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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

ESCUELA DE POST GRADO ESPECIALIDA DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS TEMA CURSO

: OBTENCIÓN DE AISLADO PROTEICO DE SOYA :

PROFESOR ALUMNOS

TECNOLOGÍA AVANZADA DE ALIMENTOS. :

:

msc Ing. Eduardo morales soriano.

ana v., Escalante varona. KARINA M., AGUADO Huamani. CÉSAR, HUAMANÍ SALAZAR.

NOVIEMBRE del 2010

I.- INTRODUCCION Desde el punto de vista biológico, las proteínas animales son las mejores, pero son escasas y de costo elevado. Por eso muchas investigaciones tratan de aprovechar al

máximo las proteínas vegetales. Las proteínas vegetales, generalmente son deficientes en uno o varios aminoácidos esenciales, pero esta deficiencia puede ser evitada con el mejoramiento genético de las plantas, la posibilidad de combinar diferentes proteínas vegetales o su enriquecimiento mediante agregados de productos proteicos poco explotados hasta la fecha, o bien, incorporando aminoácidos sintéticos como la lisina y metionina (Ferrer et al., 1977; citado por Guerrero 1989). Estas proteínas vegetales se pueden obtener en la forma de concentrados proteicos o aislados, los cuales pueden estar dirigidos ya sea a aumentar el nivel de proteínas en productos alimenticios básicos o como reemplazo total o parcial de las proteínas animales como ingredientes en alimentos ( Rodríguez, 1981; citado por Guerrero 1989). Las proteínas vegetales tienen muchas características físicas deseables, tales como: capacidad de retención de agua, de grasa, emulsificante, espesante y propiedades de formación de espuma, de película y de masa. Además estos aislados y concentrados proteicos contienen solamente pequeñas cantidades de carbohidratos, grasas y cenizas (Bressani, 1968; citado por Guerrero 1989). Las fuentes usuales de aislado proteico de origen vegetal son las oleaginosas, las cuales tienen un alto contenido proteico (Anson, 1962; citado por Guerrero 1989). Sin embargo en términos de economía, sostenibilidad y nutrición; la soya es la fuente más eficaz, que combina un excelente valor nutritivo con una amplia gama de propiedades funcionales. La proteína de soya posee una elevada biodisponibilidad y suministra un rango amplio y completo de aminoácidos esenciales, incluyendo la lisina que con mucha frecuencia es el aminoácido limitante (Hoogenkamp, 2005). La semilla o grano comprende tres partes principales, la envoltura, los cotiledones y el hipocotilo, cuyas proporciones respectivas y composiciones medias, se indican en el cuadro1. La composición de los granos de soya, por selección genética se logró obtener variedades más o menos ricas en proteínas (40 – 45%) y lipidos(18-20%). (Cheftel et al.1989). Cuadro 1. Composición físico química del grano de Soya. % ponderal la semilla Grano entero Cotiledones

100 90

Composición (% P/P seco) en

Proteínas

Lípidos

(N x 6,25) 40 43

Glúcidos

Cenizas

(incluye 20 23

fibras) 35 29

4,9 5,0

Envoltura 8 Hipocotilo 2 Fuente: Cheftel et al. (1989).

8,8 41

1 11

86 43

4,3 4,4

Cuadro 2. Aminoácidos en proteínas comerciales de soya(gramos de aminoácidos por 100 g de proteína) Soja Aminoácidos

Harina

desgrasada Isoleucina 4.63 Leucina 7.7 Lisina 6.2 Metionina 1.3 Cisitina 1.2 Fenilalanina 5.3 Treonina 4.2 Triptófano 1.4 Valina 4.9 Fuente: Adaptado de Badui (2006)

