realización de otras pruebas bioquímicas y pruebas serológicas para la identificación definitiva. La recomendación de la American Public Health Association (APHA) para el análisis de alimentos sigue un procedimiento similar para enriquecimiento y aislamiento pero usa otras pruebas bioquímicas como la producción de indol, y la descarboxilación de lisina entre otras. Recuerde además que, durante el aislamiento, se eligieron para la identificación las cepas no fermentadoras de lactosa. ¿Que cree que se logra incluyendo mas pruebas bioquímicas? ¿En que consisten estas pruebas? Que resultados espera para las especies de Salmonella? ¿Podría “perderse” alguna cepa de Salmonella en este caso? ¿Podría darse el caso al revés, es decir que identifique como una especie del género Salmonella a una cepa que no lo es? Problema III (P. aeruginosa) Antecedentes En el curso de una investigación epidemiológica de varios casos de infección por Pseudomonas aeruginosa en una sala de atención de quemados, se realizaron cultivos de los posibles fuentes o reservorios de la bacteria en el ambiente. Ud. recibirá una placa de Agar Cetrimide sembrada con uno de los antisépticos analizados, cultivada durante 24 horas a 37C, en aerobiosis. Se solicita que determine si el antiséptico pudo ser el reservorio o fuente de la cepa de Pseudomonas aeruginosa que provocó los casos de infección. ¿Qué tipo de medio de cultivo es el Agar Cetrimide? ¿Las bacterias que crecen en él requieren factores de crecimiento? ¿Requiere altas concentraciones de NaCl? ¿A cuál sección del Manual Bergey corresponde la o las bacterias en estudio? ¿Podría tratarse de una bacteria aerobia estricta? Como haría para confirmar que se trata de una bacteria aerobia estricta? ¿Cuál es el fundamento de los ensayos King A y King B? Si una cepa creciera en Agar Cetrimide con producción de un pigmento difusible de color azul, realizaría ambos ensayos?

Pág. 44

¿Es el antiséptico analizado un posible reservorio de la cepa que causó las infecciones en los pacientes? El antiséptico del cual se obtuvo este aislamiento fue una solución de un compuesto de amonio cuaternario. ¿Es posible suponer que fuera un reservorio para P. aeruginosa? Problema IV (S. aureus) Antecedentes Las bacterias pertenecientes a la especie Staphylococcus aureus son cocos Gram positivos, que pueden ser patógenos para el hombre. Las principales afecciones que producen son intoxicación alimentaria, por producción de una toxina termoresistente en alimentos, e infecciones de piel. Existen seres humanos que son portadores sanos de S. aureus, el cual se aloja en narinas y piel. A partir de esas fuentes, puede llegar a los alimentos donde su proliferación constituye un riesgo potencial para la salud pública por la posible producción de enterotoxinas. Las siguientes situaciones llevan a analizar los alimentos para determinar la presencia o el número de células de S. aureus: A) confirmar si es el agente causal de una enfermedad alimentaria. B) determinar si un alimento o ingrediente es una fuente potencial de estafilococos enterotoxigénicos C) demostrar contaminación post-proceso, que generalmente se debe a contacto humano con alimentos procesados. Los alimentos que se sospecha fueron vectores de una toxiinfección alimentaria debida a S. aureus frecuentemente presentan altos números de células del m.o.. En cambio, si se sospecha una contaminación post proceso, puede esperarse una población menor. En general S. aureus no es el único m.o. presente en el alimento, por lo cual debe emplearse medios selectivos para su aislamiento y recuento. Las especialidades farmacéuticas también se analizan para detectar S. aureus, debido a la posibilidad de causar infecciones en piel y mucosas. En este tipo de muestras, por lo general se exige ausencia de S. aureus en 1 g de producto. Los medios selectivos contienen inhibidores de otros m.o., de modo de impedir el desarrollo de otras especies. Los agentes selectivos más comúnmente usados en medios para S. aureus son NaCl (S. aureus puede crecer en presencia de concentraciones entre 5.5% y 10%) y telurito de potasio (K2TeO3, S. aureus reduce el telurito de potasio, produciendo colonias negras), y otros cloruro de litio, polimixina, azida de sodio y neomicina. Debe considerarse que el uso de los agentes selectivos no garantiza la completa inhibición de otros m.o., como por ejemplo miembros de los géneros Bacillus, Micrococcus, Streptococcus y aún levaduras. Por esta razón, la aparición de colonias típicas no es suficiente y debe confirmarse si dichas colonias típicas desarrolladas en placas de medio selectivo verdaderamente pertenecen a la especie S. aureus. Problema Una familia presenta síntomas de toxiinfección alimentaria 2 a 4 horas después de comer, con náusea, vómitos, diarrea y dolor abdominal. Esta sintomatología puede deberse al desarrollo de elevados números de S. aureus y formación de toxina en el alimento ingerido. Se decide analizar una muestra remanente de queso artesanal que formó parte de la comida, de modo de determinar si el m.o. responsable fue S. aureus. ¿Qué método puede usarse para aislar S. aureus de dicha muestra si el m.o. estuviera presente en números altos?

Pág. 45

A Ud. se le entregará una placa de MSA proveniente de esta muestra. Considerando que las bacterias del genero Staphylococcus son fermentadoras de glucosa y manitol. ¿Es posible afirmar que en la muestra había S. aureus? ¿Por qué? En caso de que haya que continuar el análisis: ¿Cómo determinaría si las colonias típicas corresponden a S aureus o no? ¿Qué morfología y reacción al Gram presenta el género Staphylococcus? ¿Cómo se clasifican las bacterias de este género según sus relaciones con el oxígeno? ¿Cómo puede diferenciarse el género Staphylococcus de otros relacionados? (Deberá recurrir a Tablas del Manual de Bergey que tendrá para consulta en clase) ¿Cómo puede diferenciarse S. aureus de otras especies del género Staphylococcus?

Pág. 46

DETERMINACIONES CUANTITATIVAS DE LA BIOMASA - RECUENTOS Se propone la siguiente clasificación: 1. Recuentos (determinación del número de microorganismos) • • • • • •

Recuento en placa ya sea en superficie o incorporado Método de las diluciones múltiples o del Número Más Probable (NMP) Filtración por membrana e incubación de ésta sobre medio de cultivo sólido Recuento microscópico directo de los m.o., ya sea en frotis o en cámaras Filtración por membrana, coloración del filtro, y conteo al microscopio . Conteo electrónico, usando contadores de partículas.

2. Determinación de la masa celular • • • •

Medida de la masa Medida del volumen Determinación del contenido de N Turbidimetría y nefelometría

3. Determinación de la actividad celular • • • • • • •

Determinación de una actividad enzimática Determinación de un metabolito Medida del consumo de oxígeno Medida de ATP Calorimetría Medida de impedancia Radiometría (de CO2)

Al momento de elegir la técnica de recuento a emplear, se debe tener en cuenta el tipo de muestra sobre la que se va a trabajar, porque es posible que algunos de los métodos no sean aplicables. Cuando es necesario llevar a cabo diluciones, la toma y preparación de la muestra se realiza de la manera descrita anteriormente (toma de muestra). En las descripciones que siguen se denominará homogeneizado a la muestra preparada para su análisis microbiológico.

