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v2014 FACULTAD DE SALUD ESCUELA DE TECNOLOGÍA MÉDICA UNIVERSIDAD SANTO TOMÁS SEDE SANTIAGO

MANUAL DE LABORATORIO

BANCO DE SANGRE & INMUNOHEMATOLOGIA

Autor Prof. TM MgCs Guillermo Jerez Revisado por Prof. TM Dr. José Caamaño Prof. TM MgCs Franco del Valle Prof. TM Monserrat Bustamante

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INDICE I N D I C E.......................................................................................................................................... 1 NORMAS DE BIOSEGURIDAD ...................................................................................................... 5 PRECAUCIONES EN LOS LABORATORIOS ............................................................................. 12 REACTIVOS USO FRECUENTE EN BANCO DE SANGRE E INMUNOHEMATOLOGIA.. 14 CALIBRACIÓN DE CENTRÍFUGA INMUNOHEMATOLÓGICA ............................................ 15 PREPARACIÓN DE GLÓBULOS ROJOS SENSIBILIZADOS .................................................. 17 PREPARACIÓN CONTROL ANTI-D ............................................................................................ 19 CONTROL DE CALIDAD DE LOS SUEROS CLASIFICADORES ABO................................... 20 Inspección visual .............................................................................................................................. 20 Recomendaciones de la OMS........................................................................................................... 22 CONTROL DE CALIDAD DE LOS SUEROS Rh, anti D ............................................................. 23 Inspección visual .............................................................................................................................. 23 Especificidad..................................................................................................................................... 23 Potencia ............................................................................................................................................ 23 Avidez ................................................................................................................................................ 23 Recomendaciones de la OMS........................................................................................................... 24 Especificidad..................................................................................................................................... 25 Potencia ............................................................................................................................................ 25 CONTROL DE CALIDAD REACTIVOS MISCELANEOS .......................................................... 26 CONTROL DE CALIDAD DEL SUERO DE COOMBS ............................................................... 27 TÍTULO DE LA FRACCIÓN IgM y DE LA FRACCIÓN IgG DEL REACTIVO ANTI-D......... 30 DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO ABO Y RH EN LAMINA Y TUBO ................. 31 CLASIFICACIÓN Rh ..................................................................................................................... 35 CLASIFICACIÓN ABO Y RH EN MICROPLACAS .................................................................... 36 DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO POR TÉCNICA EN GELES BIO-TYPE® ..... 39 ANÁLISIS DE CAUSAS DE DISCREPANCIAS EN LA CLASIFICACIÓN ABO/Rh ............... 41 ANÁLISIS DE SUBGRUPOS SANGUÍNEOS ............................................................................... 41 CONCLUSIONES:........................................................................................................................... 44 ANTIGENO B ADQUIRIDO POR INDIVIDUOS A1................................................................... 45 Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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Debilitamiento de antígenos A, B y H ............................................................................................. 45 Secretores y no secretores ................................................................................................................ 45 Aglutinación de campo mixto .......................................................................................................... 45 Discrepancias entre pruebas con eritrocitos y suero....................................................................... 46 Resolución de discrepancias ABO ................................................................................................... 46 Resolución de discrepancias debidas a la ausencia de antígenos esperados ................................. 47 Resolución de discrepancias debidas a reacciones inesperadas con anti-A y anti-B ................... 47 Eritrocitos revestidos por anticuerpo ............................................................................................... 48 Resolución de discrepancias debidas a reacciones séricas inesperadas......................................... 48 DETECCIÓN DE ANTÍGENOS SOLUBLES EN SECRECIONES ............................................ 50 PRUEBA DE COOMBS DIRECTA E INDIRECTA EN TUBO ................................................... 52 TÉCNICA EN GEL PARA PRUEBA DE COOMBS DIRECTA E INDIRECTA ........................ 54 Coombs directo en gel ................................................................................................................ 56 INVESTIGACIÓN DE MUESTRAS Rh NEGATIVAS, Rh POSITIVAS DÉBILES o Rh POSITIVA PARCIAL ...................................................................................................................... 57 DETERMINACIÓN DEL FENOTIPO Rh-Hr Y CÁLCULO DEL GENOTIPO MÁS PROBABLE ...................................................................................................................................... 58 Tabla 1. Genotipos probables........................................................................................................... 60 Tabla 2. Frecuencia Genética en Población de Santiago. Cuadro Comparativo. ......................... 60 Tabla 3. Frecuencia Genética de Antígenos Rh.............................................................................. 60 CLASIFICACIÓN ABO Y RH EN EL RECIÉN NACIDO ........................................................... 