Aislados 4.8 7.8 6.0 1.0 1.0 5.5 3.7 1.3 4.8

Son tres los tipos de productos, según su contenido proteico, que se pueden obtener a partir de la soya. Estos son: harina o grits de soya, concentrado proteico de soya y aislado proteico de soya (Canales, 1982). Cuando las escamas, hojuelas o láminas de soya son molidas para reducir su tamaño, el producto resultante se denomina harina de soya, siendo sus partículas lo suficientemente finas como para pasar por un tamiz malla 100 (u.s.); o bien son grits, cuando el grosor de las partículas es mayor. La harina de soya tiene un contenido proteico mínimo de 50% de proteína en b.s. (Canales, 1982). Los concentrados de proteína de soya son proteínas derivadas de las láminas desgrasadas de soya, obtenidas por extracción con ácido diluido (pH 4.5) se eliminan los azúcares solubles, nitrógeno proteico y otros componentes de bajo peso molecular y una pequeña cantidad de proteína. Los concentrados proteicos de soya deben contener mínimo 70% de proteína en b.s. (Wolf, 1961; citado por Canales, 1982). Es aislado proteico de soya es definido como la mejor fracción proteica obtenida del frijol de soya de alta calidad. La materia usada para la producción de aislado proteico de soya son las hojuelas de soya desgrasada o harina, la cual tiene una proteína de alta dispersibilidad. En el proceso de extracción se humedecen las hojuelas de soya con una

cantidad apropiada de agua, controlando la temperatura, pH, tiempo y además la relación sólido líquido para obtener resultados máximos (Meyer, 1967; citado por Canales, 1982). Los aislados proteicos de soya deben contener

mínimo 90%

de proteína en b.s.

(Canales, 1982). Cuadro 3: Composición típica de un Aislado de proteína de soya. Harina COMPONENTE Proteinas Grasas Humedad Fibra cruda Ceniza

Sin desgrasar

Desgrasada

41.5 21.0 5.0 2.1 5.2

53.0 1.0 5.0 2.9 6.0

Aislado 90 0.0 4.7 0.2 3.8

ISN

-

-

85.0

ISN: Indice de solubilidad del nitrógeno Fuente: Adaptado de Badui (2006)

Proteina Las proteinas de la soya son una mezcla heterogénea de globulinas (60 a 75%) del total y de albuminas, con pesos moleculares muy variados, solubles en disoluciones salinas y en agua, y precipitan en su punto isoleléctrico, en el intervalo de 4.2 a 4.8 (Badui ,2006). La solubilidad de las proteínas de la soya en agua es fuertemente afectada por el pH, como se muestra en la Figura 1. Casi el 85% del nitrógeno es soluble a pH 2 ó 7 ( y a pH 11 puede solubilizarse hasta un 95%). Un perfil de solubilidad parecido se observasi se utiliza una torta desengrasada de soya. Las globulinas, principales constituyentes proteicos, son insolubles en una zona de pH (3.7 – 5.2) situada en torno de su punto isoeléctrico (pH 4.2 – 4.6), pero pueden solubilizarse progresivamente a esos mismos pH por aumento de la fuerza iónica (con NaCl, por ejemplo) (Cheftel et al. 1989).

Figura 1. Extracción de la proteína a diferente svalores de pH.

Fuente: Badui (1990) La baja solubilidad a pH 4.2 – 4.6 se utiliza para preparar los aislados proteicos de soya por “precipitación isoeléctrica” (Cheftel et, al. 1989). Despues de la disolución en agua o a un pH ligeramente alcalino, las proteínas de soya pueden separarse en varias fracciones por cromatrografía permeable de gel, electroforesis, ultracentrífuga, etc. Cuando se utilizan esta ultima tecnica se separarn cuatro fracciones cuyos coeficentes de sedimentación S20, w (unidades Svedberg, a 20ºC, en el agua son respectivamentes iguales a 2S, 7S, 11S y 15S. Las globulinas 11S y 7S representan por si solas más del 70% del las proteinas del grano de soya. La relación globulina 11S/globulina 7S esta comprendida entre 0.5 a 3, según la variedad de soya. (Cheftel et, al. 1989). Así la globulina 11S o glicinina de alto peso molecular y que de amnera indicidual es el polipéptido más abundanteen la soiya,puesto que representa el 31% del total

esta

constituida de 12 subunidades, 6 de carácter acido y 6 de carácter alcalino. Los pesos moleculares de las subunidades son de 37200 y 22300 para las ácidas y las básicas (Cheftel et, al. 1989) ( Badui 2006).

