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CARACTERIZACION Y SEPARACION QUIMICA DE LIPIDOS POR CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA

Autores: Ortega Jeinny, Santiago Ligia Corporación Tecnológica De Bogotá, Tecnología En Regencia De Farmacia Bogotá, Colombia 2016 RESUMEN Los lípidos son biomoléculas orgánicas insolubles en el agua que pueden extraerse de las células y de los tejidos mediante disolventes no polares, por ejemplo, el cloroformo, el éter o el benceno. Existen diferentes familias o clases de lípidos, pero las propiedades distintivas de ellos derivan de la naturaleza de la cadena hidrocarbonada de la porción principal de su estructura. En esta práctica se obtiene fosfolípidos de la yema de huevo separados por medio de cromatografía de capa fina La cromatografía en capa fina es un caso de cromatografía de reparto en la que los componentes de una mezcla se separan por diferencia de solubilidad entre dos sistemas disolventes.

INTRODUCCION Los lípidos poseen características comunes entre sí, entre estas cabe destacar la extremadamente baja solubilidad en agua pero muy elevada en solventes orgánicos, la presencia de hidrocarburos de cadena larga en su micelas y también el hecho de que son encontrados en organismos vivos. Las propiedades físicas de los lípidos reflejan su naturaleza hidrofóbica y en este grupo están incluidas sustancias de diferentes estructuras y propiedades físico químicas, incluyendo los triglicéridos, diglicéridos, monoglicéridos, ceras, fosfoglicéridos, esfingolípidos, esteroides, tocoferoles, carotenoides, terpenos e hidrocarburos policíclicos. Las materias grasas en general cumplen una serie de roles en nuestra dieta, además de ser la principal fuente de energía. Son constituyentes normales de la estructura

celular y funciones de la membrana. Son fuente de ácidos grasos esenciales para el organismo animal, donde cabe destacar su papel en la síntesis de las prostaglandinas. Regulan el nivel de lípidos sanguíneos. Son vehículo de vitaminas liposolubles y aportan otros componentes importantes como pigmentos, carotenoides, esteroles, etc. (L. & M. Cox, 2009) Los fosfolípidos constituyen la segunda clase más abundante de lípidos presentes en la naturaleza y se encuentran casi exclusivamente en las membranas celulares de plantas y animales, compuestas del 40 a 50% de fosfolípidos y de 50 a 60% de proteínas. Químicamente, los fosfolípidos están formados por una molécula de glicerol ligada a dos moléculas de ácidos grasos y una cadena conteniendo un grupo fosfato (a menudo un ácido fosfatídico) ligado a una base nitrogenada o un compuesto polihidroxilado,

localizado casi siempre en la posición sn 3 de la molécula de glicerol. Los fosfolípidos en general son aquellos lípidos que contienen ácido fosfórico. En el campo de la ciencia y la tecnología de los alimentos, la expresión suele limitarse a los derivados del ácido glicerofosfórico, que están formados por una molécula de glicerol esterificada en las posiciones 1 y 2 por dos ácidos grasos, con la posición 3 esterificada por un ácido fosfórico que lleva unidas además otras estructuras, dependiendo del fosfolípido de que se trate. De forma genérica se denominan "lecitinas", aunque se considera que la lecitina propiamente dicha es la fosfatidilcolina. Los fosfolípidos son un componente importante de los lípidos de la yema de huevo, lo que explica su buena capacidad como emulsionante. También se encuentra en la membrana del glóbulo graso de la leche (y consecuentemente, en la mantequilla). Los fosfolípidos utilizados como emulsionantes en la industria (lecitinas) suelen proceder del refinado del aceite de soja. FUNDAMENTACION TEORICA Separación de moléculas por cromatografía El estudio y caracterización de las distintas biomoléculas (azúcares, lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc.) requiere en numerosos casos su aislamiento y purificación a partir de mezclas complejas como son los preparados de cualquier material biológico. Una de las técnicas bioquímicas más clásicas y utilizadas para dicho fin es la cromatografía. La cromatografía incluye una amplia gama de técnicas, que se pueden clasificar atendiendo al fundamento físico-químico en el que se basa la separación (cromatografía de