61 CLASIFICACIÓN ABO Y RH EN EL RECIÉN NACIDO EN GEL(Bio-type) .......................... 62 IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES ......................................................... 65 CALCULO DE PROBABILIDAD MÉTODO EXACTO DE FISHER ......................................... 67 TITULACIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES .................................................................. 68 ESTUDIO DE MUESTRAS CON TEST DE ANTIGLOBULINA HUMANA DIRECTA POSITIVA ........................................................................................................................................ 70 TÉCNICA DE AUTOADSORCIÓN DE ANTICUERPOS CALIENTES ..................................... 73 TÉCNICA DE ELUCIÓN ÁCIDA .................................................................................................. 76 ESTUDIO DE CRIOAGLUTININAS ............................................................................................. 77 Título de crioaglutininas ............................................................................................................. 79 ESTANDARIZACIÓN DEL LISS ................................................................................................... 81 Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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INTRODUCCIÓN:........................................................................................................................... 81 MATERIALES ................................................................................................................................. 81 ACTIVIDAD PRÁCTICA ................................................................................................................ 82 RESULTADOS ................................................................................................................................. 83 TÉCNICA DEL POLIBRENE ........................................................................................................ 84 TECNICA ENZIMATICA PAPAÍNA EN DOS ETAPAS ............................................................. 85 BANCO DE SANGRE Y MEDICINA TRANSFUSIONAL ................................................... 87 PUNCIÓN SANGRE VENOSA EN BANCO DE SANGRE .......................................................... 87 EXAMEN FÍSICO AL DONANTE DE SANGRE ......................................................................... 89 TÉCNICA DE DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA (Hb) ................................................. 91 INSTRUCTIVO PARA LA SELECCION DE UN DONANTE DE SANGRE .............................. 94 1.- INTRODUCCIÓN: ...................................................................................................................... 94 DONACION EN BANCO DE SANGRE GLOSARIO DE TERMINOS ................................... 95 2.- NORMAS PARA EL LLENADO DE LA ENCUESTA: ..................................................................... 97 7.- PREGUNTAS DE LA ENCUESTA: ............................................................................................... 99 MEDICAMENTOS DISPONIBLES EN CHILE QUE PUEDEN AFECTAR LA AGREGACIÓN PLAQUETARIA ............................................................................................................................. 112 MEDICAMENTOS CONTRAINDICADOS PARA DONAR SANGRE ...................................... 115 RECONOCIMIENTO Y MANEJO INICIAL DE LAS REACCIONES ADVERSAS A LA DONACION ................................................................................................................................... 117 MANEJO DE LAS REACCIONES ADVERSAS A LA DONACION DE SANGRE .................. 119 Medidas generales.................................................................................................................. 119 Desmayos ................................................................................................................................ 119 Náuseas y vómitos .................................................................................................................. 119 Espasmos musculares y calambres ........................................................................................ 119 Hematoma .............................................................................................................................. 120 Punción arterial. ..................................................................................................................... 120 Convulsiones ........................................................................................................................... 120 PREPARACIÓN DE HEMODERIVADOS Y CONTROL DE CALIDAD ................................. 122 Cálculo para la extracción de sangre de donantes que pesan menos de 50Kg..................... 122 FRACIONAMIENTO DE LA SANGRE....................................................................................... 123 CONTROL DE CALIDAD DE LOS HEMOCOMPONENTES .................................................. 126 PRUEBAS PRETRANSFUSIONALES ........................................................................................ 127 Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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DESPACHO DE TRANSFUSIONES ........................................................................................... 128 PRUEBAS DE COMPATIBILIDAD EN GEL ............................................................................. 130 PRUEBA DE COMPATIBILIDAD RUTINARIA SALINA-POPIETILENGLICOL ................ 130 (PEG) 37ºC- anti-IgG ..................................................................................................................... 130 INDICACION DE LA TRANSFUSION ....................................................................................... 132 REACCIONES ADVERSAS A LA TRANSFUSIÓN SANGUÍNEA ........................................... 142 SOLUCIONES INTRAVENOSAS Y SU RELACIÓN CON LA TRANSFUSIÓN SANGUINEA Y HEMOCOMPONENTES ........................................................................................................... 146 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................ 147