La fracción 2S esta compuesta por polímeros de peso molecular bajo (8000-21500), solubles en su punto isoeléctrico y contiene los inhibidores de tripsina de Bowman-Birk y de Kunitz ( Badui 2006). La fracción 7S esta basicamente integrada por cuatro proteínas , dos de las cuales son enzimas (β-amilasa y lipoxigenasa), una es hemaglutininay la otra, la globulina 7S , a un pH de 7.6 y una fuerza iónica de 0.5, tiene un peso molecular de 186000 a 210000. Mientras que la 15S no se ha estudiado tanto como oas anteriores, pero se supone que puede ser un polímero de la 11S; ésta es la fracción de mayor peso molecular (Badui 2006). Las fuerzas que hacen posible la formación de geles son diversas y algunas influyen más en una fracción proteínica; la 11S y la 7S interaaccionan cuando se calientan y ayudan a producir rápidamente ese estado de dispersión; sin embargo, en forma indicvidual, la 7S establece geles por medio de puentes de hidrógeno, mientras que los provenientes de la 11S lo hacen gracias a la cración de interacciones electrostáticas con iones divalentes y de enlaces disulfuro (Badui 2006).

Muchos de los usos de los productos de la soya están basados en las propiedades funcionales de las proteínas de la soya. Estas características incluyen la propiedad de estas proteínas para espesar (viscosidad), emulsificar, formar geles, espumas, absorber agua y/o grasa y crear estructuras texturizadas parecidas a la carne (Canales, 1982).

Uno de los métodos para determinar proteínas es el Método de Biuret, que se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu 2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu 2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero) (Fernández; 2008). En el presente trabajo se realizo lo obtención del aislado proteico a partir de una fuente vegetal, se determinó la capacidad de retención de agua de un aislado proteico de soya y la cuantificación de proteínas por el método de Biuret; con la finalidad de evaluar sus

propiedades funcionales importante para la aplicación tecnológica en la industria alimentaria.

II. OBJETIVOS 

Obtener aislado proteico a partir de una fuente vegetal.



Cuantificación de proteínas por el método de Biuret.

III.- MATERIALES Y METODOS

3.1. Materiales, equipos e instrumentos 3.1.1. Materiales 

Agua destilada



Harina de soya

3.1.2. Reactivos 

Solución de hidróxido de sodio 1 N



Solución de ácido clorhídrico 1 N



Reactivo de Biuret



Reactivo blanco de Biuret

3.1.3. Materiales y equipos 

Beaker de 1 litro



Tubos de centrifuga



Placas petri



Embudo de vidrio



Papel filtro



Matraz 500ml



Centrífuga



Estufa



Potenciómetro



Agitador magnético



Tubos



Tubos de centrifuga



Micropipeta



Pipeta de 5 ml



Baguetas



Centrifuga



Potenciómetro



Vasos de precipitado

3.2. Metodología experimental A. Extracción de Proteínas 

Se mezcló 50 g de harina de soya con 750ml de agua (1:15) y homogenizar.



Se ajustó lentamente el pH hasta 9 con hidróxido de sodio 1N, con agitación continua durante 40 minutos.



Se centrifugó a 3000 rpm durante 15 minutos. Separar El sobrenadante del residuo por filtración (si fuera necesario).



Se ajustó el pH del sobrenadante a 4,5 con ácido clorhídrico 1 N, con agitación continua por 15 minutos.



Se centrifugó a 3000rpm durante 15 min. Luego se separó el sobrenadante y el precipitado. Se transfirió el precipitado a una placa petri previamente pesada. Se colocó la placa en una estufa (Temperatura = 50 °C tiempo = 24hr.; hasta peso constante).



Finalmente, se guardó el aislado proteico para los análisis de proteína correspondientes.