Pág. 47

RECUENTOS RECUENTO EN PLACA Permite determinar indirectamente el número de m.o. presentes en una muestra en base a que se desarrollen en medio de cultivo, en placa, formando colonias. Por lo tanto se determinan por este método sólo las células microbianas VIABLES en las condiciones de trabajo (nutrientes, atmósfera, temperatura). Como las colonias pueden originarse tanto de una célula como de un grupo de células, se utiliza el término: UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (u.f.c.) Además, a los efectos de que todas las células que están en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que la incertidumbre del método sea menor, se establece que las condiciones óptimas de recuento se dan cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias por placa. Esta regla general se usa siempre que no haya una especificación diferente. Para alimentos se utilizan el rango de colonias óptimas entre 25 a 250 ufc por placa. Si fuera posible y necesario se puede repetir el recuento para obtener placas con un número de colonias óptimas. Procedimiento La preparación de la muestra se realiza como para cualquier método utilizando diluyentes adecuados. Se preparan diluciones decimales sucesivas (relación muestra/volumen de dilución 1 en 10), partiendo en general de 10 g o mL de muestra en 90 mL de diluyente para la primera dilución (1/10 o 10-1). Para la segunda dilución (1/100 o 10-2) se toma 1 mL de la 10-1 y se descarga en 9 mL de diluyente y así sucesivamente. Se descarta la pipeta luego de cada descarga. Cada vez que se prepara una dilución en necesario homogeneizarla adecuadamente para lograr una distribución de los m.o. en todo el volumen de dilución. Esto se logra por agitación (si es un frasco con tapón hermético se realiza con agitación durante 25 veces, formando un arco de aprox. 30 cm y si es un tubo con agitación con Vortex). También puede cargarse y descargarse un determinado volumen de la dilución con una nueva pipeta (al menos tres veces), y finalmente tomar el volumen deseado .

Según la carga esperada, o permitida, se eligen las diluciones a sembrar. Cuando se esperan cargas altas, se siembran no menos de tres diluciones consecutivas Ej.: 1:10 (10-1), 1:100 (10-2), 1:1000 (10-3). Una vez preparadas las diluciones, se siembra dentro de los 15 minutos siguientes .

Pág. 48

ANTES DE PROCEDER A LA SIEMBRA SE ROTULAN LAS PLACAS CON LOS SIGUIENTES DATOS: Identificación de la muestra: Nombre y/o código Dilución, Volumen sembrado Superficie o incorporado Fecha Operador SIEMBRA INCORPORADA Se deposita 1 mL de cada dilución en placas estériles, vacías, por duplicado. Se puede emplear la misma pipeta para todas las diluciones si se comienza por la más diluida. Posteriormente, se agrega a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear, previamente fundido y termostatizado a 45ºC (en baño o estufa). Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimiento circular, horario y antihorario yy hacia delante y hacia atrás. En algunas situaciones puede sembrarse un volumen diferente, en general no más de 3 mL por placa. SIEMBRA EN SUPERFICIE Se deposita en la superficie de las placas que ya contienen el medio de cultivo, 0.1 mL de cada dilución. Se realiza duplicado para cada dilución. Se puede emplear la misma pipeta para todas las diluciones si se comienza por la más diluida. Luego de realizada la descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda la superficie de las placas para que se absorba, usando rastrillo estéril. Medio de cultivo Se elige según el tipo de m.o. que se quiere contar pudiendo emplearse medios selectivos o no selectivos. Incubación Una vez enfriado el agar en el caso del recuento incorporado, y absorbida la muestra en el caso de recuento en superficie, las placas se invierten, y se ponen en la estufa que corresponde según los m.o. a contar, durante el tiempo propuesto en la técnica correspondiente. INTERPRETACIÓN Finalizado el período de incubación se observa con buena luz a efectos de visualizar todas las colonias y diferenciarlas de cualquier partícula de muestra que pueda confundir. Contar todas las colonias desarrolladas por placa, marcando cada una con un lápiz de tinta indeleble. Se cuentan como colonias individuales todas aquellas que disten de las colonias próximas una distancia al menos igual al diámetro de la colonia más pequeña. Cuando se utilizan medios NO SELECTIVOS se procede de la siguiente forma: 1) Se cuentan en primer lugar las placas que tengan entre 30 y 300 colonias (o 25 – 250). Se hace el cálculo multiplicando por la inversa de la dilución y luego se promedian –si corresponde- los valores de las distintas placas y diluciones. Para el informe final se toma en cuenta solo los valores de estas placas. Si no hay placas que contengan entre 30 y 300 colonias proceder de la siguiente manera: 2) Si sólo hubieran placas con menos de 30 colonias, se hace el cálculo multiplicando por la inversa de la dilución y se informa igualmente el resultado, expresándolo por g o mL de muestra. En este caso se informa el resultado como ESTIMADO. Si no hubiera colonias en ninguna de las placas, se informa como: Menor que 1 o 10 (según sea incorporado en superficie) por la inversa de la dilución menor. Pág. 49

3) Si en todas las placas hubiera más de 300 colonias, se estima el resultado. Si no es posible distinguir colonias individuales (crecimiento confluente) se puede informar el resultado como mayor de 300 por la inversa de la dilución mayor. Si es posible distinguir colonias individuales y están homogéneamente distribuidas, se cuentan las colonias en una superficie conocida de la placa y luego se extrapola a la superficie total de la placa: 65 cm2 para las de vidrio comunes, o 57 cm2 para las de plástico. Se siguen las siguientes reglas: • Si hay menos de 10 colonias por cm2, se cuentan 13 cuadrados de 1 cm de lado: 7 consecutivos horizontales y 6 consecutivos verticales. El total de colonias contadas se multiplica por 5 o 4.4 según el tipo de placa, para estimar el número de colonias en toda la placa. En este caso se informa el resultado como ESTIMADO • Si hay más de 10 colonias por cm2, se cuentan 4 cuadrados de 1 cm de lado, y el promedio se multiplica por 65 o 57 según el tipo de placa. En este caso se informa el resultado como ESTIMADO • Si hay más de 100 colonias en 1 cm2, no se cuentan sino que se estima el resultado como mayor de 6500 o 5700 por placa. Una vez estimado el número de colonias por placa, se aplica el factor de conversión para expresar el resultado por gramo o mL de muestra, de acuerdo al método (incorporado o superficie), y a las diluciones sembradas. Es frecuente que desarrollen colonias extendidas sobre la superficie o el fondo y bordes de la placa, o que se den cadenas de colonias unidas. Este tipo de crecimiento se denomina "spreaders" y se cuentan como una. Cuando el spreader cubre más del 50% de la placa, esta no debe contarse. Cuando el spreader cubre una superficie menor del 50%, se cuentan las colonias en el resto de la placa, SOLO si están uniformemente distribuidas. Si en todas las placas hay spreaders se informa : Spreaders Todas las situaciones en las que no se pueda informar el recuento por no caer en los casos anteriores, (ej.: contaminación, mal funcionamiento del medio), se informa como: "Accidente de laboratorio" Cuando se emplean medios SELECTIVOS, el número de colonias que se considera óptimo para contar, suele ser menor de 300, es necesario referirse a la técnica correspondiente (de referencia) a los efectos de la interpretación de los resultados. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE AMBOS MÉTODOS: Incorporado

Superficie

Mayor cantidad de muestra.

