• Author / Uploaded
• Enrique Truenque

Citation preview

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO Facultad de Ingeniería Pesquera y de Alimentos Escuela Profesional de Ingeniería de Alimentos

TEMA

:

Recuento de Mohos y Levaduras

DOCENTE

:

Blgo. - Ing. Arturo García Merino

GUIA PRÁCTICA :

Nº 06

2017 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Blgo.-Mblgo.: ARTURO GARCIA MERINO

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO Facultad de Ingeniería Pesquera y de Alimentos Escuela Profesional de Ingeniería de Alimentos RECUENTOS DE MOHOS YLEVADURAS Método ICMSF 2000

1. INTRODUCCIÓN Todos los mohos y levaduras crecen bien a valores de pH de 5,0 y aun inferiores, por lo que generalmente sustituyen a las bacterias en los alimentos ácidos. Además, muchos mohos y algunas levaduras toleran bajas a w (aproximadamente inferiores a 0,95) mucho mejor que la mayoría de las bacterias, incluso a valores por debajo de 0,75, algunos mohos y las levaduras son los agentes alterantes e un número importante de alimentos. Waksman (1922) sugirió el uso de medios acidificados para el recuento de mohos del suelo y a partir de esta fecha los microbiológicos de los alimentos adoptaron esta técnica para el recuento de mohos y levaduras en alimentos. Sin embargo, pronto se hizo patente que el uso de medios con pH bajo para esta finalidad tiene dos claros inconvenientes: (1) muchas bacterias crecen a pH bajo, incluso por debajo de 4 (Mossel y Col., 1962; Koburger, 1970), y (2) algunos mohos y levaduras crecen con dificultad a los valores de pH de muchos de los medios propuestos (Holwerda, 1952; Mossel y Col., 1962; Ingram, 1959; Koburger, 1970, 1971, 1972, 1973; B. Jarvis, 1973), especialmente cuando las células han sido dañadas poco antes de la siembra (Nelson, 1972). Por lo tanto, los medios de pH bajo no son enteramente satisfactorios para recuento de mohos y levaduras. Para inhibir el crecimiento de las bacterias en los medios diseñados para el recuento de mohos y levaduras, en los últimos veinte años se han utilizado con eficacia los antibióticos. Entre ellos, puede citarse la penicilina + estreptomicina, el cloranfenicol, la clortetraciclina, la oxitetraclina y la gentamicina (W. B. Cooke, 1954; Beech y Carr, 1955; Flannigan, 1973). Para fines generales, ha sido muy utilizada la oxitetraciclina (Mossel y Col., 1962; Put, 1964; Saincliver y Roblot, 1966), que se refiere a la clorotetraciclina debido a su mayor estabilidad. La gentamicina suprime el crecimiento de las bacterias Gram negativas y es efectiva por ello en alimentos tales como la carne refrigerada (Hup y Stadhouders, 1972; Mossel y Col., 1970, 1975). El rosa de bengala retarda el crecimiento de aquellos mohos que normalmente producen abundante micelio aéreo, como Neurospora y Rhizopus (B. Jarvis, 1973). Sin embargo, también inhibe algunas levaduras (Mossel y Col., 1975). La mejor temperatura de incubación de los cultivos se sitúa alrededor de 22º C (Mossel y Col., 1962; Koburger, 1970, 1972; Flannigan, 1973) y el tiempo de incubación más adecuado es de 5 días. Las colonias de mohos pueden formarse a partir de hifas o de esporas. Por ello, el talo de un moho que éste muy cargado de esporas dará recuentos en placa mucho más altos que otro de tamaño similar sin esporas. Si se desea evaluar la cantidad real de crecimiento vegetativo miceliar, utilizar el método de recuento de mohos de Howard (AOAC, 1975) en lugar del método de recuento en placa por siembra en todo el medio que se describa a continuación.

2.

OBJETIVO ─ Establecer la importancia de la presencia de mohos y levaduras de cuerdo al tipo de alimento. ─ Manejar la metodología básica para el recuento, tanto de células viables como de células no viables e interpretar los resultados obtenidos.

