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ESCUELA SUPERIOR POLITECNICA DEL LITORAL

LICENCIATURA EN NUTRICION

Informe de Laboratorio de Química de Alimentos # 5

Tema: Precipitación de la Caseína y Determinación de su punto Isoeléctrico.

Integrantes: Carlos Rada Donoso Hugo Alfonso Mieles Alexandra Lozano Larrea Dayana Machado Cevallos Vanessa Montalván Montenegro Verónica Lozano Mariño

Docente: MBA. Mariela Reyes López

Paralelo: G-15

Curso: 2012 – 2013

Objetivo: 

Determinar el punto isoeléctrico de la caseína extraída mediante procedimiento químico de la leche entera liquida.

MATERIALES  Tubos de ensayo.  Papel filtro.  Gradilla para tubo de ensayo.  Pipeta graduada.  Vaso de precipitado.  Matraz Erlenmeyer.  Espátula.  Asistente de pipeteo.  Varilla de vidrio.  Probeta.  Embudo simple de cuello corto.  Agua destilada 15 ml.  Leche sin pasteurizar 15 ml. Reactivos:  Ácido Sulfúrico al 5%.  Ácido Acético 0.1 Molar.  Acetato de Sodio 0.1 Molar.  Acetato de Sodio 0.2 Molar.

TÉCNICA OPERATORIA Se realizó en dos partes: Parte A: Procedimiento  Diluir 15 ml. de leche con 15 ml. de agua destilada en un vaso de precipitado.  Añadir ácido sulfúrico al 5% hasta primer precipitado abundante.  Esperar que el precipitado se deposite en el fondo.  Con la ayuda del embudo con papel filtro, separar la caseína del suero en un matraz.  Desechar suero.  Sacar la caseína del papel filtro con ayuda de una espátula y agregarlo a un vaso de precipitado pequeño.  Añadir al precipitado 37.5 ml. de Acetato de Sodio 0.2 M.  Romper precipitado con varilla para formar suspensión fina. Parte B: Procedimiento  Preparar tubos con sol. amortiguadora de acetato (tabla).  Añadir a cada tubo 0.5 ml de caseína diluida.  Agitar.  Realizar observaciones cada 5 min. durante media hora asignando valores arbitrarios de 0 al 4.  Graficar los valores arbitrarios en las ordenadas y el número de tubo en abscisas con los datos de la última observación.  Determinar el punto de sol. de solubilidad mínima.

Tabla: Tubo

Ac. Acético 0.1 M

Acetato de Sodio 0.1 M

1

9.3 ml

0.7 ml

2

8.2 ml

1.8 ml

3

6.3 ml

3.7 ml

4

5.0 ml

5.0 ml

5

3.0 ml

7.0 ml

6

2.1 ml

7.9 ml

7

0.9 ml

9.1 ml

FUNDAMENTO TEORICO Caseína La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina, riboflavina, ácido pantotéico y vitaminas A, D y K), minerales (calcio, potasio, sodio, fósforo y

metales

en

pequeñas cantidades), proteínas (incluyendo todos los

aminoácidos esenciales), carbohidratos (lactosa) y lípidos. Los únicos elementos importantes de los que carece la leche son el hierro y la vitamina C. Las proteínas se pueden clasificar de manera general en proteínas globulares y fibrosas. Las proteínas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y no establecen

interacciones

intermoleculares como

son los puentes de hidrógeno (característicos de las proteínas fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones coloidales. En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lacto albúminas y lacto globulinas (todas globulares). La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica

(caseinato cálcico). La caseína representa cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en composición de la leche líquida. La caseína está formada por alpha (s1), alpha (s2)-caseína, ß-caseína, y kappa-caseína formando una micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta caseína son solubles en la leche, solas o combinadas. Si se añade la kappa caseína a las dos anteriores o a cada una de ellas por separado se forma un complejo de caseína que es solubilizado en forma de micela. Esta micela está estabilizada por la kappa caseína mientras que el alfa y la beta son fosfoproteínas que precipitan en presencia de iones calcio.

La kappa caseína, sin embargo, tiene pocos grupos fosfato y un alto contenido de carbohidratos unidos a ella. También tiene todos sus residuos de serina y treonina con sus correspondientes grupos hidroxilo, así como los carbohidratos dispuestos en una sola cara de su superficie por lo que esta parte exterior es fácilmente soluble en agua gracias a los grupos polares que posee. La otra parte de su superficie se une fácilmente al alfa y la beta caseína insoluble, lo que da lugar a la formación de la micela.