Menor cantidad de muestra

Mayor precisión

Menor precisión

Mejor aprovechamiento de nutrientes

Peor aprovechamiento de nutrientes

Dificultades al subcultivar colonias

Facilidad para subcultivar colonias

Visualización de colonias dificultosa

Fácil visualización

Temperatura del agar puede afectar la No se afectan los m.o. termosensibles viabilidad de algunos m.o. Se desarrollan m.o. microaerofilicos

En aerobiosis sólo crecen aerobios y anaerobios facultativos

Pág. 50

Expresión de los resultados: Se informan los resultados de recuento con sólo DOS CIFRAS SIGNIFICATIVAS, redondeando los valores cuando corresponda. Redondear la segunda cifra significativa a la inmediata superior si la tercera cifra es 6 ,7, 8 o 9. Redondear la segunda cifra significativa a la inmediata inferior si la tercera cifra es 1, 2, 3 y 4. Si la tercera cifra es 5 redondear hacia arriba si la segunda cifra es impar y hacia abajo si es par Ej.: 137 se informa 140 ó 1,4 x 102 145000 se informa 1,4 x 105 En el informe de un recuento en placa se expresa,: Recuento de ..............(tipo de microorganismo): X u.f.c. /g o mL

NUMERO MAS PROBABLE (NMP) O METODO DE LOS TUBOS MULTIPLES Se basa en la determinación de la presencia o ausencia de un determinado tipo de m.o. (en función de que crezcan o de que produzcan determinada reacción en el medio), en cantidades decrecientes de muestra. Se analizan en forma paralela por triplicado o quintuplicado porciones de la muestra cada vez menores inoculadas en un medio líquido. Por ejemplo, se utilizan un total de nueve tubos con medio de cultivo, en tres de los cuales se siembra 0,1 g. de muestra, en tres 0,01 g y en los otros tres restantes 0,001 g. Luego de la incubación, se observan y cuenta el número de tubos positivos. Según el tipo de m.o que se desea contar se utilizan medios de enriquecimiento selectivo o medios nutrientes. En función de esto se puede considerar como positivos aquellos tubos en los que: 1) Hubo crecimiento que se detecta como aparición de turbidez (siempre que la muestra sembrada no enturbie el medio). 2) Detección de productos del metabolismo del m.o. a) producción de gas que se observa en una campanita invertida (Durham) en el tubo. c) viraje de indicador (de pH, de potencial redox, etc). d) producción de pigmento. e) otros (reducción de NO3-, producción de indol, hidrólisis de una proteína, etc) Ocasionalmente, es necesario subcultivar cada uno de los tubos positivos, o presuntamente positivos a placa, o a otro tubo (con el mismo u otro medio) a efectos de confirmarlo. El número de tubos (positivos) que se busca en las tablas para el informe final es el que resulta de esta etapa de confirmación, siendo el valor anterior sólo un valor presuntivo. La interpretación de los resultados, se hace en base a una distribución de tipo Poisson, y en general se emplean tablas preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se siembra en cada serie de tubos. Ejemplo 1: Nº de tubos sembrados: Volumen por tubo (mL) Dilución de la muestra: Equivalente en g de muestra Tubos positivos

3 1 10-2 0,01 3

3 1 10-3 0,001 1

3 1 10-4 0,0001 0

El resultado 3-1-0 se busca en tabla III y se obtiene un valor de 43/g ó mL, cuando en la primer serie de tubos se siembra 0,1 g. Como en nuestro caso no estamos en condiciones hay que realizar la conversión. En este caso resulta claro que estamos sembrando diez veces menos en la Pág. 51

primera serie de tubos (0,01 g), por lo tanto el factor a utilizar es multiplicando el resultado de tabla por diez. El resultado a informar es entonces: NMP de (tipo de m.o) = 43/g.

Una manera general de calcular el resultado es multiplicar el valor de tablas por el inverso de la dilución sembrada en la serie del medio. Ej: 3 1 0 en Tabla III

43/g

NMP de tipo de m.o/mL = 43 x 1/dilución de la serie del medio = 43 x 1/10-3 = 430/g ó 4,3 x 102/g 100 100

Ejemplo 2: Nº de tubos sembrados: 5 5 5 Volumen de muestra en c/u (mL): 10 1 0,1 Número de tubos positivos: 2 0 0 (dos tubos positivos para la primera dilución, ninguno en las siguientes) De la tabla IV surge el valor: 5/mL. Como la siembra no esta realizada en las condiciones de la tabla debe aplicarse el factor de corrección. El resultado final se informa: NMP de .... (tipo de m.o):= 5 x 1/100= 0,05/mL ó 5/100 mL 100 Si la muestra es agua es habitual informar el resultado por 100 mL.

Pág. 52

Es de fundamental importancia antes de leer la tabla, asegurarse que esté construida para condiciones similares a las de trabajo, que sea para igual número de tubos por serie, y para cantidades de muestra que sean múltiplo o submúltiplo ya que hay variedad de tablas según el número de tubos y diluciones a sembrar. La corrección se hace utilizando proporcionalidad inversa. En todos los casos el valor informado se considera un índice de la carga microbiana, y se conocen los límites de confianza para cada valor. Dado que la distribución de las células obedece una distribución de Poisson puede calcularse el número de células promedio de la dilución sembrada cuando no se trabaja en las condiciones más comunes para las que existen tablas, usando la siguiente ecuación: NMP/g o mL = ___________Nº de tubos positivos____________________ (mL o g de muestra en tubos negativos

X

mL o g de muestra) en todos los tubos

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL MÉTODO: Puede emplearse para aquellos m.o. que no crezcan en medio sólido y para aquellos m.o. de crecimiento lento (paras los cuales se evidencia el crecimiento por una reacción y no por turbidez) Este método es especialmente útil para determinar cargas microbianas bajas, menores de 10 por gramo para sólidos o menores a 1 por 10 mL para líquidos, pero puede igualmente emplearse para cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas. Asimismo, es el único método a utilizar en el caso de muestras como por ejemplo polvos insolubles, en los que no es aplicable el método de filtración ni es recomendable el recuento en placa debido a la presencia de partículas. Se prefiere también este método cuando los m.o. son de lento crecimiento, o cuando han sido sometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecación, etc.) Es posible enumerar también por este método m.o. anaerobios utilizando en los tubos medio prerreducido, que se tapan con vaselina-parafina luego de inocular, e incuban en condiciones aerobias.