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NORMAS DE BIOSEGURIDAD Introducción Debido a la importancia que involucra el Servicio de Medicina Transfusional dentro de la actividad de un Hospital Asistencial, por su apoyo en el tratamiento de los pacientes que lo requieren y porque su trabajo lo realiza utilizando como elemento principal SANGRE, es que se hace necesario establecer líneas de trabajo claras a fin de: 1.- Disminuir el riesgo de accidentes al manipular en forma incorrecta objetos contaminados protegiendo al que ejecuta el procedimiento y a terceros. 2.- Facilitar el trabajo con objetos contaminados con fluidos de alto riesgo, cumpliendo con las PRECAUCIONES UNIVERSALES establecidas.

PRECAUCIONES UNIVERSALES

Antes de avanzar en las normas propiamente tales, es necesario dejar claro algunos conceptos importantes para realizar nuestro trabajo, que están vigentes en todo el quehacer del personal de salud de nuestro país de las cuales daremos un resumen a continuación: "Las Precauciones Universales de sangre y fluidos corporales, son medidas destinadas a proteger al personal de salud de la exposición a productos biológicos contaminados provenientes de cualquier paciente, en relación a la potencial infección laboral producida por gérmenes patógenos cuya transmisión sea por la sangre". Sus objetivos son: 

Prevenir en el personal de salud de las potenciales exposiciones de patógenos transmitidos por sangre y fluidos de alto riesgo.



Determinar uso racional de barreras que reduzcan el potencial riesgo de exposición a sangre y fluidos de alto riesgo.

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FLUIDOS CORPORALES Son todas las secreciones o líquidos biológicos fisiológicos o patológicos que se producen en el organismo. Dada la posibilidad de transmitir patógenos se han dividido en: 1.- Fluidos corporales de alto riesgo. 2.- Fluidos corporales de bajo riesgo. 3.- Otros fluidos en área especial.

1.- Fluidos de alto riesgo: Son aquellos en los que se ha encontrado mayor concentración de patógenos y que facilitan su transmisión. En estos siempre se deben aplicar las Precauciones Universales. - Sangre y sus derivados. - Semen, secreciones vaginales. - Todos los tejidos. - LCR, líquido sinovial, líquido pleural, líquido peritoneal, líquido pericárdico, líquido amniótico. - Fluidos corporales que contengan sangre visible.

2.- Fluidos de bajo riesgo: Si bien se han aislado virus, la frecuencia y la cantidad aislada no representa riesgo potencial de infectarse. Se requiere solo aplicar medidas de protección de sentido común. - Deposiciones, orina. - Secreciones nasales, óticas. - Lágrimas, sudor. - Expectoración, vómito. - Saliva en la piel.

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3.- Otros Fluidos: a) Saliva: La excreción viral del VIH y VHB por la saliva es escasa y ocasional. La posibilidad de infectarse por este tipo de fluido es remota y sólo aquel personal en contacto prolongado debe tomar medidas como por ejemplo: dentistas, anestesistas, etc. b) Leche Materna: Ha sido implicada en la transmisión perinatal del virus VIH, así como también VHB en madres infectadas. No se ha implicado en la transmisión del VIH y VHB al personal de salud. Por lo tanto no se aplican las Precauciones Universales salvo en situaciones especiales (personal que trabaje en Lactarios). "EL RIESGO DEL PERSONAL DE SALUD DE ADQUIRIR LA INFECCION DE HEPATITIS B, C y VIH-SIDA DURANTE LA PRACTICA PROFESIONAL ESTÁ ASOCIADO PRINCIPALMENTE A LA EXPOSICIÓN PARENTERAL CON SANGRE INFECTADA". Para disminuir el riesgo de exposición a sangre, fluidos corporales de alto riesgo, fluidos corporales de bajo riesgo y otros fluidos corporales en los cuales se hace necesario aplicar las Precauciones Universales se deberían usar las Barreras Protectoras.

BARRERAS PROTECTORAS Deberán utilizarse rutinariamente en cualquier paciente independiente de su calidad de infectado o no, ya sea en hospitales, laboratorios, atención ambulatoria, diálisis y anatomía patológica. Las precauciones universales no son solo la aplicación de barreras protectoras, sino un cumplimiento a las recomendaciones de rutina para prevenir infección. Haciendo uso de ellas en forma racional por su elevado costo y modificando técnicas de rutina a fin de disminuir riesgos. EL RIESGO DE TRANSMISION INTRAHOSPITALARIA DE GÉRMENES POTENCIALMENTE INFECCIOSOS TRANSMITIDOS POR LA SANGRE U OTROS FLUIDOS CORPORALES PUEDEN MINIMIZARSE, SI EL PERSONAL DE SALUD APLICA EN LA ATENCIÓN DE CUALQUIER PACIENTE LAS SIGUIENTES MEDIDAS: I. LAVADO DE MANOS: Es una de las medidas más sencillas y más importantes para cortar la cadena de transmisión de infecciones. El lavado de manos y otras superficies de la piel se realizará con agua, jabón y/o antisépticos, inmediata y cuidadosamente si han sido contaminadas con sangre y fluidos corporales. Deberá realizarse de rutina independiente del uso de guantes, antes y después de atender a cualquier paciente. II. PREVENIR LESIONES: Causadas por material corto-punzante, durante la realización de procesamientos clínicos, de laboratorio, limpieza del material y eliminación de desechos.