La conformación de la caseína es similar a las proteínas desnaturalizadas globulares. El alto numero de residuos de prolina en la caseína causa un especial plegamiento en la cadena de proteína e inhibe la formación de una fuerte y ordenada estructura secundaria. La caseína no contiene puentes di sulfuro. De igual manera la falta de estructura secundaria es importante para la estabilidad de la caseína frente a la desnaturalización por calor. La carencia de estructura terciaria facilita la situación al exterior de los residuos hidrofóbicos lo que facilita la unión entre unidades proteicas y la convierte en prácticamente insoluble en agua. En cambio es fácilmente dispersable en álcalis diluidas y en soluciones salinas tales como oxalato sódico y acetato sódico.

La función biológica de la caseína Las micelas de caseína es transportar grandes cantidades de Ca y P altamente insoluble en forma liquida a los lactantes y formar un coagulo en el estómago para favorecer una nutrición eficiente. Además de caseína, Ca y P

la

micela formada también contiene citrato, iones, lipasa, enzimas

plasmáticos y suero. Estas micelas ocupan del 6-12% del volumen total de la leche. Las proteínas que aparecerán en el sobrenadante cuando precipitemos la caseína en medio ácido son proteínas globulares, hidrofilicas y fácilmente solubles en agua así como susceptibles de desnaturalización por calor. Las principales son ß -lacto globulina, alpha- lactalbumina, bovine serum albumin (BSA), e inmunoglobulinas (Ig).

pH de la Caseína La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada como sal cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita. Ca

2+

Caseinato + 2HCl

Caseína + CaCl2

Aplicaciones de la caseína La caseína generalmente se emplea en la industria para la fabricación de pinturas especiales y la preparación de tejidos, clarificación de vinos, elaboración de preparados farmacéuticos,

la fabricación de plásticos

(botonería, peines y mangos de u tensillos), pinturas la cual ha sido usada desde la antigüedad por los egipcios, pegamento en relojería, carpintería (recomendadas para maderas terciadas), papel, vidrio, porcelana.

Punto Isoeléctrico Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en agua. Una característica de las proteínas y otros biopolímeros es que la carga total que adquieren depende del pH del medio. Así, todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente (irreversible). Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos.

Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente

ácido

aminoácidos aspártico

debido

a

que

los

grupos

COOH

y glutámico estarían en su forma

de

los

neutra pero los

grupos amino de Arginina y lisina estarían protonados (-NH3+). De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2). De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI). En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación. Si suponemos una proteína formada únicamente por aminoácidos sin grupos laterales ionizables la carga neta de la proteína dependería exclusivamente de la protonación / desprotonación de los grupos amino y carboxilo terminal. En la realidad las proteínas están formadas por multitud de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos y la carga va a depender de los grupos ionizables que poseen los aminoácidos que la componen (anexo I) y del pH del medio.

Ecuación de Henderson – Hasselbalch  Se utiliza a menudo para realizar los cálculos que requiere la preparación de disoluciones tampón o búfer en el laboratorio, o para otras aplicaciones.  La ecuación implica el uso de las concentraciones de equilibrio del ácido y su base conjugada.  Para el cálculo del pH en soluciones amortiguadoras, generalmente se hace una simplificación y se utilizan las concentraciones iniciales del ácido y la sal, por lo tanto se debe tener en cuenta que el valor obtenido es una aproximación y que el error será mayor cuanto mayor sea la diferencia de las concentraciones de equilibrio con las de partida (constante de equilibrio alta).  En la misma aproximación, tampoco se considera el aporte del agua, lo cual no es válido para soluciones muy diluidas.

Propiedades de los Amortiguadores 1. El pH de una disolución amortiguadora depende de la naturaleza del ácido débil que lo integra (de su pK), de modo que para cantidades equimoleculares de sal y de ácido, el pH es justamente el pK de este ácido. Dicho de otra forma, se puede definir el pK de un ácido débil como el pH del sistema amortiguador que se obtiene cuando [sal] = [ácido] 2. El pH del sistema amortiguador depende de la proporción relativa entre la sal y el ácido, pero no de las concentraciones absolutas de estos componentes. De aquí se deduce que añadiendo agua al sistema, las concentraciones de sal y ácido disminuyen paralelamente, pero su cociente permanece constante, y el pH no cambia. Sin embargo, si la dilución llega a ser muy grande, el equilibrio de disociación del ácido se desplazaría hacia la derecha, aumentando la [sal] y disminuyendo