FILTRACION POR MEMBRANA Este método consiste en hacer pasar un volumen determinado de muestra líquida, o solución en agua o en solvente apropiado estéril a través de un filtro de membrana estéril (diámetro 50 mm, poro 0,45 µm), colocado en un equipo de filtración. Luego de enjuagar con soluciones estériles apropiadas se retira el filtro, y se lo coloca sobre la superficie de una placa de Petri con el medio de cultivo a utilizar e incuba. Los filtros pueden ser de distintos materiales; en microbiología se emplean de nitrato o acetato de celulosa generalmente, y pueden tener bordes hidrofóbicos, que minimizan la adsorción de conservadores y antimicrobianos. Luego de transcurrido el tiempo de incubación, se cuentan las colonias desarrolladas en el filtro. Se considera que las condiciones óptimas del método se dan cuando desarrollan entre 20 y 200 colonias en el filtro. Se utilizan filtros reticulados, y existen reglas para el conteo: Pág. 53

1) Si hay 1 o 2 colonias por cuadrado del retículo, o menos, se cuentan todas. 2) Si hay entre 3 y 10 por cuadradito, se cuentan 10 cuadrados, y se promedia, multiplicando por 100 para obtener el número de colonias en el filtro (se multiplica por 100 porque el área del cuadrado representa la centésima parte del área total del filtro). 3) Si hay entre 10 y 20 se cuentan 5 cuadrados y promedia, multiplicando luego por 100. 4) Si hay más de 20 se considera >2000 por filtro Toda vez que se utilice el promedio por cuadrado, el recuento se informa como ESTIMADO. Ventajas y desventajas: Sirve para determinar cargas muy bajas, pues se puede filtrar volúmenes de 100 y hasta 1000 mL. Es además el método de elección para muestras líquidas o solubles que contienen agentes antimicrobianos, por cuanto no es necesario neutralizarlos. Expresión de los resultados: Una vez conocido el número de colonias por filtro, se expresa el valor en u.f.c. al igual que el recuento en placa expresándolo por gramo, o mililitro de muestra.

RECUENTO MICROSCOPICO DIRECTO Este método permite determinar el número de células microbianas, por observación en el microscopio. La muestra puede utilizarse tal cual, (si es líquida como leche o cultivos puros en medio líquido), o puede prepararse una dilución tal como se realiza para otros métodos de recuento. Se basa en contar m.o. en una cantidad conocida de muestra utilizando frotis coloreados, cámaras del tipo de las de contar glóbulos, o las especialmente diseñadas para contar hongos en alimentos como la cámara de Howard. Se determina el número TOTAL de células presentes (VIABLES Y NO VIABLES) Ocasionalmente se pueden utilizar colorantes que indiquen diferentes estados metabólicos de las células. Por ejemplo en un recuento en cámara de un cultivo de levaduras con azul de metileno, se pueden distinguir las células VIABLES (no absorben el colorante, se verán transparentes) de las NO VIABLES (absorben el colorante y se verán azules). Recuento sobre frotis coloreado Se marca sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, un cuadrado de 1 cm de lado. Sobre la superficie opuesta del portaobjetos, se deposita en el centro 0,01 mL de muestra ya sea con ansa calibrada o con micropipeta. Se extiende por todo el cuadrado con ansa. Se deja secar en posición horizontal. Se fija y colorea, ya sea por Gram o con azul de metileno 1 minuto (método de Breed para leche). Se observa por inmersión, contando los m.o. en cada uno de varios campos. El número de campos a contar depende del número de m.o. por campo y del factor del microscopio. Se transcribe la tabla que se propone para el recuento directo en leche (Standard Methods for the Examination of Dairy Products APHA)

Número de campos a contar según el factor del microscopio y el número de microorganismos:

Pág. 54

Microorganismos por campo Menos de 1 1 a 10 Más de 10

Factor del microscopio 300000

400000

500000

600000

30 20 10

40 20 10

50 20 10

60 30 20

Cálculo del factor del microscopio Con objetivo de 40 x, o 100 x, se mide el radio del campo utilizando un portaobjetos calibrado, o el retículo de una cámara cuenta glóbulos. Si se utiliza el de 40 x, luego debe hacerse la corrección utilizando el factor 40/100 para llevarlo al aumento de trabajo. Se calcula el área del campo: π r2 El número de campos por cm2 es: 1 / π r2 Si se extendió en 1 centímetro cuadrado 0,01 mL de muestra, el número de campos por mililitro, llamado Factor del Microscopio (FM), se calcula de la siguiente forma: FM = 100 / π r2 donde r se expresa en cm, o FM = 10000/ π r2 con r en mm. Expresión de resultados Una vez contado el número de m.o. en los campos que corresponde, se promedia, y multiplica por el Factor del microscopio; de esa forma se obtiene el resultado que se expresa en términos de: Recuento microscópico directo = N microorganismos por mL Recuento en cámara de Neubauer Es una cámara que se utiliza para contar glóbulos (En E se cuentan eritrocitos y en L los leucocitos) y está diseñada de manera de contener una cantidad fija de líquido. Consta de un cuadrado central de 1 mm de lado dividido en 25 cuadraditos. Cada uno de ellos está, a su vez, dividido en 16 cuadrados. Se coloca un cubreobjetos sobre la zona cuadriculada, apoyado sobre dos hombros laterales de manera que cuando hay un buen contacto entre ellos, queda una distancia de 0.1 mm entre el cubreobjetos y la cámara. Esto determina que el líquido quede contenido en un volumen de 0.1 mm3. Ventajas del método: Es rápido Los frotis se pueden guardar Las exigencias de equipo son mínimas Se pueden observar las diferentes morfologías de los m.o. Se observan tanto los m.o. viables como los no viables Desventajas del método: La cantidad de muestra analizada es poca Provoca cansancio del operador Sólo sirve para muestras con cargas superiores a 10.000 por mL. Es difícil distinguir los m.o. de las partículas de muestra Una inadecuada distribución de la muestra sobre la superficie del portaobjetos puede ocasionar serios errores. Pág. 55

DETERMINACIÓN DE LA MASA CELULAR TURBIDIMETRÍA Este método da información sobre el contenido de macromoléculas, y no sobre el número de células. En el laboratorio de microbiología se usa un colorímetro, o un espectrofotómetro y se mide la absorbancia de la suspensión de m.o. en comparación con un blanco que es el medio esterilizado, y sin sembrar. Cuanto mayor es el número de células en suspensión, tanto menor es el porcentaje de luz que atraviesa el medio. Se cumple una ley similar a la de Lambert-Beer y expresando la relación en términos de masa microbiana y absorbancia, la ecuación es la siguiente:

A

A= k x W: donde: Absorbancia k: constante W: masa celular La gráfica correspondiente construida con valores reales muestra una desviación a medida que aumenta la masa microbiana.

