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“Año de la Diversificación Productiva y del Fortalecimiento de la Educación “

Universidad Nacional del Callao Escuela Profesional de Ingeniería Química Facultad de Ingeniería Química

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS 91 G

IDENTIFICACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS PROFESORA: Ing. HERRERA SÁNCHEZ SONIA. INTEGRANTES: Albinco Quispe Jose Alexander

1026120516

Díaz Guevara Lízbeth

092883B

Revoredo Cornejo Javier

1126120247

Tanohuye Tanohuye Takeshi Pablo

1001616

Vega Vega Elizabeth

092899F

2015-A

U N A C – Facultad de Ingeniería Química

INTRODUCCIÓN

Los mohos y bacterias se encuentran presentes en nuestra vida diaria, son tan pequeñas que a veces se dice que las bacterias ya existían aún mucho antes de que apareciera el hombre, se adaptan a diversas temperaturas y habitan hasta en los lugares menos pensado, es por esto encontramos bacterias beneficiosos en nuestro organismo que nos ayudan a sintetizar nutrientes. Pero así como algunas bacterias beneficiosas existen otras perjudiciales para nosotros así como por ejemplo tenemos las que producen enfermedades como la neumonía, producida por el neumococo bacteriano que produce una infección directa y mortal. Los mohos más conocidos como hongos, se encuentran y desarrollan en materias orgánicas como el agua, aire, suelo, etc. Esto se produce al descomponerse la materia orgánica (putrefactarse).son causantes de plagas e infecciones en la piel. Así mismo son utilizados en la industria farmacéutica y alimentaría, ya que incluye las levaduras que se utilizan para la fabricación de pan y vino. Los mohos y hongos son considerados dentro del reino vegetal, pero no son vegetales ya que no contienes clorofila, por lo cual hoy en día poseen su propio reino.

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I.

OBJETIVOS:

 Realizar adecuadamente mediante el método de cuenta en placa, el número de mohos y levaduras viables presentes en productos destinados al consumo humano.  Evaluar la calidad microbiológica de un alimento.

II.

MARCO TEÓRICO

Los hongos que producen micosis en el ser humano se encuentran en dos estados morfológicos básicos: levaduras y mohos Los hongos tienen una nutrición absortiva, quimio heterótrofa, con reservas nutritivas de glucógeno y paredes celulares de quitina, celulosa, glucanos; lo que justifica que se

sitúen

en

un

reino

independiente:

el

de

los

Gunfi

o

Mycetae.

La mayoría tiene un habitat saprofito, encontrándose en los más diversos biotopos. Puede ser uni o pluricelulares y presentan una gran variedad morfológica.

LEVADURAS Hongo unicelular, redondo o elipsoidal que se reproduce por gemación o fisión binaria. La gemación es la protrusión externa de parte del protoplasma materno (gema o yema), que va creciendo progresivamente, hasta que se desprende produciendo un nuevo individuo. Cada uno de estos elementos se denomina blastosporo y a este tipo de división blastospórica. La célula progenitora queda con las cicatrices de las distintas gemaciones. Es frecuente que exista el fenómeno del "dimorfismo". Esto es, que una levadura forma parte de la evolución morfológica de un hongo filamentoso y al revés. Una levadura que fuese capaz de producir hifas, sería un hongo dimórfico.

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Las colonias que crecen en un sustrato pueden ser cremosas o mucoides, lisas o plegadas, limitadas circulares, blancas o rojas. El prototipo es la Candida y a diferencia de los anteriores son más agresivas y difunden mejor por lo que pueden localizarse en partes más profundas, como las mucosas. Producen las micosis intermedias o candidiasis.

MOHOS Hongo multicelular. Su estructura filamentosa se desarrolla a través del crecimiento continuo de una propágula. El elemento tubular que emerge se denomina "hifa". El conjunto y las distintas ramificaciones de las hifas se denominan "micelio" o "thallus". Las "hifas" pueden introducirse en el sustrato formando un micelio vegetativo o proyectarse hacia el exterior constituyendo el micelio aéreo, que es el que define aspecto y morfología de la colonia, pudiendo ser: algodonoso, plumoso, lanudo, velloso, sedoso, brillante, mate, arrugado, plegado, plano, acuminado, extendido, desparramado, circunscrito, membranoso, cerebriforme, pigmentado o no, etc. En este micelio se producen elementos de propagación o propágulas que pueden ser:

esporas,

conidios,

fragmentos

de

micelio,

esclerocio,

etc.