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Blgo.-Mblgo.: ARTURO GARCIA MERINO

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO Facultad de Ingeniería Pesquera y de Alimentos Escuela Profesional de Ingeniería de Alimentos 3. I. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. II. 1. 2.

3. 4.

5. 6.

7.

METODO DE RECUENTO DE LEVADURAS Y MOHOS POR SIEMBRA EN PLACA EN TODO EL MEDIO MATERIAL Y APARATOS Lo necesario para la preparación y dilución de los homogeneizados de alimentos (Práctica 05). Placas de Petri, de vidrio (100 × 15mm) o de plástico (90 × 15mm). Pipetas bacteriológicas de 1, 5 y 10 ml. Baño de agua o estufa de aire forzado para templar el agar fundido, 44 - 46º C. Estufa de incubación, 20 - 24º C. Contador de colonias (tipo Quebec de campo oscuro o similar). Dispositivo de recuento con registro automático. Agar Oxitetraciclina Gentamicina extracto de levadura glucosa OGY1. TECNICA Preparar la muestra de alimento por uno de los tres procedimientos recomendados en el capítulo sobre preparación y dilución de los homogeneizados de alimentos. Pipetear en placas de Petri alícuotas de 1 ml de las diluciones 10 -1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, utilizando dos placas por cada dilución. Se propone esta serie de diluciones para los casos en que no se conozca el número aproximado de unidades formadoras de colonias presentes en la muestra. Por supuesto, las diluciones que han de prepararse y sembrarse siempre serán función del recuento esperado. Rápidamente, verter en las placas de Petri 10 -15 ml del agar oxitetraciclina gentamicina extracto de levadura glucosa, fundido y templado a 44-46º C. Mezclar inmediatamente el inóculo con el agar balanceando la placa de izquierda a derecha cinco veces, rotándola en el sentido de las agujas del reloj otras cinco veces, realizando otras cinco veces el movimiento de vaivén en sentido perpendicular al primero y rotándola, finalmente cinco veces en sentido contrario a la agujas del reloj. Invertir las placas cuando se haya solidificado el agar e incubarlas a 20-24ºC durante 3-5 días. Con ayuda del contador de colonias y del dispositivo de recuento con registro automático, contar las colonias en aquellas placas que contengan entre 30 y 300, llevando a cabo un examen microscópico cuando sea necesario para identificar las colonias de levaduras. Calcular el número de levaduras y mohos por gramo o mililitro de alimento.

4. LECTURA Y EXPRESION DE RESULTADOS 1. Proceder la lectura, como en la Numeración de Microorganismos Aerobios Mesofilos Viables. 2. Elegir para el reporte las placas que contengan entre 30-300 UFC/ g. o ml. Se cuentan todas las colonias de Mohos y de Levaduras por separado 3. Reportar como Levaduras / gr o ml de muestra. 4. Reportar como Mohos / gr o ml de muestra.

5. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS International Commission on Microbiological Specifications foe Foods (ICMSF). 1983 Vol. 1, Parte II (traducción de la versión 1988) Reimpreso el 2000, 2°. Edic , Editorial Acribia. Pp :( 165 -167).

1 Preparar 900 ml de Agar base extracto de levadura-glucosa, luego distribuir en volúmenes de 90 ml y esterilizar por autoclavado.;

luego al momento de su utilización adicionar 10 ml. de Oxitetraciclina (10 mg por cada 100 ml de medio).  La oxitetraciclina se prepara en condiciones estériles, en la proporción de 100 mg de oxitetraciclina por cada litro de medio.

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Blgo.-Mblgo.: ARTURO GARCIA MERINO

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO Facultad de Ingeniería Pesquera y de Alimentos Escuela Profesional de Ingeniería de Alimentos Recuento De Mohos y Levaduras Recuento Estándar en Placa UFC/ g ó mL Método ICMSF – 2000

Pesar Muestra: 25 g. +

Muestra Homegenea: 10-1

Homogeneizar / 1 minuto

225 ml de A.P.