adsorción, de reparto, de cambio iónico, de filtración molecular, hidrofóbica y de afinidad), o al material sobre el que se lleva a cabo (cromatografía en papel, capa fina, en columna y de gases). Para el desarrollo de la cromatografía, las muestras, en un disolvente adecuado, se aplican puntualmente con la ayuda de jeringas, micropipetas o capilares en un extremo de la placa. El volumen de muestra a aplicar es crítico, ya que va a afectar a la resolución (separación de los componentes de una mezcla compleja), y depende de la concentración del compuesto o compuestos de interés en la muestra. Para soluciones concentradas bastará una cantidad muy pequeña (rango de μl) para aplicar suficiente cantidad de los solutos a separar sin llegar a saturar la capacidad de resolución de la placa cromatográfica. Para soluciones muy diluidas, deberá aplicarse un volumen suficiente (de hasta varios ml) para asegurar una cantidad detectable de soluto o solutos de interés. Se determina la posición de cada mancha relativa al frente alcanzado por el solvente, calculándose el correspondiente valor de Rf. La detección de los compuestos una vez realizada la cromatografía se puede llevar a cabo en base a sus propiedades espectroscópicas, fluorimétricas, haciéndolos reaccionar con reactivos específicos, radioisotópicamente, etc. La identificación de tales compuestos se suele realizar comparando sus Rf con los de compuestos de referencia (patrones) de naturaleza química conocida. Alternativamente, los diferentes compuestos, una vez localizada su posición por un método no destructivo, pueden eluirse de la placa raspando las zonas correspondientes y extrayendo el polvo obtenido con un solvente adecuado.

Definición del RF y como se calcula Rf es el registro y se define como: Rf = distancia que recorre la muestra desde el punto de aplicación / distancia que recorre el disolvente hasta el frente del eluyente La distancia que recorre el compuesto se suele medir desde el centro de la mancha, por el cual se suelen hacer unas marcas en la placa, si dichas manchas son extremadamente grandes, el valor del RF será erróneo. Así realizamos unas marcas en la placa donde se deposita con ayuda de un capilar un mínimo de muestra. Cuanto más polar sea el compuesto, mas retenido estará en el absorbente y por tanto ira más lento y el RF será también menor. Por otra parte los compuestos poco polares se consiguen desplazar a más distancia desde el origen. La polaridad del disolvente influye en el valor del RF por lo que se debe tener en cuenta, así para un mismo tipo de compuesto, un aumento de la polaridad del disolvente hará aumentar su desplazamiento en la placa y por lo tanto también aumenta su RF. (Jorrín Novo, Abril Díaz, & Bárcena Ruiz) METODOLOGIA En una cámara cromatográfica se colocó aproximadamente 5 ml de una solución de nhexano: éter etílico: ácido acético glacial (70:20: 1) y se dejó saturar por 20 minutos Preparación de la muestra Se colocó en un mortero 3 g de yema de un huevo cocido se agregó 10mL de una solución de etanol: éter: cloroformo (2:1:2) luego se macero suavemente y filtro a través de papel filtro, recogiendo el filtrado en un vaso de precipitados. Se evaporo el solvente calentando cuidadosamente agitando el vaso

constantemente, hasta tener el extracto viscoso o seco Una vez seco, se redisolvio la muestra en 5 mL de éter, y adiciono 15 mL de acetona para formar un precipitado, y se dejó decantar colocando el vaso de precipitados en forma diagonal. Se tomó la fase líquida y se colocó en un vaso de precipitado de 50 mL, se calentó cuidadosamente dejando reducir el volumen a 5 mL esta se tomó como solución 1 Se secó la fase sólida en y redisolvio el sólido en 5 mL de éter etílico esta se tomó como solución 2 Se separe 1 mL de solución 1 y de solución 2 para la cromatografía. Pruebas cualitativas de composición de lípidos Se tome en tres tubos de ensayo diferentes 1 mL de solución 1, de solución 2 y de solución de lecitina (control positivo). A cada tubo se le adiciono 1 mL de molibdato de amonio y 1 mL de ácido sulfúrico concentrado lentamente por las paredes del tubo; se agito y dejo reposar por 3 minutos se adiciono 1 mL de ácido ascórbico. Se prepara un cuarto tubo de ensayo con molibdato, ácido sulfúrico y ácido ascórbico (control negativo). Se tome 1 mL de solución 1, de solución 2 y de glicerina (control positivo). Se agregó una cantidad pequeña de KHSO4 a los tres tubos anteriores y a un cuarto tubo vacío (control negativo). Se caliento levemente cada tubo a la llama y se notó el olor desprendido en cada tubo. Se tomó 1 mL de solución 1, de solución 2 y de solución de colesterol (control positivo). Y

agrego 3 mL de FeCl3, y 1 mL de ácido sulfúrico concentrado a los tres tubos anteriores y a un cuarto tubo vacío (control negativo).

solución reveladora (Sulfato de Amonio 10%) luego se dejó secar y se colocó la placa sobre una plancha de calentamiento a 70°C y retiró una vez se empezaron a revelar colores sobre esta determinándose el Rf para cada muestra.

Separación de lípidos por cromatografía en capa fina Sobre las placas cromatográficas se marcó con un lápiz suavemente una línea dejando una distancia de 1 cm desde la base de la placa.

RESULTADOS Y DISCUSIONES Al preparar las soluciones 1 y 2 se observa un color amarillo lechoso para la primera solución y amarillo cristalino para la segunda solución.