Existe un grupo que merece destacarse por su frecuencia y tipo de patología, los Dermatofitos. Estos poseen enzimas proteolíticos capaces de digerir la queratina de la que se alimentan, por tanto van a localizarse en zonas muy superficiales como la piel, uña y pelos produciendo micosis superficiales llamadas Dermatofitosis o "Tiñas" (tineas). Los más representativos son Epidermophyton, Microsporum y Trichophyton. 

Estructura

Los hongos como células eucariotas poseen: -Núcleo con membrana que encierra entre 5 y 20 cromosomas. -Mitocondria 6 a 10 por célula. -Algunas son encapsuladas, inmóviles, poseen esteroles en su membrana citoplasmática.

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-Tipo de nutrición quimio heterótrofos, utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbón y energía. -La mayoría tiene pared celular. -Anaerobios o aeróbicos facultativos. -Crecimiento pH entre 2 y 9, temperatura entre 10 y 40 grados centígrados.

REPRODUCCIÓN

Los hongos se multiplican a través de estructuras que pueden ser asexuales (sólo mitosis) o sexuales (meiosis previa fusión del protoplasma y núcleo de células distintas). La tendencia actual en micología es restringir el término espora a las propágulas que se desarrollan dentro de un esporangio o las producidas por vía sexual.



REPRODUCCIÓN ASEXUAL.

Bajo esta denominación quedan englobados el crecimiento vegetativo y la reproducción mediante formación de elementos resistentes y diferenciados que son propágulas asexuales. Éstas pueden ser de dos tipos: esporangios oras y conidios. Las esporangio esporas se encuentran dentro de la una estrucutra globosa denominada esporangio y sin caracterísitcas de Zygomycetes. Las conidias se forman a partir decéulas especializadas en una estructura hifal que es el conidióforo. Su clasificación se basa de acuerdo al proceso de desarrollo o conidiogénsesis, que puedeser tálico o blástico.

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o Cóndidos tálicos: Son los desarrollados dentro del cuerpo. Un fragmento de la hifa se delimita por en tabique más grueso y queda diferenciada (artroconidia) o Cóndidos blásticos: Producidos por un proceso de gemación o crecimiento polar en la célula conidiógena que da lugar a la formación del conidio: o Blastoconidia: las gemaciones de la levadura. o Fialoconidias: la célula conidiógena es una fiálide o botella de la que emergen las conidias o Aneloconidia: Cuando en la célula conidiógena queda una franja o anillo por cada conidia que emerge.



REPRODUCCIÓN SEXUAL

Da lugar a un número par de células denominadas esporas sexules. según el tipo morfológico de esta espora, asi como el tejido o estructuras que lo sostienen, los hongos se clasifican en seis divisiones distintas: Myxomicota, Chytridiomycota, oomycota, zygomycota, ascomycota y basdiomycota.

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 VISUALIZACIÓN, CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE LOS HONGOS - EXAMEN MICROSCÓPICO El examen microscópico de los hongos en las muestras clínicas o de los cultivos se efectúa

previa

tinción

o

directamente

en

fresco.

Los hongos se observan en nuestras clínicas tejidas con la tinción de Gram como Gram positivos. También se visualizan bien contrastando las muestras con una gota de azul de lactofenol. En productos fluidos en los que se sospecha la existencia de levaduras capsuladas, como el criptococo, puede depositarse en el prota una gota de material, y añadir una gota de tinta china, lo que permite observar la levadura con la cápsula.

