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• Jesús Adrián Gómez Ortiz

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 La

catalasa es una enzima que descompone el peróxido de Hidrógeno en oxígeno y agua(El peróxido de Hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono).  Químicamente la catalasa es una hemoproteína de estructura similar a la de la hemoglobina, Excluyendo los estreptococos, la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa.

 La

prueba de catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos es comúnmente utilizada para diferenciar estreptococos (negativos) de estafilococos (positivos)

 Medios

y reactivos  1.- Cultivo de 24 horas del microorganismo en un medio no selectivo y que contenga sangre  2.- Peróxido de Hidrógeno al 3% (diluir la solución de 30% con agua destilada)

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Prueba en portaobjetos 1.- Transferir con asa células del centro de una colonia bien aislada a la superficie de un portaobjetos en que se colocó una pequeña gota de agua. Emulsionar bien 2.- Añadir 1 o 2 gotas de peróxido de Hidrógeno al 3%. Se recomienda no añadir el organismo al reactivo, especialmente si se utilizan asas que contengan hierro, ya que se pueden producir falsos positivos Prueba en tubos o placas de agar Añadir unas gotas de peróxido de Hidrógeno al 3% directamente sobre la superficie de una placa o tubo de agar donde se ha desarrollado un cultivo puro del organismo en estudio

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1.- Prueba cualitativa: la rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas o efervescencia indica una prueba positiva. Dado que algunas bacterias pueden poseer enzimas distintas de la catalasa capaces de descomponer el peróxido de Hidrógeno, unas pocas burbujas diminutas formadas a los 20 a 30 segundos no se considera una prueba positiva 2.-Prueba semicuantitativa: las determinaciones cuantitativas de catalasa se llevan a cabo más comúnmente en la identificación de mico bacterias. Se mide la altura que alcanza la formación de burbujas de gas en el tubo, luego añadir el peróxido de Hidrógeno. Una columna de burbujas de 50mm o más, se considera una reacción fuertemente positiva.

CITOCROMO OXIDASA

Fundamento 

Los citocromos son Hemoproteinas y actúan como el ultimo eslabón de la cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (Hidrogeno) al oxigeno, con formación de agua. El sistema citocromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de Oxidasa es importante para identificar aquellos organismos que carecen de esta enzima

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La prueba es muy útil para diferencia Enterobacterias (Todas Oxidasa negativas) de otras especies como Pseudomona o Neisserias oxidasa positiva.

Reactivos 

Medios y reactivos

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1. Cultivo de 24 horas del microorganismo, en un medio libre de colorantes que pueda interferir en el ensayo, en un medio no selectivo.

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2. Solución al 1% de diclorhidrato de dimetil-p-fenilendiamina (producto de color rosado), o clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (producto de color azul), recién preparada.

Procedimientos 

La prueba puede realizarse por 2 métodos:

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1) Técnica directa en placas, en la cual se añaden directamente 2 a 3 gotas de reactivo a las colonias aisladas que desarrollan en placas.

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2) Técnica indirecta en tiras os discos de papel, en la que se añaden unas gotas de reactivo a una tira de papel de filtro (colocada en una placa de Petri limpia) y se extiende luego un ansa de la colonia sospechosa. Se debe realizar un control negativo del asa ya que ésta puede producir falsos positivos.

Interpretación 

Cuando se utiliza el reactivo tetrametil-p-fenilendiamina:

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Se considera el ensayo como positivo cuando aparece un color azul profundo en un tiempo menor a 10 seg. Se considera positivo lento a confirmar cuando el color aparece entre 10 y 60 seg. Y se considera negativo cuando no hay desarrollo de color o cuando se produce en un tiempo mayor a 60 seg.

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Cuando se utiliza el reactivo dimetil-p-fenilendiamina:

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Se considera el ensayo como positivo cuando aparece un rosado a fucsia en un tiempo de aproximadamente 2 minutos.

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Controles

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Positivo: Pseudomonas aeruginosa

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Negativo: Escherichia coli

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Limitaciones



El ensayo en placa es menor sensible que el ensayo en papel de filtro, por lo que un ensayo negativo utilizando el primer método debe compararse con el segundo. El reactivo tetrametil-p-fenilendiamina es más estable durante el almacenamiento y más sensible a la detección de citocromo oxidasa.

Prueba de Oxidación-Fermentación (O/F)

Medio de cultivo: -

Medio básico de Hugh Leifson, medio O/F.