Con un capilar se coloque sobre la placa las muestras según la figura:

Patrón Patrón lecitina Solución 1 Solución 2 colesterol Solución 2 Solución 1

Solución 1, solución 2 y tubo 3 que contiene lecitina

Se asegúrese de marcar cada punto sembrado luego se colocó la placa en la cámara, tapándola y hasta que la fase móvil quedo a un 1 cm de la parte superior de la placa. Luego de subir la fase móvil se sacó la placa y se marco con lápiz la zona hasta donde llegó la fase móvil se deje secar la placa, y aplico la

Solución 1, solución 2 y tubo 3 contiene colesterol

Etanol o Alcohol Etílico es un alcohol que se presenta como un líquido incoloro e inflamable con un punto de ebullición 78°C. Es el solvente por excelencia de uso en el laboratorio. Calculo del RF

Se utilizaron solventes orgánicos ya que estos permiten la ruptura de los enlaces covalentes y la extracción de las sustancias de interés.

35 mm

Se utilizaron los siguientes disolventes:  ETER: permitió diluir y homogenizar completamente la mezcla  ACETONA: se usó para dar miscibilidad a la mezcla, pero se precipito formando dos interfaces (una liquida y una sólida).  ETANOL: permite la fácil filtración de la mezcla Los Solventes Los compuestos orgánicos basados en el elemento químico carbono. Su importancia y patrón de uso determinan su clasificación en solventes activos, cosolventes, solventes, latentes y diluyentes. La Acetona es un solvente intermedio entre los muy polares y los no polares, sirviendo para hacer miscibles dos solventes que no lo son o para extraer conjuntamente sustancias polares y no polares. El Éter es un solvente de muy baja polaridad y de bajo punto de ebullición 35°C, solvente especial para los lípidos, resinas y grasas minerales.

Solución 1: No se calculó ya que se evidencia una mancha demasiado grande por ende esto arrojaría un RF erróneo Y es difícil determinar su polaridad ya que también se observa una macha en el punto donde se realizó la siembra tal vez ese fue el error que indica el porqué de la mancha tan grande en la parte superior. Solución 2: RF = 30mm/35mm=0,85 Según se evidencia en la muestra la mancha se encuentra con un desplazamiento y distancia considerable con respecto al origen por ende es un compuesto apolar y su RF es mayor. Colesterol: RF = 33mm/35mm=0.94 Según se evidencia en la muestra la mancha se encuentra con un desplazamiento y distancia también considerables lo que confirma la completa a polaridad del colesterol por ende su RF tan grande lo confirma.

33 mm

Solución 1: nuevamente para la segunda placa se observan 2 manchas una en el origen la otra en la parte inferior lo q hace difícil determinar su polaridad y RF. Solución 2: RF = 30mm/33mm=0,90 Según se evidencia en la muestra la mancha se encuentra con un desplazamiento y distancia considerable con respecto al origen por ende es un compuesto apolar y su RF es mayor coincidiendo con la primera placa. Lecitina: RF = 32mm/33mm=0.96 Según se evidencia en la muestra la mancha se encuentra con un desplazamiento y distancia también considerables lo que confirma la completa a polaridad de la lecitina por ende su RF tan grande lo confirma. La lecitina es una sustancia orgánica abundante en las membranas de las células vegetales y animales, especialmente en las del tejido nervioso; se obtiene de las grasas animales, la yema de huevo y algunas semillas y se emplea en la elaboración de ciertos alimentos, como la margarina o el chocolate, y en cosmética y farmacia. CONCLUSIONES

En la presente práctica se puede verificar la identificación de los fosfolípidos derivados del huevo y teniendo patrones de referencia como la lecitina y el colesterol efectivamente los lípidos son completamente apolares. Y presentan en estudios de cromatografía de capa fina una distancia mayor tal cual como se encuentra documentado. Los lípidos se solubilizan con solventes orgánicos por la presencia de ácidos grasos (glicéridos o triglicéridos) saturas o insaturados que forman los tipos de lípidos (simples – compuestos) los solventes orgánicos son moléculas apolares de manera tal que se solubilizan con ellos, en relación con el agua (molécula polar) tienen apatía o no afinidad por ser esteres de ácidos grasos con un alcohol llamado glicerina o glicerol.

BIBLIOGRAFÍA Jorrín Novo, J. V., Abril Díaz, M. N., & Bárcena Ruiz, J. A. (s.f.). Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina y detección mediante reacción con ninhidrina. Cordoba. L., D. N., & M. Cox, M. (2009). Lehniger Principios de Bioquimica. En D. N. L., & M. M. Cox, Lehniger Principios de Bioquimica (pág. 343). Madison, Wisconsin: EDICIONES OMEGA.