En la Figura 2 se aprecia el flujo de operaciones que se siguió en laboratorio para realizar la extracción del aislado proteico de soya. Figura 2. Flujo de Operaciones para la obtención del Aislado Proteico de Soya

Harina de soya

Hidratación

Agitación ( pH = 9)

Centrifugar

Filtrar

Agitación ( pH = 4.5)

Centrifugar

Secado

50g.harina de soya + 750ml Agua destilada (1:15) Homogenizar.

Ajustar con NaOH-1N PH = 9 Agitación x 40 min.

3000rpm x 15 min.

Precipitado

Ajustar con HCl-1N PH = 4.5 Agitación x 15 min.

3000rpm x 15 min.

T = 50°C Tiempo = 24 hors.

Aislado

B. Determinación de proteína por el método de BIURET PROCEDIMIENTO 1. Se pipeteó 5 ml del reactivo de Biuret en una serie “prueba” de tubos de ensayo y 5 ml del blanco de Biuret en una serie “Blanco”. 2. Se pipeteó 100ul de espécimen (proteína extraída o proteína estándar) en cada tubo de la serie. Se mezcló bien con vortex o por inversión repetida después de cubrir los tubos con parafilm. Se preparó un blanco de muestra, mediante la adición de 100ul de agua a 5ml del reactivo de Biuret.

3. Se incubó los tubos a temperatura ambiente por 30 minutos o a 37°C por 10 minutos. 4. Se fijó la absorbancia en cero a 540nm con el blanco del reactivo de Biuret. Se leyeron las absorbancias de la serie “blanco”, luego se leyeron las absorbancias del blanco de muestra y la serie “prueba”. 5. Calcular de la siguiente manera: a. Sustraer tanto los blancos de reactivo y el blanco de muestra de las absorvancias (A) obtenidas para la serie “prueba”. Aneta  A prueba  Ablancoreactivo  Ablancomuestra

El blanco de muestra con el reactivo de Biuret deberá leer 0.095 – 0.105 para un tubo de 1 cm paso de luz para el reactivo descrito. 6. Se reemplazó la absorvancia neta en la ecuación obtenida de la curva estándar de albúmina.

IV.- RESULTADOS Y DISCUSIONES

El método de extracción realizado en el laboratorio, corresponde a una extracción negativa; ya que se eliminó todo lo que no se necesitaba y al final fue quedando sólo la proteína. En la etapa de hidratación y agitación, se realizó la extracción de la proteína utilizando un pH extremo de 9; ya que a este pH se solubiliza la proteína. Según Anson (1962), citado por Guerrero (1989); uno de los métodos más utilizados consiste en aislar la proteína por tratamiento de la materia a pH alcalino, seguido por una precipitación en su punto isoeléctrico. Asimismo, Borgeois y Le Roux (1986), mencionan que la solubilidad de la

proteína varía con el pH, temperatura, fuerza iónica y la constante dieléctrica del solvente; incrementándose ésta al aumentar la fuerza iónica, hasta llegar a un valor óptimo. Luego de la solubilización de la proteína, existió una etapa de centrifugación; ya que según Wilcke (1979), citado por Guerrero (1989); la centrifugación ayuda a separar a la proteína de la fracción insoluble compuesta por polisacáridos y fibra cruda. En la segunda etapa de agitación, donde se ajustó el pH a 4.5, se hizo precipitar a la proteína que se encontraba soluble en el primer sobrenadante; con el fin de obtener a la proteína pura y eliminar otras sustancias indeseables. Según Wood et al. (1974), citado por Guerrero (1989); menciona que las proteínas pueden ser precipitadas selectivamente manipulando el pH, la fuerza iónica y la constante dieléctrica del solvente. Los métodos preferidos son la precipitación en el pH isoeléctrico, puesto que implican menor riesgo de desnaturalización proteica. Smith y Circle (1978), citados por Rodríguez (1981); a su vez citado por Guerrero (1989); encontraron una solubilidad mínima de la proteína de soya a pH 4.2, correspondiendo al punto isoeléctrico de la mayoría de proteínas. La precipitación isoeléctrica es por lo tanto útil para concentrar globulinas y para separarlas de los constituyentes menores como azúcares y sales, que son extraídas de la harina junto con las proteínas.

