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IDENTIFICACION CINETICA Y PROPIEDADES DE LA CATALASA

WILMER MORENO, LINA ANDREA GÓMEZ *Estudiante de Química Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia Escuela de Ciencias Básicas, Laboratorio de bioquímica I Docente: Angélica María García Practica N°12 RESUMEN: Se identificó la presencia de la enzima catalasa en tres diferentes alimentos como los son la papa el tomate y el hígado de res, igualmente se desnaturalizo dicha enzima, en el hígado se extrajo dicha enzima con ayuda de solución buffer de fosfato y con ayuda de la centrifugación para llevarla a un método de actividad cinética enzimática llevando así los análisis a una graficas propuestas por michaelis –menten y además de Lineweaver-Burk. PALABRAS CLAVE: actividad cinética, desnaturalización, enzima. ABSTRACT: The presence of catalase enzyme in three different foods like potatoes are tomatoes and beef liver was identified, also said enzyme, said enzyme in the liver was extracted using phosphate buffer solution and using the denatured centrifugation to carry it to a method of enzyme Kinetic activity thus leading to a graphical analysis proposed by Michaelis-Menten and Lineweaver-Burk addition.

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1. INTRODUCCIÓN cinética enzimática

Estudia la velocidad de las reacciones químicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cinética y de la dinámica química de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo catalítico, su papel en el metabolismo, cómo es controlada su actividad en la célula y cómo puede ser inhibida su actividad por fármacos o venenos o potenciada por otro tipo de moléculas. Las enzimas, en su mayoría, proteínas con la capacidad de manipular otras moléculas, denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al centro catalítico de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimático. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos, como es el caso de las proteasas al romper una proteína en dos poli péptidos. En otros casos, se produce la unión simultánea de dos sustratos, como en el caso de la ADN polimerasa, que es capaz de incorporar un nucleótido (sustrato 1) a una hebra de ADN(sustrato 2). Aunque todos estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, también suelen presentar una etapa limitante que determina la velocidad final de toda la reacción. Esta etapa limitante puede consistir en una reacción química o en un cambio conformacional de la enzima o del sustrato. Página 2

Los mecanismos enzimáticos pueden ser divididos en mecanismo de único sustrato o mecanismo de múltiples sustratos. Los estudios cinéticos llevados a cabo en enzimas que solo unen un sustrato, como la triosa fosfato isómeras, pretenden medir la afinidad con la que se une el sustrato y la velocidad con la que lo transforma en producto. Por otro lado, al estudiar una enzima que une varios sustratos, como ladihidrofolato redactase, la cinética enzimática puede mostrar también el orden en el que se unen los sustratos y el orden en el que los productos son liberados1. Las enzimas son proteínas con capacidad de catalizar reacciones biológicas. Igual que los catalizadores inorgánicos, aumentan la velocidad para alcanzar el equilibrio de la reacción. El mecanismo por el cual las enzimas incrementan la velocidad de la reacción es reduciendo la energía libre de activación requerida para la transformar un sustrato al producto correspondiente, sin afectar la constante de equilibrio. La actividad de una enzima se evalúa en función de la velocidad de la reacción. La cinética enzimática estudia la velocidad de la reacción, los factores que la modifican y el mecanismo de la misma. Los factores fisicoquímicos que modifican la actividad de la enzima son: concentración del sustrato, concentración de la enzima, pH, temperatura, fuerza iónica, inhibidores. Leonor Michaelis y Maud Menten en 1913, propusieron un modelo clásico para el estudio de la 1 Cinética enzimáticahttp://es.wikipedia.org/wiki/Cin %C3%A9tica_enzim%C3%A1tica

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cinética enzimática. Este modelo consiste en graficar la velocidad de la actividad enzimática y la concentración del sustrato. Esta representación gráfica permite determinar la constante de Michaelis-Menten (KM) al interpolar la mitad de la velocidad máxima (Vmáx). En esta práctica se empleará la enzima catalasa para analizar algunos aspectos de la cinética enzimática. La catalasa utiliza una molécula de peróxido de hidrógeno (H2O2) como sustrato donador de electrones y otra molécula de H2O2 como oxidante o aceptor de electrones. Dónde: A y B = Sustratos C y D = Productos v1 = Velocidad de reacción para formar productos v2 = Velocidad de reacción para formar reactivos CATALASA 2 H2O2 2 H2O + O2 La catalasa está contenida en los peroxisomas de eritrocitos, médula ósea, mucosas, riñón e hígado. Su función es la descomposición del H2O2 formado por acción de las oxidasas2. 2 determinación de la actividad enzimática de peroxidasas (catalasa)http://www.uaq.mx/investigacion/difusio n/veranos/memorias2010/12%20Verano %20Ciencia%20Region%20Centro/UAQ %20Cedillo%20Jimenez.pdf

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2. RESULTADOS RESULTADOS

Y ANALISIS DE

DEMOSTRACIÓN DE LA PRESENCIA DE LA ENZIMA CATALASA

Tubo con tomate y agua oxigenada: se observa un desprendimiento de burbujas suavemente. Tubo con papa y agua oxigenada: se observa un desprendimiento de burbujas fuertemente. Tubo con hígado y agua oxigenada: se observa un desprendimiento de burbujas fuertemente. Análisis: se observó que con ayuda del desprendimiento de esas burbujas la enzima de catalasa se observó con mayor presencia en el hígado y que se observa en menores proporciones en el tomate. DESNATURALIZACIÓN CATALASA

DE

LA

Tubo con hígado y agua destilada: se observa un desprendimiento de burbujas y un cambio de color fuertemente. Tubo con tomate y agua destilada: se observa la precipitación del tomate en forma aguada sin cambiar de color. Tubo con la papa y agua destilada: se observa un desprendimiento de burbujas muy suavemente.