[ácido], con lo cual el cociente aumenta y el pH también, de forma que se iría acercando gradualmente a la neutralidad (pH 7). 3. Cuando se añaden ácidos o bases fuertes a la disolución amortiguadora, el equilibrio se desplaza en el sentido de eliminar el ácido añadido (hacia la izquierda) o de neutralizar la base añadida (hacia la derecha). Este desplazamiento afecta a las proporciones relativas de sal y ácido en el equilibrio. Como el pH varía con el logaritmo de este cociente, la modificación del pH resulta exigua hasta que uno de los componentes está próximo a agotarse.

Imágenes tomadas durante la práctica

RESULTADOS -

Se obtuvo la tabla con las observaciones del 0 al 4 por cada 5 minutos durante la media hora, el cero significaba el más opaco y el cuatro el más claro.

Minutos

Tubo

Tubo

Tubo

Tubo

Tubo

Tubo

Tubo

#1

#2

#3

#4

#5

#6

#7

5

0

1

2

3

2

1

2

10

1

3

3

2

1

3

2

15

2

3

1

1

2

1

1

20

2

3

2

1

1

1

3

25

3

3

2

2

1

1

3

30

3

4

2

3

3

2

3

-

Se toman los valores del minuto 30 para saber el tubo que tuvo más claridad, en este caso quedó el tubo 2, se realiza el gráfico.

Claridad 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 Tubo #1

Tubo #2

Tubo #3

Tubo #4

Tubo #5

Tubo #6

Tubo #7

Claridad

-

Para determinar el pH lo hacemos por el uso de la ecuación de Henderson – Hasselbalch.

pH = pK + Log (n (sal)/n (ac)) Donde: pK = Es la constante de disociación del ácido que en este caso el 4,7 por acción del ácido acético. Log = Es el logaritmo. n (sal) = Es la concentración de la sal, en este caso del acetato de sodio. n (ac) = Es la concentración del ácido, se utiliza el ácido acético. -

Para sacar las concentraciones se utiliza la siguiente formula: n = M*V

Donde: M = Es la molaridad. V = Es el volumen.

-

Se obtuvo una nueva tabla con los valores de la concentración Ac. Acético

n (Ac.

Acetato de

n (Acetato

0.1 M

Acético)

Sodio 0.1 M

de Sodio)

1

9.3 ml

0.93

0.7 ml

0.07

2

8.2 ml

0.82

1.8 ml

0.18

3

6.3 ml

0.63

3.7 ml

0.37

4

5.0 ml

0.50

5.0 ml

0.50

5

3.0 ml

0.30

7.0 ml

0.70

6

2.1 ml

0.21

7.9 ml

0.79

7

0.9 ml

0.09

9.1 ml

0.91

Tubo

-

-

Tabla con su respectivo pH (Ecuación de Henderson – Hasselbalch) Tubo

pH

1

3.58

2

4.04

3

4.47

4

4.70

5

5.07

6

5.28

7

5.71

Se supo que el tubo 4 era el más claro, entonces su pH es de 4.7

CONCLUSIONES  No se nos pudo dar la claridad en el tubo 4, se dio en el tubo 2, debido a que en el momento de agregar la solución de acetato de sodio y ácido acético lo realizaron dos personas en vez de una sola.  El punto isoeléctrico (pI) de la caseína es 4.6. A este pH, la caseína se encuentra en su punto de menor solubilidad, debido a la reducción de repulsiones intermoleculares, por lo que precipita.  A diferencia de muchas otras proteínas, la caseína no precipita al calor. Precipita bajo la acción de la renina (enzima proteolítica presente en el estómago de terneros) para formar la paracaseína. Al precipitar por acción de ácidos se le llama caseína ácida. Este precipitado blanco forma la base para la elaboración de todo tipo de quesos. La enzima tripsina reduce la caseína a un hidrolizado fosfatado llamado peptona.

BIBLIOGRAFÍA

 http://www.quiminet.com/articulos/caseina-una-proteina-de-la-leche13367.htm.  http://www.biologia.arizona.edu/biochemistry/problem_sets/ph/HH.html  http://www.ehu.es/biomoleculas/buffers/hh.htm.  http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Pract ica3FQB.pdf.  http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/07%20MEDIDA%20pH.pdf.