Componentes: -

Peptona Cloruro de sodio Fosfato de potasio Hidratos de carbono (glucosa, sacarosa, lactosa, maltosa) Agar Agua destilada Indicador de pH: azul de bromotimol • Ácido: color amarillo (pH=6) • Alcalino: azul de Prusia intenso (pH=7.6) • Medio no inoculado: verde (pH=7.1)

Se deben tener dos tubos para esta prueba, uno sin sello y otro con sello de parafina

Fundamento Determina el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono Consistencia del medio Semisólido (también permite la observación de la movilidad)

Inoculación Picadura, inoculo poco denso. Picar ambos tubos aproximadamente hasta 0.6 mm de fondo. Condiciones de incubación Tiempo: 18-24 hrs Temperatura: 35 – 37 °C

Resultados



Es utilizado para diferenciar microorganismos especialmente Salmonella sp, basado en la descarboxilación y desanimación de la lisina y en la producción de ác. Sulfhídirco.

La peptona y el extracto de caseína aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano.  La glucosa es el carbohidrato fermentable  La lisina es utilizada para detectar a enzimas descarboxilasas y desaminasas.  El citrato de hierro y amonio y el tiosulfato de sodio son los indicadores de la producción de ác. sulfhídrico. 

Indicador: Purpura de bromocresol; a pH de 5.2 o menos es amarillo y a pH igual o mayor de 6.8 su color es violeta.  Los microorganismos fermentables de glucosa acidifican el medio y producen un vire del color violeta al amarillo 

PRUEBA BIOQUÍMICA MIO ARELY NATHALIE CABRERA GRANADOS.

MOVILIDAD, INDOL Y ORNITINA: MIO • Composición: • Consistencia del medio: semisólido en forma vertical.

• Inoculación: por picadura, en forma vertical.

• Condiciones de incubación: Tiempo: 24-8 hrs Temperatura 35- 37 °C

FUNDAMENTO. • Medio de cultivo semisólido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y tripteína. Además, la tripteína aporta grandes cantidades de triptofano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la detección de la enzima ornitina descarboxilasa, el púrpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color púrpura y en medio ácido es amarillo.

FUNDAMENTO. • El medio MIO se utiliza para la identificación de Enterobacterias. Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo:

• Movilidad. • La producción de ornitina descarboxilasa. • Produccion de indol.

DESCARBOXILACIÓN DE ORNITINA. •

Mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido (ornitina) para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad.

•

La descarboxilación es el proceso mediante el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas especificas son capaces de atacar a los aminoácidos en su grupo carboxilo dando una amina o una diamina y anhídrido carbonico.

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La descomposición de los aminoácidos se produce anaeróbicamente. El proceso de descarboxilación es irreversible, no oxidativo y requiere una coenzima: fosfato de piridoxal.

• La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio. Debido a la fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo una condición ácida y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones óptimas para la actividad de la enzima ornitina descarboxilasa, la cual descarboxila la ornitina presente.

• Por descarboxilación, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color púrpura.

MICROORGANISMOS ORNITINA POSITIVOS:  Especies de enterobacter  Proteus mirabilis.  Proteus morganii  Yersinia enterocolitica

MICROORGANISMOS ORNITINA NEGATIVOS:  Especies de klebsiella  Enterobacter aglomerans  Proteus vulgaris  Proteus rettgeri  Yersinia pestis  Yersinia pseudotuberculosis.

PRUEBA DE PRODUCCIÓN DE INDOL. • El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa.

• La prueba se basa en la formación de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído de p-dimetilaminobenzaldehido (sustancia activa del reactivo de Kovacs), el cual indica un resultado positivo.

• La formación de indol se produce solamente en aquellos organismos capaces de fermentar los hidratos de carbono.

• El agregado de tritofano estimula la producción de indol ya que es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias, formando el mismo.

• Mientras que la glucosa la inhibe, debido a la elevada acidez producida por la fermentación de la glucosa.

MOVILIDAD. •

Determina si un organismo es móvil o inmóvil. La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas allá de la línea de inoculación.

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Generalmente se consideran móviles a los bacilos con flagelos e inmóviles a los cocos.

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Las bacterias móviles pueden contener un solo flagelo o muchos. A veces las bacterias con movilidad producen variantes no móviles que parecen ser estables y raramente se revierten en formas móviles. Los organismos no móviles carecen de flagelos.

RESULTADOS. • 1-Movilidad: -Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá de la línea de siembra. -Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra.

