1. Elabore una tabla para las siguientes pruebas de ensayo: Nombre Caldo RMVP pH inicial 6.9 ± 0.2 Estado físico,
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1. Elabore una tabla para las siguientes pruebas de ensayo:
Nombre
Caldo RMVP
pH inicial
6.9
±
0.2
Estado físico, color al preparar el medio
Líquido, ámbar claro, transparente sin precipitado.
Siembra y cantidad del inóculo
Inoculación directa por difusión, a partir del cultivo en estudio. Inóculo liviano.
Utilidad
Reacciones de rojo de metilo y acetil-metilcarbinol (VogesProskauer) del grupo Enterobacter.
Caldo con nitrato SIM
T y t de incubación
Reactivos necesarios (g/L)
→Mezcla de peptonas (7) 35-37°C por 4872 hrs.
→Glucosa (5) →Fosfato de potasio (5)
Tiempo máximo de lectura RM: Agregar 5 gotas de RM al 0.04% en 5 mL y observar el color del medio. VP: Agregar a 5 mL del medio una pizca de creatinina más 5 mL de KOH al 40%. La lectura final de hace hasta 4 horas más tarde.
Interpretación
RM:
+→ −→
: Rojo. : Amarillo.
VP:
+→
: Rojo-
rosado.
−→ : Ausencia de color rojo.
35-37°C durante 24-48 hrs. 7.3
±
0.2
Semisólido, ámbar.
Sembrar por picadura ¾ de la longitud del tubo.
Diferenciación e identificación de Enterobacterias y detecta la producción de sulfuros, indol y movilidad de las mismas.
35°C durante 24-48 hrs.
→Peptona de caseína (20) →Peptona de carne (6.1) →FeSO4 y (NH4)2SO4 (0.2) →Tiosulfato de sodio (0.2) →Agar (3.5)
24 hrs luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich (antes adicionar 1 mL de cloroformo).
Móviles: presencia de turbidez o crecimiento más allá de la línea de siembra. Inmóviles: crecimiento en la línea de siembra. SH2 ( +¿ ): ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el medio. SH2 ( −¿ ): el medio permanece sin cambio de color. Indol (
+¿
):
color rojo
→Extracto de levadura (3)
MIO
6.5
± 0.2
Semisólido, púrpura transparente a ligeramente opalescente.
A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, inocular por punción profunda con ansa recta.
Identificación de Enterobacterias en base a su movilidad, actividad de ornitina decarboxilasa y producción de indol.
→Peptona de gelatina (10) 35-37 °C durante 24-48 hrs.
→Peptona de caseína (10) →L-Ornitidina (5) →Dextrosa (1) →Agar (2) →Púrpura de bromocresol (0.02)
Fenilalanina desaminasa
7.3
±
0.2
Sólido en pico de flauta, amarillo ámbar.
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar un inóculo denso estriando la superficie del medio.
Para diferenciar Morganella morganii biogrupo 1 y 2, Proteus spp. y Providencia spp., de la mayoría de otros miembros de la familia
35-37 °C durante 18 a 24 hrs.
→Extracto de levadura (3) →DLFenilalanina (2) →Fosfato disódico (1) →NaCl (5)
___ hrs. Agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich (antes adicionar 1 mL de cloroformo). La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina.
Para revelar, agregar 4-5 gotas de FeCl3 y efectuar la observación dentro de los primeros 5 minutos
Indol ( −¿ ): sin cambio de color. Movilidad: - ( +¿ ): presencia de turbidez o crecimiento más allá de la línea de siembra. - ( −¿ ): crecimiento solamente en la línea de siembra. Ornitina decarboxilasa: - ( +¿ ): color púrpura. - ( −¿ ): color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del medio. Prueba del indol: - ( +¿ ): color rojo al agregar el reactivo revelador. - ( −¿ ): el color del reactivo revelador permanece incoloroamarillento. - ( +¿ ): desarrollo de color verde pálido a intenso en el pico de flauta y en el líquido de condensación. - ( −¿ ): sin cambios de color. El medio
Enterobacteriac eae, en base a la presencia de la enzima fenilalanina desaminasa.
Agar almidón
7.5
±
0.2
Sólido
Inocular por estría cerrada.
Para detectar la hidrólisis de almidón
permanece amarillo debido al color del reactivo cloruro férrico.
→Agar (12)
→Extracto de carne (3) 35-37°C durante 24-48 horas.
→Almidón soluble (10) →Agar (12)
48 horas después de incubar, se cubre la placa con solución de lugol y se lee.
- ( +¿ ): decoloración alrededor del desarrollo (hidrólisis). - (-): color parduzco (no hidrólisis).
2. Elabore una tabla para las siguientes pruebas bioquímicas o medios de ensayo:
Nombre
Caldo rojo de fenol + carbohidratos
Urea de Christensen
Gelatina nutritiva
pH inicial
7.4 ± 0.2
Estado físico, color al preparar el medio Líquido, color rojo
6.8
± 0.2
Sólido en pico de flauta, color amarillo rosado ligero.
6.8
± 0.2
Semisólido
Siembra y cantidad del inóculo
Utilidad
Por difusión de inóculo denso
Para estudios de fermentación de carbohidratos por bacterias.
No punzar el fondo; sirve como indicador. Inóculo denso.
Por punción, inóculo denso.
Para la diferenciación de microorganismo s, bacilos entéricos, basándose en la capacidad de hidrolizar la urea. Para detectar bacterias proteolíticas y para el recuento de gérmenes del agua.
T y t de incubación
35°C durante 18-24 horas
35°C durante 24 hrs y todos los días sucesivos durante 6 días.