Muchas veces el examen microscópico de las micosis de los tejidos y órganos profundos se hace por técnicas histológicas a partir de biopsias. La hematoxilina-eosina se útil para examinar las lesiones inflamatorias que, en ciertas ocasiones, orientan el diagnóstico, pero no permite la detección de elementos fúngicos, que se tiñen mal por esta técnica. La tinción de PAS colorea intensamente la pared polisacárido de los hongos y permite na detección rápida de los elementos fúngicos en los tejidos. Las tinciones argentinas permiten igualmente reconocer los elementos fúngicos ya que la pared se tiñe en negro. En los tejidos de los hongos pueden observarse como levaduras aisladas, o como filamentos ramificados infiltrantes.

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- CULTIVO Los hongos crecen bien en medios artificiales y tienen requerimientos nutritivos simples, una fuente de carbono orgánico, generalmente azúcar, y de nitrógeno suelen ser los elementos suficientes para obtener un buen crecimiento. Junto a ellos, un soporte sólido, el agar, permite a los hongos filamentosos el desarrollo del micelo aéreo, donde se localizan las estructuras reproductoras y el desarrollo de colonias en el caso de las levaduras. El medio de cultivo más utilizado para los hongos es el medio de Saouraudm que reúne estas características y un pH de 5,6, que dificulta el crecimiento bacteriano.

No es cierto que los hongos requieran necesariamente para su crecimiento ser cultivados en el medio de Saboureaud, la mayor parte de medios de cultivo utilizados en bacteriología permiten su desarrollo, pero su utilización está consagrada por la costumbre. De hecho, la mayoría de las descripciones de crecimiento y características morfológicas de las colonias fúngicas se han hecho sobre el medio Saboureaud.

La adición al medio de antibióticos como el cloranfenicol o la gentamicina,que inhiben el crecimiento bacterias contaminantes, o anti fúngicos especiales (como la actidiona o cilohexamida) que inhiben el crecimiento de muchos hongos no patógenos, transforman al medio de Sabouraud en un medio más selectivo.

Los medios de cultivo después de sembrados, se incuban en aerobios y la temperatura óptima suele ser 25-30 ºC para los que producen infecciones profundas. Los hongos levaduriformes dan lugar en 24-48 horas a colonias de aspecto y morfología similar a las bacterias. El desarrollo de las colonias de os hongos filamentosos es mucho más variable; algunos crecen muy lentamente, pero sus colonias son muy características y en general se diferencian fácilmente de las levaduras. Laboratorio de Microbiología de Alimentos

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-

Medio de cultivo Sabouraud.

-

Medios para aislamientos especiales:

-

Medio de patata: T.rubrum Añadiendo zanahoria y bilis (Cándida albicans) o glucosa (Tricophyton rubrum).

-

Medio de arroz: Microsporum auduinii

-

Medio Czapek: Aspergillus spp.

-

Medio de alpiste: Criptococcus neoformans.

-

Medio Chromagar Candida: Cándida spp.

- IDENTIFICACIÓN Un hongo se identifica en primer lugar por la morfología macroscópica de la colonia, color, textura y velocidad de crecimiento. Para observar la estructura microscópica puede tomarse un pequeño fragmento de cultivo y montarlo entre cubre y porta, en fresco o contrastado con un colorante para su posterior observación, lo que permitirá confirmar la sospecha de hongo levaduriforme

o

filamentoso

basada

en

la

morfología

colonial.

Los hongos filamentosos se identifican a nivel de género especie por la morfología del micielo, pero sobre todo por las características microscópicas de sus esporas asexuadas y los elementos que las originan.