• 2-Ornitina decarboxilasa: -Resultado positivo: color púrpura. -Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del medio. 3-Prueba del indol: La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina. -Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador. -Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.

APLICACIONES DE LA PRUEBA BIOQUÍMICA MIO.

SUGERENCIAS. • Se leen las reacciones de movilidad y de ornitina descarboxilasa antes de agregar el reactivo de kovacs para la prueba de indol.

• Para la prueba de indol adicionar 5 gotas de reactivo de kovacs y agitar suavemente el tubo. Interpretar inmediatamente. La reacción positiva después de 24 hrs indica una prueba completa, si el cultivo de 24 hrs es negativo deberá incubarse otras 24 hrs y repetirse la prueba.

BENEMERITA UNIVERSIDAD AUTONOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS LICENCIATURA EN FARMACIA ALUMNA: ANA PAOLA GONZÁLEZ LÓPEZ PROFESORA:REYNA DEL CONSUELO ALMIRAY PINZÓN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

COAGULASA

La coagulasa es una proteína producida por varios microorganismos que permiten la conversión del fibrinógeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distinguir entre diferentes tipos de STAPHYLOCOCCUS.

*FIBRINOGENO(ES UNA PROTEINA SOLUBLE DEL PLASMA SANGUINEO PRECURSOR DE LA FIBRINA,ES RESPONSABLE DE LA FORMACION DE COAGULOS DE SANGRE).

Un resultado de la coagulasa positivo indica que la muestra contiene STAPHYLOCOCCUS AUREUS .Esta proteína también es producida por YERSINIA PESTIS.(bacilo Gram negativo anaerobio facultativo y patógeno primario, del género Yersinia, que produce en el ser humano la peste pneumónica, la peste bubónica y también la peste septicémica, aunque la última es muy poco común.)

FUNDAMENTO Detecta un factor de agregación “clumping factor” en la superficie de la bacteria.Esta prueba se usa para diferenciar especies dentro del genero staphylococcus.La prueba de la coagulasa se usa para identificar s.aureus y con frecuencia se usa para indicar virulencia o patogenicidad.

PROCEDIMIENTO Se coloca una colonia sospechosa de pertenecer una especie de staphylococcus y se emulsifica en una gota de plasma de conejo.

• S. aureus posee dos tipos de coagulasa: • a) Una endocoagulasa o coagulasa ligada o clumping factor, que está unida a la pared celular.Esta actúa directamen te sobre el fibrinógeno provocando la formación de coágulos o grumos cuando se mezcla una suspensión bacteriana con plasma citratado (test en lámina). • b) Una exocoagulasa o coagulasa libre que actúa mediante la activación de un factor sérico (CRF), formándose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibrinógeno produciéndose un coágulo de fibrina (test en tubo).Mientras el test en tubo es definitivo, el test en lámina nos sirve como una rápida y económica técnica de tamizaje (screening). Entre un 10 a 15% de las cepas de S. aureus se mostrarán negativas en el test en lámina, por lo cual en esos casos se hace necesario realizarun test en tubo.

La coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se llama estafilotrombina, y permite que la enzima proteasa convierta el fibrinógeno en fibrina. Esto hace que se coagule la sangre. La coagulasa está estrechamente relacionada con la superficie de la bacteria S. aureus y puede revestir su superficie con fibrina al entrar en contacto con la sangre. Se cree que esta cubierta de fibrina del estafilococo es capaz de resistir la fagocitosis haciendo esta bacteria tenga un factor de virulencia mayor. La coagulasa Bound es parte de una familia más grande de MSCRAMM.

PRUEBA DE LA COAGULASA • La prueba de la coagulasa se usa para diferenciar el Staphylococcus aureus del coagulase-negative staphylococci. S.aureus produce 2 formas de coagualasa (por ejemplo, coagulasa ligada y coagulasa libre). La coagulasa ligada también conocida como "factor de Clumping " se puede detectar mediante la realización de una prueba de portaobjetos y la coagulasa libre con una prueba de coagulasa de tubo.

PRUEBA EN PORTAOBJETOS Prueba del portaobjetos se hace conjuntamente con un control negativo para descartar auto aglutinación. Se ponen 2 gotas de solución salina en el portaobjetos microescópico rotulado con un número de muestra, Test (T) y control (C). Las 2 gotas son emulsionadas con la prueba de organismo mediante el uso de un cable de lazo, cable recto, o un palo de madera. Se pone una gota de plasma (plasma de conejo con anticoagulante (EDTA)acido etilendiaminotetraacetico) en la gota de solución salina inoculada correspondiente a la prueba y se mezcla bien con un una varilla de madera. Agitar el portaobjeto con cuidado unos 10 segundos.