Figura 3: Etapas de extracción de aislado proteico de soya. (a)

(b)

(c)

(a) Extracción de proteina de soya a pH alcalino, (b) Proteina de soya centrifugada, luego de precipitación en el punto isoeléctrico, (c) Aislado proteico de soya, antes del secado.

A continuación, en el Cuadro 4, se observa el rendimiento en peso del aislado proteico de soya, respecto a la materia prima inicial.

Cuadro 4: Rendimiento en peso del aislado proteico de soya.

Rendimiento soya repet 1 soya repet 2

Peso Inicia(gr) 50 50

Peso final(gr) 18.86 16.9404 Promedio

Rdto. (%) 37.72 33.88 35.80

Como se observa en el Cuadro 4, el rendimiento en peso, respecto a la cantidad inicial de harina; fue de 35.80%. Este resultado es un poco bajo comparado con el hallado por Robles y Mora (s.a.), quienes obtuvieron rendimientos de 58.32% (para la harina desgrasada con hexano) y 70.83% (para la harina desgrasada con etanol); utilizando el mismo método de extracción que el realizado en práctica. Entonces, se puede suponer que un desgrasado previo de la muestra mejora el rendimiento de extracción, razón por la cual nosotros obtuvimos un rendimiento menor; ya que no desgrasamos la harina de soya. A continuación se presenta la curva estándar preparada con concentraciones conocidas de albúmina los cuales fueron comparados con la muestra inicial para determinar en ella la concentración de proteína total. Se utilizó albúmina porque es la que más se asemeja a la globulina , que es la proteina encontrada en el aislado proteico de soya ( Meyer, 1966; citado por Canales, 1982).

Figura 2: Curva Estándar de Albúmina.

Para determinar el contenido de proteina de la harina de soya, se extrajo una muestra de la proteina que se solubilizó a pH 9 y ésta se sometió a la prueba de Biuret. Este método utiliza el reactivo de Biuret, el cual detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida (Wikipedia, 2010). Al realizar el análisis por el método de Biuret, se apreció un cambio de color de azul a un color violeta-morado. Según (FAO, 1997), la coloración púrpura se presenta cuando los iones cúpricos son complejados por los enlaces peptídicos a pH alcalino. El matiz del color depende del tipo de proteína y su intensidad depende del contenido de proteína presente. La reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar la reacción (Fernández y Galván, 2008).

La sensibilidad del método de Biuret es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (Fernández y Galván, 2008), es por ello que este método es muy útil para determinar proteina en aislados proteicos. De la prueba de Biuret se obtuvo el siguiente cuadro, con los resultados de la absorbancia neta:

Cuadro 3: Absorbancia neta de la muestra por el método de Biuret. Muestra

Blanco reactivo

Prueba

Blanco muestra

absorbancia neta

0.163

0.964

0.65

0.151

0.151

0.895

0.643

0.101

Abs. Promedio

0.126

soya Repetto 1 soya Repetto 2

La absorbancia promedio obtenida para la muestra de soya fue de 0.126. Esta absorvancia se reemplazó en la ecuación correspondiente de la curva estándar de la albúmina, obteniendose un resultado de 25.833 g de albúmina/ litro de solución. Luego, como no se sabe la concentración de proteína de la harina de soya utilizada; se asumió que ésta tenía una concentración de 50% de proteina, es decir 25g de proteina. Entonces se realizó los siguientes cálculos: - Se multiplicó el resultado obtenido en Biuret con la cantidad de agua que se utilizó para hidratar los 50 g de harina de soya.

25.833

g  0.75 L  19.375 g de proteina L

- Luego el resultado anterior se expresó como rendimiento en peso de proteina extraido, respecto a la cantidad de proteina en la materia prima. Rendimiento de Proteina extraida (%) 

19.375  100%  77.5% 25

Entonces se obtuvo que de un total de 25 g de proteina que contenia la harina de soya inicial, se logró aislar 19.375 g de proteina, o en otras palabras el rendimiento proteico de la extracción fue de 77.5 %.