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Para conseguir la producción de esporas a veces se requieren medios de cultivo especiales que facilitan la esporulación. Las estructura reproductivas asexuadas (conidioforos) son muy frágiles y para poder observarlas al microscopio sin distorsionarlas o destruirlas se emplean técnicas especiales (micro cultivo). Los hongos no esporulados (micelio estéril) son difícilmente identificables. Los hongos levaduriformes se identifican mediante pruebas metabólicas, de modo semejante a las bacterias. -AGENTES FÚNGICOS La composición antigénica de los hongos es compleja y varía según la estructura anatómica considerada (levadura, hifa, espora) y el resultado metabólico. En algún caso los antígenos principales de los hongos han sido purificados y caracterizados tanto en su composición química como en su localización celular, pero en otros casos se trabaja con extractos antigénicos más o menos purificados, cuya composición precisa se desconoce. Estos extractos antigénicos pueden ser celulares o metabólicos, en este último caso son productos celulares segregados al medio de cultivo. En el criptococcus el antígeno más estudiado es el capsular, de estructura polisacarídica. Su detección en los líquidos orgánicos constituye un método de diagnóstico de la infección. La mayoría de los antígenos fúngicos se localizan en la pared, siendo principalmente mánanos y proteínas estructurales. La complejidad antigénica de los hongos, puede documentarse en el estudio de Aspergillus. Sus antígenos son muy variados y los extractos celulares enfrentados a sueros de paciente infectadas pueden mostrar más de 52 bandas antigénicas diferentes reconocidas por el suero inmune. Algunos antígenos, como el polisacárido capsular del criptococcus, algunos de Candida e incluso de aspergillus, se han purificado y obtenido anticuerpos específicos (monoclonales) que han permitido su caracterización precisa. Laboratorio de Microbiología de Alimentos

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III.

IV.

MATERIALES Y REACTIVOS: -

Solución salina al 8%

-

10g de pie de manzana

-

Agua destilada

-

Agar saboraud selectivo

-

Placas Petri

-

Pipetas

-

Vaso

-

Probeta

-

Mechero

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1. Primero colocamos el Agar SABOURAUD en un vaso precipitado de 250ml que para someterlo a calor por medio de un mechero y así fusionar al agar.

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2. Luego preparamos la solución salina al 0,08% 

10 gr de sal en agua destilada

3. Pesamos 10gr de muestra que es MERMELADA FANNY.

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4. A los 10gr de la muestra, agregamos 90ml de solución salina (concentración de la solución = 10-1 g/ml), luego de ésta mezcla separamos 1ml en un tubo y agregamos 9ml de solución salina (concentración de la nueva solución = 10 2 g/ml).

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5. De la solución de 10-2 g/ml, tomamos 1ml, colocamos en la caja Petri y adicionamos 15ml del medio líquido (agar sabouraud) y lo dejamos enfriar.

6. Colocamos a la incubadora a 37o C por un tiempo de 2 o 3 días.

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7. Después sacamos nuestra muestra de la incubadora y contamos colonias.

En nuestro caso solo encontramos 11 colonias. 11 ∗ 102 𝑈𝐹𝐶⁄𝑚𝑙

Contaj e

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Factor de disolución

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INFORME DE ENSAYO

o Análisis

:

Mermelada

o Lugar

:

Laboratorio de microbiología (FIQ - UNAC)

o Fecha de Muestreo

:

21/04/2015

o Fecha de Ejecución

:

25/04/2015

RESULTADOS MICROBIOLOGICOS

ENSAYO

Mohos

Levaduras

RESULTADO(UFC/ml)

LMP(m)

1.102

102

10.102

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102

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V.

CONCLUSIONES

 Se observó 11 colonias de color los cuales se interpretaron como hongos ya sean mogos y levaduras  La muestra no cumple con las condiciones microbiológicas de calidad sanitaria e inocuidad según la norma 591-2008/MINSA y 1020-2010/MINSA , al presentar un UFC encima del límite permisible, por lo que no es apta para el consumo humano.

VI.

RECOMENDACIONES

 Homogenizar correctamente la muestra en la placa petri.  Al momento de la siembra, colocar el agar en la placa petri a la temperatura correcta, para evitar que los microorganismos mueran por el exceso de calor del medio de cultivo.

VII.

BIBLIOGRAFIA

 Prescott, L. M., Harley, J. P., y Klein, D. A. Microbiología. 4ª edición. McGrawHill Interamericana, 1999  Díaz, R., Gamazo, C, y López-Goñi, I. Manual práctico de Microbiología. 2ª edición. Masson, S.A. Barcelona, 1999  http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/sabouraudgluagar.htm  http://bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/HB/CE/PA/ES-PA-254515.pdf

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