W

Para utilizar la medida de la absorbancia como método de recuento, es necesario hacer para cada m.o. una curva de calibración, midiendo el número de m.o. por otro método de recuento. El método se emplea fundamentalmente para preparar inóculos, cuando se trabaja con cultivos puros. ESCALA DE MAC FARLAND Pág. 56

Existe la posibilidad de estimar cargas altas de m.o., comparando a simple vista con una escala formada por tubos numerados de 1 a 10 y elaborada con diferentes cantidades de sulfato de bario. Se conoce la cantidad aproximada de células bacterianas a que corresponde cada tubo, y de esa forma se puede estimar la cantidad de m.o. presentes. Este método sólo da una estimación del número de m.o. (viables y no viables) y sirve sólo para cargas altas. Tiene la ventaja de ser muy rápido y no es necesaio disponer de espectrofotómetro. Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Millones de bacterias/ mL 300 600 900 1.200 1.500 1.800 2.100 2.400 2.700 3.000

Pág. 57

ALGUNAS APLICACIONES DE RECUENTOS

MICROORGANISMOS INDICADORES Los métodos usados para el aislamiento y el recuento de los m.o. patógenos en agua, alimentos, etc. pueden no ser eficaces debido a que dichos m.o. se encuentren en muy baja cantidad, sobre todo en presencia de números altos de otros m.o. También puede ocurrir que tengan una distribución irregular en la muestra. Aún cuando se cuenta con métodos sensibles, en general son largos y costosos; además, hay patógenos que no pueden determinarse en laboratorios no especializados, como, por ejemplo, el virus de la hepatitis A. Estas dificultades han impulsado a que se utilicen grupos de m.o. de detección y enumeración más fáciles y cuya presencia en cierto número se considera como una indicación de que la muestra estuvo expuesta a condiciones que pudieron determinar la llegada a la misma de m.o. peligrosos y/o permitir la proliferación de especies patógenas. Estos grupos de m.o. se denominan indicadores. Se usan como m.o. indicadores aquellos cuya relación con los patógenos ha sido estudiada. Los indicadores utilizados más frecuentes son: - mesófilos aerobios totales o heterótrofos - Enterobacterias - Coliformes totales y fecales - Estreptococos fecales y Enterococos - Clostridios sulfito-reductores AGUA El análisis microbiológico de muestras de agua tiende a determinar la calidad sanitaria de ésta y su aptitud para distintos usos. En general, los métodos utilizados están diseñados de modo de detectar el grado de contaminación del agua con desechos de origen humano y/o animal. Tradicionalmente se han usado ensayos para la determinación de m.o. indicadores más que para la determinación de patógenos. El grupo de bacterias coliformes ha sido siempre el principal indicador de calidad de los distintos tipos de agua; el número de coliformes en una muestra se usa como criterio de contaminación y por lo tanto, de calidad sanitaria de la misma. Los coliformes son bastones Gram (-), aerobios o anaerobios facultativos que fermentan la lactosa con formación de gas cuando se incuban 48 horas a 35ºC. Incluye los géneros Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y especies lactosa positivas de otros géneros. También interesa la determinación de coliformes fecales que representan la fracción de coliformes que provienen de intestinos y materias fecales de hombre y animales de sangre caliente (coliformes termotolerantes). Esto provee información importante sobre la fuente y el tipo de contaminación presente. Un método muy utilizado para el recuento de coliformes en agua ha sido siempre el NMP, pero han ido variando los medios de cultivo, las condiciones y las técnicas de manera de obtener cada vez mayor sensibilidad y precisión hasta hacerlo aceptable como método estándar. Los distintos métodos de NMP para coliformes totales se basan, en primera instancia, en una selección de los m.o. que producen gas de lactosa a 35ºC. Por ello, el primer paso es siempre la siembra en tubos de algún caldo lactosado, con tubo de fermentación para recoger el gas que pueda producirse. A esto sigue una confirmación en un medio líquido selectivo y/o una determinación de los coliformes fecales cuya diferenciación se realiza en base al hecho de que pueda producir gas de lactosa en un medio apropiado cuando se incuba a 44,5ºC mientras que los demás coliformes no. Pág. 58

También es muy utilizado el método de filtración por membrana para el recuento de bacterias coliformes totales y fecales. Es un método altamente reproducible, puede usarse para analizar volúmenes de muestra relativamente grandes y se obtienen resultados en menor tiempo que con el NMP. Sin embargo, no puede aplicarse a cualquier tipo de muestra y tiene sus limitaciones. También se encuentra entre los métodos estándar. A los efectos de la filtración por membrana debe replantearse la definición de coliformes: bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos, que dan colonias oscuras con brillo metálico en medio Endo, luego de 24 hs. de incubación a 35ºC. La determinación de coliformes fecales por filtración puede hacerse a partir de las colonias desarrolladas en Endo o directamente incubando la membrana en medio m-FC e incubando a 44,5ºC. Para la detección simultánea de coliformes totales y Escherichia coli se puede utilizar la prueba de sustrato enzimático. En este caso el grupo de coliformes totales se define incluyendo todas las bacterias que presentan la enzima beta-D-galactosidasa, que hidroliza el sustrato cromogénico (por ejemplo, ONPG) liberando el cromógeno. Como E. coli se incluyen todas las bacterias que dan positiva la reacción de coliformes totales y que tienen actividad beta-glucuronidasa, que hidroliza el sustrato fluorogénico (por ejemplo, MUG), liberando el fluorógeno. También se usa como indicador de contaminación fecal el grupo Estreptococos fecales que incluyen especies de Estreptococos grupo D de Lancefield (Enterococcus faecalis, E. faecium, Streptococcus equinus, S. bovis) y algunas subespecies y una especie del grupo Q (Streptococcus avium). El grupo Enterococos estaría incluído dentro de estreptococos fecales y comprende las especies Enterococcus faecalis y E. faecium y sus subespecies (origen humano) y también se usa como indicador de contaminación fecal en agua. El hábitat normal de los estreptococos fecales es el intestino del hombre y los animales de sangre caliente, por lo tanto son indicadores de contaminación fecal, sobre todo en muestras de lagos, estuarios, ríos, etc. La identificación de las especies puede proporcionar información sobre la fuente de contaminación debido a que algunas especies son específicas de sus huéspedes; por ejemplo, una predominancia de S. bovis o S.equinum indicaría una contaminación por heces no humanas. El recuento de heterótrofos totales consiste en un método estandarizado para determinar la densidad de bacterias heterótrofas, mesófilas aerobias y anaerobias facultativas en el agua. Así se obtiene información útil que se estudia junto con el índice de coliformes; también se le usa para controlar un proceso de tratamiento de agua o para verificar la calidad del agua tratada, luego de recorrer toda la red de distribución. También interesa estudiar la presencia o el recuento de Pseudomonas aeruginosa en distintos tipos de agua (potables, recreacionales, de industrias, etc.) Otro grupo de indicadores que ha comenzado a utilizarse en aguas lo constituyen los colifagos. Los colifagos son bacteriófagos de coliformes que se encuentran siempre que haya coliformes totales y fecales. De acuerdo a estudios de correlación entre número de colifagos y coliformes en agua, se podría utilizar el índice de colifagos como índice de calidad sanitaria de agua. Además, como son más resistentes a la cloración que los coliformes, pueden ser mejores indicadores de desinfección que éstos últimos. El método de enumeración se basa en la formación de playas de lisis. Los colifagos (bacteriófagos) infectan y se multiplican en bacterias sensibles a ellos. Esto provoca la lisis celular de esas bacterias y liberación de partículas virales que infectarán a las células bacterianas adyacentes. A medida que éstas bacterias se vayan lisando, se formarán zonas claras, conocidas como “playas de lisis”, entre el crecimiento confluente de la bacteria utilizada. La cepa utilizada en los ensayos es