V.

CONCLUSIONES y RECOMENDACIONES

- El rendimiento en peso de la proteina extraida, respecto a la cantidad de materia prima inicial, fue de 35.83% .

- Usando el método de Biuret, el rendimiento en peso de la proteina, respecto a la cantidad de proteina contenida en la harina de soya (considerando que ésta tenía 50% de proteina), fue de 77.5%. - Se recomienda realizar un desgrasado previo de la materia prima, para obtener mejores rendimientos. - Se recomienda realizar el análisis del contenido proteico del aislado obtenido, para poder conocer el porcentaje de proteina que éste posee y el cual debería ser de un mínimo de 90%.

VI.

BIBLIOGRAFIA



Badui, S. 1990. Química de los Alimentos. Editorial Alhambra. 2da edición, México



Badui, S. 2006. Química de los Alimentos. Editorial Pearson Educación. 4ta edición, México



CANALES, D. 1982. Elaboración de Pastel de carne con proteína aislada de soya. Tesis para opt. Tit. Ing. Ind. Al. UNALM. Lima. Perú

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CHEFTEL, J. C. 1989. Proteinas alimentarias: Bioquimica, Propiedades funcionales, Valor nutricional, Modificaciones químicas. Editorial Acribia. Zaragoza. España.

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FAO. 1997. Producción y manejo de datos de composición química de alimentos em nutrición. Univ. de Chile. Página web disponible en: http://www.fao.org/docrep/010/ah833s/AH833S00.htm#Contents



FERNÁNDEZ, E. y GALVÁN, A. 2008. Métodos para la cuantificación de proteínas. Prática. Departamento de Bioquímica y Biologia Molecular. Córdoba. Argentina.

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GENTA, M y ALVAREZ, N. 2006. El Complejo Soja. Página web disponible en: http://www.herrera.unt.edu.ar/revistacet/anteriores/Nro28/PDF/N28Ext01.pdf

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GUERRERO, D. 1989. Obtención de un aislado proteico a de germen de quinua (Chenopodium quinoa Willd) desgrasado. Tesis para opt. Tit. Ing. Ind. Al. UNALM. Lima. Perú.

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ROBLES, M. y MORA, R. 2007 . Influencia del Método de Obtención en las Características Fisicoquímicas, y Estructurales de Aislados de Soya. Escuela Nacional de Ciencias Biologicas. Colombia. Página web disponible en: www.respyn.uanl.mx/especiales/2007/ee.../CNCA-2007-103.pdf .



WIKIPEDIA.

2010.

Biuret.

Página

web

disponible

http://es.wikipedia.org/wiki/Biuret .

VII.

ANEXOS Anexo 1. Producción de Proteina Aislada de Soya

en:

El procedimiento convencional para la producción de PAS (ISP-en Inglés-)está basado en la solubilización de la proteína en un pH neutro o ligeramente alcalino, precipitación por acidificación en la región isoeléctrica, cerca de pH 4.5. El producto resultante es el “APS (ISP) isoeléctrico”. Tiene baja solubilidad en agua. Se pueden producir diferentes “proteinatos” resuspendiendo el PAS en agua, neutralizándolo con diferentes bases y secando por atomización la solución o suspensión resultante. De acuerdo con la base utilizada para la neutralización se producen proteinatos de sodio, potasio, amonio o calcio. Los primeros tres son altamente solubles en agua y producen soluciones con propiedades de alta viscosidad, espumado, formación de geles y emulsificación (Genta y Alvarez 2006). El proteinato de calcio tiene baja solubilidad. Los PAS de baja solubilidad (inertes) son usados en donde las formulas piden un alto nivel de incorporación de proteína sin excesiva viscosidad u otras contribuciones funcionales. Debido a que el secado en “spray” es el método común de secado en la producción del PAS, la forma física primaria del PAS en el mercado es la de polvos finos (Genta y Alvarez 2006). Figura 2. Aislado de proteina de soja

Fuente : Genta y Alvarez (2006).