1 ml

1 ml

1 ml

A.P.: 9 ml

10-1

1 ml

A.P.: 9 ml

10-2

Control

A.P.: 9 ml

10-3

10-4

A.P.: 9 ml

10-n

(+)

(-) Ambiente

MÉTODO 11 (Recuento estándar en placa, recuento en placa por siembra en todo el medio). Adicionar

A

15 ml Agar

1 ml

L

I

C

U

1 ml

O

T 1 ml

A

S 1 ml

1 ml

1 ml

O.G.Y. Licuado y temperado 45+2°C Homogeneizar

5

5

INCUBACION :

22 + 2ºC / 3 – 5 días

(+)

(-)

LECTURAS: Contar en placas que contengan entre 30-300 UFC/ g. o ml.

5

5

Se cuentan todas las colonias de Mohos y de Levaduras por separado

Para homogeinizar las siguientes diluciones; aspirar 10 veces la suspensión de 10 ml con una pipeta estéril. 1

Para alimentos con un elevado contenido en grasa (superior al 20%) como ocurre por ejemplo en ciertas carnes, es necesario añadir al diluyente (Agua de peptona) un 1 % de Tween 80 o de otro tensoactivó no toxico.

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Blgo.-Mblgo.: ARTURO GARCIA MERINO

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO Facultad de Ingeniería Pesquera y de Alimentos Escuela Profesional de Ingeniería de Alimentos Numeración de Levaduras Osmofilas Recuento Estándar en Placa UFC/ g ó mL Método NTP 202-083: 1990

Pesar Muestra: 25 g. +

Muestra Homegenea: 10-1

Homogeneizar / 1 minuto

225 ml de A.P.

1 ml

1 ml

1 ml

A.P.: 9 ml

10-1

10-2

1 ml

A.P.: 9 ml

10-3

Control

A.P.: 9 ml

10-4

A.P.: 9 ml

10-n

(+)

(-) Ambiente

MÉTODO 11 (Recuento estándar en placa, recuento en placa por siembra en todo el medio). Adicionar A L I C U O T A S 15 ml Agar 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml O.G.Y. + 40% Glucosa Licuado y temperado: 45+2°C Homogeneizar

5

5

INCUBACION :

22 + 2ºC / 3 – 5 días

(+)

(-)

LECTURAS: Contar en placas que contengan entre 30-300 UFC/ g. o ml.

5

5

Se cuentan todas las colonias de Levaduras.

Para homogeinizar las siguientes diluciones; aspirar 10 veces la suspensión de 10 ml con una pipeta estéril.

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Blgo.-Mblgo.: ARTURO GARCIA MERINO

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO Facultad de Ingeniería Pesquera y de Alimentos Escuela Profesional de Ingeniería de Alimentos Colonias de Levaduras en placa petri con Agar OGY

Colonias de Mohos en placa petri con Agar OGY

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Blgo.-Mblgo.: ARTURO GARCIA MERINO

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO Facultad de Ingeniería Pesquera y de Alimentos Escuela Profesional de Ingeniería de Alimentos

AGAR BASE OGYE.- Para el aislamiento, recuento y cultivo de levaduras y hongos en alimentos y muestras diversas. Penicillium spp,

desarrollo: Satisfactorio

Sinónimos.- OGA, Base Agar, Glucosa Oxitetracidina, Base Agar Historia.- La formulación de este medio corresponde a la formulación dada por Mossel y colaboradores en 1970 para el recuento de hongos y levaduras. Fundamento.-

La Glucosa y el Extracto de Levadura son la base nutritiva del medio. La adición de la

Oxitetraciclina o de la Gentamicina confieren el carácter selectivo al medio. Se presentan ciertas variaciones en la formulación de este medio, según las publicaciones consultadas; principalmente a nivel de la concentración de glucosa. pH: 6,5±0,2

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Blgo.-Mblgo.: ARTURO GARCIA MERINO