Pág. 59

una cepa de E. coli sensible a la infección por colifagos (ATCC 13706). La metodología empleada está descripta en el “Standards Methods for the examination of water and wastewater". BIBLIOGRAFÍA Los métodos de referencia para los análisis antedichos se pueden encontrar en: - "Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater", APHA-AWWA-WPCF, 20th Ed. Normas UNIT: 856-91, 857-91, 858-91, 893-91, 894-91, 942-93, 943-93. Normas ISO (varias) Las normas vigentes en nuestro país respecto a la calidad microbiológica de los diversos tipos de agua se pueden encontrar en: - Normas de calidad de agua potable...…………… OSE - Reglamento Bromatológico Nacional …………… Ordenanza P.E. 315/94 - Ordenanza Bromatológica Municipal ...................I.M.M (Decreto 27235) - Norma 833/90....................………………………...UNIT - Decreto 253/79 (12/89).....…………………...........Poder Ejecutivo - Decreto 16235 (1974)....…………………..............Junta de Vecinos de Montevideo

Para el análisis de diferentes tipos de muestras, y los límites aconsejados se puede consultar: - Standard Methods for the examination of Dairy Products", APHA, 16 th Ed., 1992. - U.S. Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual, AOAC,Gaithersburg, MD, 8th ed., 1995.. - Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 16th Ed., 1995. - Microorganisms in foods 1 & 2" ICMSF. - USP 28. - Reglamento Bromatológico Nacional - Normas UNIT (varias) - Ordenanza Bromatológica Municipal (IMM) - Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 1992, 3rd Ed. - Farmacopea Europea y suplementos - Normas ISO (varias)

Pág. 60

EJERCICIOS DE RECUENTOS 1) Se realiza un recuento en placa de una muestra sólida por siembra incorporada de 0,5 mL en cada placa en VRBA de las diluciones que se indican. Se incuba 24 hs a 35 ºC. Se cuentan las colonias rojas desarrolladas. Informe claramente los recuentos para los siguientes resultados:

Muestra

Dilución sembrada y número de ufc 10-2

10-3

10-4

1

0

0

0

2

190

28

0

3

> 300

114

9

4

5

0

0

2) Se realizaron recuentos por NMP en dos muestras de gelatina en caldo lauril triptosa. Se sembraron tres tubos por dilución, (1 mL de dilución por tubo) y se incubó a 35ºC durante 48 horas. ¿Cómo informaría los recuentos si obtuvo los siguientes resultados?:

Muestra

Dilución sembrada y tubos positivos 10-2

10-3

10-4

A

3/3

1/3

0/3

B

3/3

3/3

3/3

3) Diseñar un método de recuento para cada uno de los siguientes casos: a) Determinar la aceptación o rechazo de una muestra de carne a la que se le acepta un límite de S aureus de 104 /g. b) Determinar la aceptación o rechazo de una muestra de harina a la que se le exige menos de 100 microrganismos aerobios mesófilos por gramo.

4) En una muestra de almidón se exige una carga bacteriana menor de 105 /g. ¿Cuál de los siguientes métodos utilizaría para el análisis y cuáles no? Fundamente su elección y diseñe el o los experimentos (diluciones a sembrar, medios, temperatura y tiempo de incubación). Recuento en placa Recuento microscópico directo NMP Turbidimetría 5) Explique que método (volúmenes a sembrar, medios, temperatura y tiempo de incubación) utilizaría para hacer el recuento de coliformes en agua potable si la exigencia es de 0/100 mL.

Pág. 61

6) Se realizó el recuento en una muestra de agua de pozo por filtración. Se filtraron 10mL de la dilución 1/10 (-1), se colocó la membrana en una placa de TSA y se incubó por 48hs, se contaron 30 colonias en la placa. ¿Cómo se expresa el resultado?

7) ¿Cómo informaría el recuento por NMP de las siguientes muestras de agua de playa con los siguientes resultados? Muestra 1. (se sembró 1 mL de cada dilución se incubaron los tubos a 35°C por 48 hs.) Dilución sembrada y tubos positivos

Medio

-1

-2

-3

CLT

3/3

3/3

2/3

CLBVB (subcultivo)

1/3

0/3

0/3

Muestra 2. (se sembró 1 mL de cada dilución se incubaron los tubos de CLT a 35°C por 48 hs. y EC a 44,5 °C por 24 hs.) Dilución sembrada y tubos positivos

Medio

-2

-3

-4

CLT

2/3

1/3

0/3

EC (subcultivo)

0/3

0/3

0/3

8) Las normas vigentes para la calidad microbiológica del pescado fresco indican: n= 5, c=3, m=106 M=107 Heterótrofos mesófilos. n= 5, c=3, m=104 M=106 Heterótrofos psicrófilos. n= 5, c=3, m=103 M=2x103 Staphylococcus aureus. n= 5, c=3, m=4 M=400 Coliformes fecales. ¿Cómo haría cada recuento? Especificar el método, las diluciones, medios de cultivo y temperatura de incubación.

9) Las normas de calidad microbiológica de un producto farmacéutico líquido de uso oral indican: un límite de 500 ufc/mL para bacterias heterótrofas. Se realiza el recuento del producto en TSA de dicho producto (que contiene parabenos) sembrando 1 mL (incorporado) de las diluciones que se indican y se obtienen los siguientes resultados: Dilución sembrada y número de ufc 0

-1

-2

3

40

5

De acuerdo a estos resultados ¿qué puede concluir?