35°C durante 24-48 horas.
Indicador de pH
Rojo de fenol
Rojo de fenol
Gelatina
Interpretación del viraje Amarillo: fermentación. Rojo: no hay fermentación.
Púrpura intenso o rojo azulado: Organismos capaces de atacar urea.
Positivo: Licuefacción del medio al colocar los tubos en refrigeración 30 min. NOTA: Si el resultado es
Hugh Leifson (O/F)
TSI
7.1 ± 0.1
7.3 ± 0.2
Semisólido, color verde
Sólido en pico de flauta, color rojo
Por punción, inóculo denso.
Por punción y estría
→ Determinar el metabolismo oxidativofermentativo de las bacterias Gram negativas, al ser suplementado con hidratos de carbono. →Diferenciar especies bacterianas. →Determinar movilidad y producción de gas. Para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.
negativo, incubar 72 hrs y repetir el procedimiento. Oxidación: Tubo abierto: amarillo (+) (ácido). Tubo cerrado: verde (-) 35°C durante 48 hrs. Puede necesitar 3-4 o hasta 14 días de incubación.
35°C durante 18-24 horas
Azul de bromotimol
Rojo de fenol
Fermentación: Tubo abierto: amarillo (+) (ácido con gas) Tubo cerrado: amarillo (+) (ácido/ácido con gas) Sin oxidación o fermentación: Tubo abierto y cerrado: verde/verde-azul (-) A=ácido K=alcalino Pico K/fondo A (pico rojo/fondo amarillo): sólo fermenta glucosa. Pico A / fondo A (pico amarillo/fondo amarillo): fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. Pico K / fondo K (pico rojo/fondo rojo): no fermentador de azúcares.
La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo: producción de gas.
Citrato de Simmons
LIA
6.9 ± 0.2
6.7
± 0.2
Sólido en pico de flauta, color verde
Sembrar en superficie un inóculo ligero, usando una ansa sin arrastrar el agar.
Sólido en pico de flauta, color violeta
Por punción y estría, inóculo poco denso.
Para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía. Para diferenciar microorganismo s, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de H2S.
Ennegrecimiento del medio: producción de H2S → (+): crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. 35°C durante 24-48 horas.
Azul de bromotimol
35°C durante 18-24 horas.
Púrpura de bromocresol
→ (-): el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color. Decarboxilación de la lisina: → (+): Pico violeta/fondo violeta. → (-): Pico violeta/fondo amarillo. Desaminación de la lisina: Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp. Producción de H2S: →(+):Ennegrecimi
ento del medio (especialmente en el límite del pico y fondo)
3. ¿Por qué el medio TSI no debe leerse antes de 18 horas ni después de 24 horas de incubación? Porque habrá oxidación aerobia de los productos de fermentación de la lactosa, de la sacarosa o de ambas y el medio en la parte del agar inclinado terminará por revertir al estado alcalino. 4. ¿Cómo se interpretan los resultados obtenidos a partir del medio TSI?
Pico K/fondo A (pico rojo/fondo amarillo): sólo fermenta glucosa.
Pico A / fondo A (pico amarillo/fondo amarillo): fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.
Pico K / fondo K (pico rojo/fondo rojo): no fermentador de azúcares.
La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo: producción de gas.
Ennegrecimiento del medio: producción de H2S
A= ácido; K= alcalino 5. ¿Cómo se observa la desaminación de la lisina en el medio LIA? Se observa el pico rojizo y el fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp. 6. ¿Por qué es importante leer la prueba de rojo de metilo a las 48 horas de incubación? Porque los productos finales alcanzan niveles detectables con el tiempo. Si los resultados son dudosos a las 48 horas, habrá que repetir las pruebas con los cultivos incubados a 35-37°C durante 4 a 5 días en aerobiosis; en esos casos deben incubarse duplicados de las pruebas a 25°C. 7. ¿Cómo se interpreta la prueba Oxidación-Fermentación? ¿Cómo se reportan los posibles resultados obtenidos a partir del medio O/F de Hugh-Leifson?
Microorganismos oxidativos del hidrato de carbono en estudio: producen una reacción ácida solo en el tubo “abierto”. Presentan poco o nulo desarrollo y ausencia de producción de ácido en el tubo “cerrado”.
Microorganismos fermentadores del hidrato de carbono en estudio: producen una reacción ácida en ambos tipos de tubos.
Microorganismos que no utilizan el hidrato de carbono en estudio: no producen cambios ninguno de los 2 tubos, los cuales permanecen verdes.
Se debe informar: producción de ácido (A), ácido con gas (AG), alcalino (K) o sin cambio (-).
También, puede informarse si el organismo es móvil, cuando crece lejos de la línea de inoculación.
Las reacciones típicas son las siguientes:
9. Si el medio SIM se encuentra totalmente ennegrecido a causa de la producción de H2S ¿Cómo interpretaría la prueba de motilidad?
M (+) / SH2 (-): enturbiamiento del medio. M (+) / SH2 (+): ennegrecimiento de todo el medio. M (-) / SH2 (-): crecimiento solamente en la estría.
M (-) / SH2 (+): precipitado negro alrededor de la estría (pero no ennegrecimiento de todo el medio).
10. ¿Qué importancia tiene la identificación de las bacterias? Cuando se han aislado las bacterias causantes de un proceso infeccioso, éstas deben ser identificadas hasta llegar a GENERO Y ESPECIE, para lograrlo se debe evaluar su actividad bioquímica o metabólica. Del microorganismo aislado dependerá el tipo de tratamiento que debe ser administrado al paciente.