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Análisis: se observó que con el cambio de color y la reacción fuerte del hígado la enzima catalasa presente en este alimento se desnaturalizo con mayor fuerza mientras que en la papa y el tomate no se alcanzó a desnaturalizar completamente. Actividad y cinética enzimática

Tubo KMnO4 utilizado (mL) H2O2 No descompu esto en 5 minutos H2O2 descompu esto por 1.0 mL de enzima en 5 minutos (μmoles) Actividad específica de la enzima catalasa

1

2

3

4

5

6

1.8

2.5

2.6

2.8

3

2.9

5x1 0-4

1x1 0-4

1.5x 10-4

2x10

5x 10-6

3.75 x10-

8.5x 10-5

1.3x 10-4

-4

2.5x1 0-4

2.5x1 0-4

1.75x 10-4

1.75x 10-4

n1=0.1 mol/L x 1.8x10-3 L = 1.8x10-5 mol 4.5x10-5mol (H2O2 ) n2=0.1 mol/L x 2.5x10-3 L = 2.6x10-5 mol 6.25x10-5 mol (H2O2 ) n3=0.1 mol/L x 2.6x10-3 L = 6.5x10-5 mol 4.5x10-5(H2O2 ) n4=0.1 mol/L x2.8 x10-3 L = 2.8x10-5 mol 7x10-5 mol (H2O2) n5=0.1 mol/L x 3x10-3 L = 3x10-5 mol 7.5x10-5 mol (H2O2) n6=0.1 mol/L x2.9 x10-3 L = 2.9x10-5 mol 7.25x10-5 mol (H2O2)

Moles de H2O2 que reaccionan

5

Tabla: n1 = 0.1 mol/L x 5x10-4 L = 5x10-4 mol n2 = 0.1mol/L x 1x10-4 L = 1x10-4 mol n3 = 0.1mol/L x 1.5x10-3L = 1.5x10-4 mol n4 = 0.1mol/L x 2x10-3L = 2x10-4 mol n5 = 0.1mol/L x 2.5x10-3L = 2.5x10-4 mol n6 = 0.1mol/L x 2.5x10-3L = 2.5x10-4 mol

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titulación KMnO4 0.01 M

5x10-5 - 4.5x10-5 = 5x10-6 moles 1x10-4 – 6.25x10-5 = 3.75x10-5 moles 1.5x10-4 - 6.5x10-5 = 8.5x10-5 moles 2x10-4 - 7x10-5 = 1.3x10-4 moles 2.5x10-4 - 7.5x10-5 = 1.75x10-4 moles 2.5x10-4 - 7.25x10-5 = 1.75x10-4 moles

ARTIC www.uptc.edu. co tiempo(m concentración in) (10-4) 0 0,25 0,5 1 1 1,5

-

1,5

2

2

2,5

2,5

2,5

0-4)

0,25 1 1,5 2 2,5 2,6

Grafica del tiempo de reacción vs concentración

0,9286 3,71 5,57 7,42 9,28 9,28

concentracion vs velocidad 1.2

tiempo vs concentracion 3

1 0.8 0.6

f(x) = 0.93x + 0.46

2.5

0.4 0.2

2

0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

1.5 1 0.5 0 0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Donde observamos que la velocidad máxima es igual a 9.28. v =(Vmax )/2

Por medio de la ecuación de la curva de calibración podemos hallar la pendiente la cual representa la velocidad de reacción inicial de la enzima catalasa.

-

gráfica de Michaelis-Menten

concentración(1 Velocidad Página 5

v =(9.26)/2

v =4.63 Donde extrapolando al eje de las abscisas nos da el valor de km, el valor de la constante es igual a 1.20. -

gráfica de Lineweaver-Burk

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4 1 0,66 0,5 0,4 0,38

1/V 1,07 0,26 0,17 0,13 0,1 0,1

menten debido a sus resultados se acercan a la linealidad dándonos mejores valores. INFOGRAFÍA -

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Se puede encontrar diferencia entre los dos graficos debido a q uno es logarítmico y el otro es lineal pero los datos mas confiables se dan en el lineal, siendo este el de michaelis – Página 6

Cinética enzimática http://es.wikipedia.org/wiki/Cin %C3%A9tica_enzim %C3%A1tica determinación de la actividad enzimática de peroxidasas (catalasa) http://www.uaq.mx/investigacion/ difusion/veranos/memorias2010/1 2%20Verano%20Ciencia %20Region%20Centro/UAQ %20Cedillo%20Jimenez.pdf cinética enzimática

http://es.slideshare.net/tmedi causs/clase-7-cineticaenzimatica

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