Pág. 62

Se realiza la validación del procedimiento expuesto en el ejercicio anterior. Para ello se prepara una suspensión de un cultivo de E. coli . Se realiza el recuento de esta suspensión de E. coli y se obtiene: Recuento en placa (TSA) en superficie (0,1mL)

Dilución sembrada y número de ufc -5

-6

-7

358

70

6

Para realizar la validación, se inocula 1 mL de la dilución –7 de la suspensión de E. coli preparada anteriormente y se agrega a cada una de las placas sembradas con las diluciones del producto líquido (0, -1 y -2) y se obtiene el siguiente resultado: Dilución sembrada de producto (+ suspensión) y número de ufc 0 -1 -2 55

113

75

¿Se considera el método validado? ¿Qué recomendaciones haría para analizar esta muestra? ¿Podría utilizar otro método?.

Pág. 63

MUESTREO PARA ANALISIS MICROBIOLOGICO

La primera etapa del análisis microbiológico es la extracción de la o las muestras de un lote y cualquier resultado carece de significado si la muestra no ha sido apropiadamente tomada. Es responsabilidad del laboratorio de control constatar que la muestra que se analizará es representativa del lote y rechazarla antes de realizar el análisis si se tiene indicios de que no lo es. Generalmente en los textos especializados se describen los protocolos para el muestreo en las áreas clínicas, de alimentos, de aguas y de medicamentos y es necesario referirse a ellos en primera instancia. Aquí señalaremos algunas consideraciones generales aplicables a las tres últimas áreas. El lote es el número de unidades o la cantidad de un producto que ha sido sometido a las mismas condiciones durante un proceso determinado. Esta es una consideración teórica puesto que es difícil asegurar la uniformidad durante la mayoría de los procesos conocidos. Por ej. en una esterilización por vapor no todas las zonas del autoclave alcanzan la misma temperatura, sin embargo se considera que todos los recipientes sometidos a ese proceso en esa instancia constituyen un lote. Se considera que una muestra o un conjunto de muestras son representativas de un lote cuando reflejan, tanto como sea posible, la totalidad del lote. Para determinar que la muestra es representativa y que no se ha alterado después de la extracción deben tenerse en cuenta las etapas de: recolección, transporte y preparación para el análisis propiamente dicho. 1) Recolección Los planes de muestreo determinan el número, tamaño y zonas de recolección de la muestra. Se diseñan por criterios estadísticos teniendo en cuenta además algunas características del producto tales como: - riesgo potencial para el consumidor, si el riesgo es alto se aumentar el número de muestras para dismimuir la probabilidad de que llegue al consumidor una muestra contaminada - facilidad de homogeneizar el lote. Si la producción es en batch y el producto es fácilmente mezclable, como un líquido, se requiere menor número de muestras que si no lo es; si el lote es un conjunto de unidades y se presume que no es de calidad uniforme entonces se extraerán muestras de los puntos donde se supone que la calidad es inferior los cuales se denominan puntos críticos (en el ejemplo del autoclave éstos serían las zonas donde se alcanza menor temperatura). A su vez deber considerarse la homogeneidad dentro de la unidad o envase, p.ej. en un alimento congelado hay un gradiente de temperatura durante el proceso de enfriamiento de tal manera que la zona central es la que tarda mas tiempo en alcanzar la temperatura de congelamiento. - posibilidad de controlar y registrar el tratamiento al cual ha sido sometido el producto; cuanto mayor sea la seguridad de que el tratamiento ha sido correcto para la totalidad del lote, se requiere menor número de muestras. Debe tenerse en cuenta que el aumento del número de muestras está restringido por el costo del análisis y porque existe un límite por encima del cual no hay un aumento significativo de los intervalos de confianza.

Pág. 64

La muestra se extrae de unidades cuyo envase externo esté inalterado. La extracción se realiza en forma aséptica para evitar la contaminación de la muestra y del resto del contenido del envase. La muestra debe identificarse con un número, fecha, origen, contenido e iniciales del extractor. 2) Transporte Para un producto almacenado en batch la muestra se toma y transporta en recipientes previamente esterilizados y herméticos. El transporte se realiza de acuerdo a las condiciones de almacenamiento. Si es un producto alterable debe transportarse refrigerado (0º-4ºC) por no mas de 24hs. Si se trata de un alimento congelado debe conservarse a la temperatura de congelamiento. El recipiente de transporte no debe llenarse completamente (hasta un 75% de su capacidad) para permitir homogenizar. 3) Preparación para el análisis Se debe realizar la observación macroscópica de la muestra y del envase de transporte y registrar cualquier particularidad. Se procede a la homogeneización de la muestra mediante manipulación aséptica. Si es un sólido o una pasta se diluye en buffer o agua peptonada estériles y se mezcla en una licuadora o en bolsas de plástico previamente esterilizados. Si es un producto oleoso (p.ej. una pomada) se termostatiza en el diluyente a 35ºC para lograr una emulsión. Si el análisis se realizará por filtración es necesario disolver el producto en un solvente orgánico inocuo para los m.o. (p.ej.miristato de isopropilo). Para alimentos se recomienda que la toma no sea inferior a 10 g y que la relación con el diluyente sea 1:10. Esta dilución debe prepararse inmediatamente antes del análisis. APLICACIONES. I) Muestreo de equipos y utensilios. Se puede realizar por varios métodos: a) Enjuagado: consiste en enjuagar el equipo con un volúmen medido de medio de cultivo o de buffer, el cual es sometido al análisis microbiológico. b) Contacto de superficie: consiste en pasar un hisopo embebido en buffer por un área determinada del equipo y posteriormente descargar el hisopo en un volúmen medido de diluyente el cual es analizado. Este método es recomendado para zonas de difícil acceso, en cambio para áreas planas se recomienda el contacto directo de la superficie a analizar con un cilindro de agar del diámetro de una placa de Petri el cual se corta asápticamente, y se expresa el resultado por área de contacto (Replicate Organism Direct Agar Contact Plates). c) Inmersión: los utensilios se sumergen en un volúmen determinado de diluyente y se determina el número de m.o. por unidad. II) Muestreo de aire. a) Sedimentación: se exponen placas de agar durante 15' a 2h dependiendo de la contaminación del área a analizar. Se detectan sólo los m.o. que están adheridos a partículas sedimentables.

Pág. 65

b) Impacto: se hace pasar un volúmen determinado de aire mediante aplicación de vacío a través de una serie de tamices que retienen distinto tamaño de partícula. Los tamices son incubados sobre agar y se puede determinar el número de m.o. asociados a partículas de distinto tamaño. c) Impregnación de líquidos: consiste en hacer burbujear un volúmen determinado de aire a través de un diluyente estéril el cual retiene los m.o. presentes.

Bibliografía - Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. APHA (American Public Health Association), 1976. Ed.Spceck,M. - Microorganismos in Foods 2: Sampling for microbiological analysis, Principles and specific applications. ICMSF (International commision on Microbiological Specifications for Foods), 1974. Ed. Ingram,M. - Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater APHA, 1976. 14th. ed. Ed.Rand,M.