• Si es positivo: Se podrá observar aglutinación macroescopica en el plasma en los 10 segundos mientras que no se observara aglutinamiento en la gota de solución salina. • Si es negativo: No se observara aglutinamiento. • NOTA: Si la prueba de la coagulasa de portaobjetos fuera negativa, deberìa hacerse una prueba de tubo como confirmación. El aglutinamiento en las dos gotas es un indicativo de auto aglutinación y por lo tanto debemos descartar la prueba de tubo.

PRUEBA DE TUBO DE ENSAYO • La prueba se utiliza plasma que ha sido inoculado con una colonia de staphylococcal (por ejemplo, con un coco Gram positivo catalasa positivo). Luego el tubo se incuba a 37 grados Celsius en 1½ horas. Si es negativo entonces continuamos la incubación por unas 18 horas.

• Si sale positivo (por ejemplo, la colonia problema es S. aureus), el suero coagulará,dando como resultado un coágulo (a veces el coágulo esta tan desarrollado que el líquido se solidifica completamente). • Si sale negativo, el plasma permanece líquido. Un resultado negativo podría indicar que se podría tratar de S. epidermidis pero solo con unas pruebas más precisas se puede confirmar este hecho, como por ejemplo el API o métodos de BBL CRYSTAL.

CONCLUSION Permite diferenciar Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) del resto de especies de Staphylococcus (coagulasas negativos). La técnica en tubo detecta coagulasa libre y ligada. Mecanismo de acción de la coagulasa libre: procoagulasa (enzima extracelular bacteriana) reacciona con un factor activador presente en el plasma sanguíneo similar a la protrombina, dando lugar a un complejo análogo a la trombina (coagulasa propiamente dicha) que reacciona con fibrinógeno formando un coágulo de fibrina en ausencia de Ca2+. La coagulasa ligada o factor de agregación actúa directamente sobre el fibrinógeno y lo convierte en fibrina. No requiere la presencia de activadores plasmáticos.

UREA  INTRODUCCIÓN:

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 La urea es una diamida del ácido carbónico con la formula CO(NH2)2.  Todas las amidas son fácilmente hidrolizadas con liberación de amoniaco y dióxido de carbono.  La urea constituye la fracción de nitrógeno no proteico más importante en la mayoría de los líquidos biológicos. En el hombre es el principal producto final del metabolismo proteico. Se produce en el hígado y es excretada por la orina a través de los riñones.  La ureasa descompone específicamente la urea produciendo dióxido de carbono y amoníaco. Este reacciona en medio alcalino con salicilato e hipoclorito para dar indofenol color verde.

 Principio:  La ureasa es una enzima que poseen muchas especies de microorganismos que pueden hidrolizar urea de acuerdo con la siguiente reacción química:

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NH2 ----- C----- NH2 + 2H2O 

CO2 + H2O + 2NH3 (NH4)2CO3 Ureasa

 El amoníaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio , produciéndose una alcalinización y un aumento del pH del medio .

 Medios y reactivos:  El caldo urea de Stuart y el agar urea de Christensen son los dos medios más comúnmente utilizados en los laboratorios clínicos para la detección de actividad de ureasa.

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 Técnica:  Inocular el caldo con un asa cargada con el organismo previamente aislado en cultivo puro; estria la superficie del agar con el organismo en estudio .Incubar ambos medios a 35 °C durante 18 a 24 horas.

 Interpretación:  Los microorganismos que hidrolizan urea rápidamente pueden producir reacciones positivas en 1 o 2 horas ; las especies menos activas pueden requerir 3 o más días .

 Las reacciones son:

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 Caldo Stuart: un color rojo en todo el medio indica alcalinización e hidrólisis de urea.  Agar de Christensen:  1.-Degradadores rápidos de urea (Proteus spp.): color rojo en todo el medio  2.-Degradadores lentos de urea (Klebsiella spp.): color rojo inicial solo en el pico y gradualmente abarca todo el tubo.  3.-No hay hidrólisis de urea: el medio conserva el color amarillo original.

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CITRATO:

Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno Agar Citrato de Simmons Medio utilizado para la identificación de enterobacterias.

Fundamento La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7.6

Técnica Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inoculo. Incubar a 35o C durante 4 horas.