Catalasa
Determinación de la actividad enzimática de catalasa en Solanum tuberosum Determination of enzymatic activity of catalas
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Determinación de la actividad enzimática de catalasa en Solanum tuberosum Determination of enzymatic activity of catalase in Solanum tuberosum Piero. A. Juarez. A1 1
Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Escuela de Ciencia de los Alimentos, Perú
Resumen En el presente trabajo se evaluó la actividad específica de la enzima catalasa en Solanum tuberosum. Se hizo un procesamiento del material vegetal para luego utilizar la técnica por Hugo Aebi (1974), para luego mediante espectrofotometría medir la descomposición del peróxido de hidrógeno y mediante el resultado obtener la actividad enzimática de catalasa. Es recomendable seguir este estudio ya que se le puede dar aplicación en la industria alimentaria.
Palabras clave: Catalasa, Solanum tuberosum, espectrofotometría, peróxido de hidrógeno.
Abstract In this work, the specific activity of the enzyme catalase in Solanum tuberosum was evaluated. Processing the plant material and then using the technique by Hugo Aebi (1974), and then spectrophotometrically measuring hydrogen peroxide decomposition and the result obtained by the enzymatic activity of catalase was made. It is advisable to follow this study because it can give you application in the food industry Keywords: Catalase, Solanum tuberosum, spectrophotometry, hydrogen peroxide.
Introducción Muchos organismos pueden descomponer el peróxido de hidrógeno (H2O2) por la acción de las enzimas. Las enzimas son proteínas globulares responsables de la mayor parte de la actividad química de los organismos vivos. Actúan como catalizadores, que son sustancias que aceleran las reacciones químicas sin ser destruidas o alteradas durante el proceso. Las enzimas son extremadamente eficientes y se pueden utilizar una y otra vez repetidamente. Una enzima puede catalizar miles de reacciones en cada segundo. Tanto los valores de pH como de la temperatura a los que trabaja la enzima son extraordinariamente importantes. La mayoría de los organismos tienen un intervalo de temperatura preferente en el cual sobreviven y sus enzimas funcionan mejor dentro de dicho intervalo de temperatura. Si el ambiente donde se encuentra la enzima es demasiado ácido o demasiado básico, la enzima puede desnaturalizarse de forma irreversible o transformarse de modo que su forma no le permita más realizar su funcionamiento apropiado. El H2O2 es tóxico para la mayoría de los organismos vivos. Muchos organismos son capaces de destruir el H2O2 mediante la acción de enzimas antes de que pueda realizar mucho daño. El H2O2 se convierte en oxígeno y agua según la siguiente reacción: 2 H2O2 → 2 H2O + O2
Aunque esta reacción ocurre espontáneamente, las enzimas incrementan la velocidad de reacción de forma considerable. Se conoce que al menos dos enzimas diferentes catalizan esta reacción: a) Catalasa, que se encuentra en animales y protistas; b) Peroxidasa, que se encuentra en las plantas.
Mucho se puede aprender sobre las enzimas mediante el estudio de la rapidez de reacciones catalizadas por enzimas. La rapidez de una reacción puede estudiarse de muy diversas formas como: • Midiendo la presión de los productos que aparecen • Midiendo la velocidad de desaparición del substrato • Midiendo la velocidad de aparición del producto
La catalasa fue una de las primeras enzimas antioxidantes descritas, se halla prácticamente en todas las células animales y plantas. Se trata de una enzima intracelular ferriporfirínica, localizada principalmente en peroxisomas (80%) y citosol (20%). Se encuentra constituida por 4 subunidades, cada una con un grupo hemo enlazado en su centro activo. La catalaza presenta una afinidad por el H2O2 baja, es decir necesita altas concentraciones del mismo para poder trabajar rápido, aunque se ha observado una rápida inactivación de la actividad de la catalasa a concentraciones de H2O2 superiores a 0.1 M por formación de los complejos inactivos II y III: también se ha observado la inactivación de la catalasa por el anión superóxido.
Materiales y Métodos
Materiales vegetales: Se utilizó para los ensayos de las actividades enzimáticas la variedad de Solanum tuberosum o también conocida comúnmente como papa.
Materiales de laboratorio: Centrífuga, tubos de centrífuga, tubos de ensayo, pipetas graduadas, espectrofotómetro, cubetas de cuarzo.
Procesamiento del material vegetal: Se pesó 1.163 g de la muestra de Solanum tuberosum, luego esta se homogenizó y se suspendió en el tampón de lisis conteniendo tampón fosfato 50 mM, pH 7.4 y antiproteasas, se homogeniza en baño de hielo. El homogenizado obtenido se centrifuga a 14 000g durante 15 min a 4°C, es importante mantener la cadena de frio, el sobrenadante se recupera en un tubo limpio para luego realizar los ensayos de actividad enzimática con el sobrenadante obtenido.
Actividad enzimática de catalasa (CAT): La técnica utilizada fue la descrita por Hugo Aebi (1974). Este método se basa en el seguimiento de la descomposición de H2O2 para dar H2O y O2 mediante espectrofotometría
a 240nm en una solución de trabajo de tampón fosfato 50 mM pH 7.4 y H2O2 14 mM preparado en de tampón fosfato 50 mM pH 7.4.
Calculo del KM y Vmax La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v0 frente a [S]0) es una hipérbola (Figura 1). La Vmax (velocidad máxima) corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax. Para determinar gráficamente los valores de KM y Vmax es más sencillo utilizar la representación doble recíproca (1/v0 frente a 1/[S]0), ya que es una línea recta. Esta representación doble recíproca recibe el nombre de representación de LineweaverBurk (Figura 2). Es una recta en la cual:
La pendiente es KM/Vmax
La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/KM
La ordenada en el origen (1/[S]0 = 0) es 1/Vmax
De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores de KM y Vmax de un enzima para diversos sustratos.
Resultados y Discusión
Con los datos obtenidos en el Cuadro 1, se realizó una gráfica Sustrato mM vs UI/min.mg prot (Figura 1) en la cual se puede observar la formación de una hipérbola, la cual según nuestra teoría representa la gráfica de Michaelis-Menten.
Cuadro 1: Datos experimentales
Figura 1: Curva de Michaelis-Menten La velocidad máxima en la curva de Michaelis-Menten es de 64 UI/min.mg y un km de 0.083 mM Para calcular el KM y la Vmax opte por también utilizar la representación de Lineweaver Burk, en la cual se utilizan las inversas de los datos obtenidos en el Cuadro 1 para que de esta manera la gráfica sea una línea recta.
Cuadro 2: Datos invertidos
Figura 1: Curva de Lineweaver Burk
Los datos de 1/Vmax y 1/Km se hallaron por regresión lineal dando como resultado una 0.0117 y 8.357142 respectivamente, hallando las inversas de estos resultados se obtuvo 85.47 UI/min.mg y 0.1196 mM
Conclusiones
La comparación de ambas curvas difiere en sus resultados de velocidad máxima y Km, para esto se debería hallar un factor de corrección, o en todo caso utilizar la curva de Lineweaver Burk ya que se obtuvo un R muy cercano al 1 en el método de regresión lineal que se utilizó, por ende , concluyo que esta representación gráfica es más precisa.
Se concluye que a un menor Km existe una mayor afinidad de enzima por el sustrato y viceversa, a un mayor Km, menor afinidad de enzima por el sustrato
Referencias bibliográficas
Lehninger A. , et al. 2009, Bioquímica, las bases moleculares de la estructura y función celular. Ediciones Omega S.A. – Barcelona