Pág. 66

VALIDACIÓN CONCEPTOS Validar un proceso cualquiera significa verificar que el procedimiento seguido es el adecuado para obtener el fin propuesto. Por ejemplo para validar un proceso de llenado aséptico de ampollas inyectables se prepara un lote en el que se sustituye el producto con medio de cultivo. Se incuba entonces las ampollas y se observa si hay o no crecimiento, lo que validará o no, el procedimiento de llenado. Para validar un proceso de esterilización de un producto en un envase dado, se prepara un lote de envases llenos con medio de cultivo inoculado con una cepa adecuada. Luego del ciclo de esterilización se incuba y se observa el crecimiento. Este concepto se puede aplicar a un proceso analítico. Por ejemplo, si se busca yodo en una sal de mesa, se ensaya la técnica de análisis en una muestra adicionada de determinada cantidad de yodo demostrando así que con la técnica empleada se puede detectar el yodo en la concentración buscada. El concepto de validación es de especial interés en el análisis microbiológico. Validar la búsqueda de un m.o. en determinada cantidad de una muestra dada, significa demostrar que si hubiera estado presente dicho m.o. en determinada concentración, se hubiera encontrado con la técnica empleada. Validar el recuento de m.o. en una muestra determinada, significa demostrar que si hubieran estado presentes en determinado número, se hubiera determinado ese número por el método aplicado PROCEDIMIENTO DE VALIDACION Para validar los procedimientos en si mismos, se parte del medio de cultivo de enriquecimiento (en el caso de una búsqueda) o del disolvente inicial (si se trata de un recuento) inoculado con el m.o. adecuado. Para validar la aplicabilidad de dicho procedimiento a una muestra dada se parte de la muestra en cuestión inoculada con el m.o. que se desee. Teóricamente, se debe validar para cada m.o. que se busque o se quiera contar. Como no siempre esto resulta práctico, se pueden seleccionar uno o dos m.o. que se consideren representantes de los distintos grupos fisiológicos. Por ejemplo, al efectuar un test de esterilidad se recomienda validar con un m.o. esporulado, una levadura, y un m.o. anaerobio el medio tioglicolato y con un m.o. esporulado y una levadura el medio TSB. ¿Qué número de m.o. se agrega? Dependerá de la sensibilidad exigida al método que a su vez es función de la muestra. En general debemos pensar que si las muestras fueron sometidas a alguna condición drástica, por ejemplo calor, si los m.o. están presentes lo estarán en bajo número. Por lo tanto, se debe demostrar que el procedimiento empleado es capaz de recuperar m.o. aún si se encuentran en bajo número. Al validar un procedimiento de búsqueda habitual (con 10 g de muestra en 90 mL de caldo de enriquecimiento) se suele agregar de 10 a 100 células del m.o. adecuado. INTERPRETACION DE RESULTADOS a) Se considerará que el procedimiento de búsqueda o recuento está validado si se detecta el m.o. o se determina en el número esperado con la técnica en cuestión. b) Si se detecta el m.o. empleando la técnica sobre la muestra inoculada se concluye que el procedimiento en cuestión es aplicable a dicho tipo de muestra. En caso de obtener resultados negativos en a) hay que analizar cada paso del procedimiento Pág. 67

seguido, medios de cultivo empleados, condiciones de incubación, etc. En general, estos factores están bajo control en un laboratorio de rutina, y se emplean procedimientos ya descriptos. Es más frecuente el caso de que no valide b), o sea que un procedimiento ya descripto en la bibliografía y válido en si mismo no resulta adecuado para determinado tipo de muestra. La causa más frecuente de no validación es la presencia de poder inhibitorio en la muestra analizada. Es decir la muestra presenta la propiedad de inhibir el desarrollo de m.o., ya sea por contener agentes conservadores, declarados o no, por su pH u otros motivos. Se debe estudiar entonces, hasta donde sea posible, la composición de la muestra. Si se conoce la presencia de conservadores se debe eliminar su acción. Esto se puede conseguir de tres maneras fundamentales: a) Por neutralización química, esto es, agregando una sustancia capaz de anular la acción del agente antimicrobiano. Por ejemplo la acción de penicilinas puede neutralizarse empleando ßlactamasas.

Agente inhibidor Hipoclorito Yodo Parabenos Comp. amonio cuaternario Comp. mercuriales

Neutralizante Tiosulfato de sodio Tiosulfato de sodio Tween Tween + lecitina Tioglicolato o cisteina

b) Por dilución, llevándolos a concentraciones subinhibitorias. Esto se consigue disminuyendo la toma de muestra o aumentando el volumen del medio inicial. c) Por filtración, removiendo mecánicamente el conservador. Se efectúa la filtración por membranas con un tamaño de poro definido que retendrán los m.o. Su uso se limita a muestras líquidas o solubles.

BIBLIOGRAFIA - USP XXII, Microbial Limit Tests. Preparatory Testing, p.1479. - USP XXII, Sterility Tests. Growth Promotion Test Bacteriostasis and Fungistasis, p.1484 -European Pharmacopeia.1997.pag 84 - British Pharmacopeia, 1988. Test for Microbial Contamination. Validity of the test for especified microorganisms and Validity of the counting methods, Apendix XVI B - Microbial Applications of the Inactivation of Antimicrobial Agents, A.D. Russell and col., review of the Journal of Applied Bacteriology, 1978.

Tabla II extraída del artículo: “Biochemical Identification of New Species and Biogroups of Enterobacteriaceae Isolated from Clinical Specimens”. Journal of Clinical Microbiology, Jan. 1985, p. 46-76 Vol. 21, No. 1. J. J. Farmer et al.

Pág. 68

Pág. 69

Tabla III, Índice de NMP y límite de confianza del 95% para varias combinaciones de resultados positivos para una serie de 3 tubos cada uno con 0,1, 0,01 y 0,001 g ó mL de muestra. Combinación de tubos positivos 0-0-0 0-0-1 0-1-0 1-0-0 1-0-1 1-1-0 1-1-1 1-2-0 2-0-0 2-0-1 2-1-0 2-1-1 2-2-0 2-2-1

NMP/g ó mL 2400

Límites de confianza del 95% Inferior Superior 4 120 7 130 15 380 7 210 14 230 30 380 15 380 30 440 35 470 36 1300 71 2400 150 4800 -

Pág. 70

Tabla IV. Índice de NMP y límite de confianza del 95% para varias combinaciones de resultados positivos para una serie de 5 tubos cada uno con 0,1, 0,01 y 0,001 g ó mL de muestra. Límites de confianza del 95% Combinación de tubos positivos 0-0-0 0-0-1 0-1-0 0-2-0 1-0-0 1-0-1 1-1-0 1-1-1 1-2-0 2-0-0 2-0-1 2-1-0 2-1-1 2-2-0 2-3-0 3-0-0 3-0-1 3-1-0 3-1-1 3-2-0 3-2-1 4-0-0 4-0-1 4-1-0 4-1-1 4-1-2 4-2-0 4-2-1

NMP/g ó mL

Inferior

Superior