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1. Material Desechable Corto-Punzante: Material como agujas bisturíes, hojas de afeitar, máquinas de rasurar, catéteres, teflones, venoflex, lancetas, simplate, etc.,deberán ser desechados en cuanto cese su uso. 2. Manipulación del Material Corto-Punzante: Material corto-punzante es todo aquel que habiendo estado o no en contacto con sangre y fluidos corporales, es capaz de producir lesiones por punción y/o corte, por lo que significan un riesgo para los manipuladores y para la comunidad. Para facilitar su manejo se dividen en: 2.1. Material Cortante: Principalmente material de vidrio que no ha estado en contacto con sangre y fluidos de alto riesgo. Frascos, vidrios, botellas, ampolletas, tubos, etc., sin sangre ni fluidos corporales, termómetros, láminas, porta objetos, etc. En lo que respecta a su eliminación destacamos, en este resumen solamente lo siguiente, puesto que se aplicará en nuestro Banco de Sangre principalmente. Los receptáculos que los recepcionen deben ser de paredes semi-rígidas (cartón o plástico) y serán llenados solo a 3/4 partes de su capacidad. En el servicio de Banco de Sangre dichos receptáculos serán las cajas de "SAFE BOX" que vienen rotuladas con el logo de Riesgo biológico PELIGRO MATERIAL CONTAMINADO (ROJO) Precauciones : -

Manipular con precaución, no comprimir ni apretar para evitar accidentes.

-

No necesita descontaminación previa a su eliminación.

-

Destino: Basura o desechos comunes, los receptáculos serán retirados de las respectivas áreas sucias por el personal de aseo para transportarlas al área de recolección final (área del compactador) siempre separadas del resto de la basura.

2.2. Material Corto-punzante: Este material necesita descontaminación e incineración previa a su eliminación. Incluye material como: agujas, lancetas, capilares, tubos de vidrio con sangre o fluidos de alto riesgo, bisturíes, hojas de afeitar, tubos venoject, simplate, etc., que han estado en contacto con sangre o fluidos de alto riesgo. - Recomendaciones: No deberán manipularse, doblarse o retaparse las agujas. En caso de ser necesario, en su manipulación deberá utilizarse como intermediario una pinza. - Disposición de eliminación: El material corto-punzante deberá eliminarse en receptáculos especiales y exclusivos para este fin, como: cajas de cartón grueso, rígida o semi-rígida, metal, plástico semi-rígido que permitan la descontaminación por medio del calor. Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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- No debe manipularse el contenido por lo cual no se recomienda uso de recuperables. - Los dispositivos o receptáculos para la eliminación deberán estar localizados lo más cerca posible de las áreas de uso, por ej.: clínica, sala área sucia, unidad del paciente, bandeja de exámenes. - Una vez lleno en sus 3/4 partes deberá sellarse para ser trasladado al área sucia de material "CORTO-PUNZANTE". - Si se usara receptáculos de cartón, tenga especial precaución de que no se moje o humedezca, en estos casos cubrir el interior con una bolsa plástica antes de iniciar su uso. - Las cajas serán retiradas desde el área sucia por el personal de Higiene Ambiental en horarios y recorrido específico. - Los servicios que no dependan del servicio de recolección, deberán llevar los receptáculos de desechos corto-punzante directamente al área de compactación de basura. Precauciones: - Necesita descontaminación previo a su eliminación. - No comprimir, apretar o estrechar ni cargar los receptáculos, manipule con precaución. -

Si no es impermeable el dispositivo, evite que se humedezca o moje durante el período de servicio (proteger con bolsa plástica antes de llenarlo).

III. USO DE GUANTES DE PLÁSTICO, GOMA O LÁTEX: El uso de guantes, puede evitar la contaminación de las manos con fluidos corporales de alto riesgo, pero no protege de las heridas causadas por punción con instrumentos corto-punzantes. La probabilidad de contaminarse con fluidos de alto riesgo depende de múltiples factores personales y ambientales, razón por la cual se deben tener presente los siguientes aspectos: - Uso de guantes: Al realizar una punción venosa o arterial u otro acceso vascular; Si va a tomar contacto con fluidos de alto riesgo; Al manipular material sucio y/o contaminado; Al limpiar superficies manchadas con sangre o fluidos de alto riesgo. La Selección de los guantes dependerá del tipo de procedimiento y/o técnica a realizar, en relación al riesgo.

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Recomendaciones generales Lavado de manos antes y después de usar guantes. Cambiarse los guantes entre cada paciente, si no fuera posible y está usando solo guantes limpios, lavarse las manos con los guantes entre cada atención y entre paciente y paciente. -

Uso de guantes de látex estériles: En procedimientos y técnicas que conlleven contacto con áreas normalmente estériles del organismo, en procedimientos invasivos y en los que esté alterada la integridad de la piel. En general en todos los procedimientos que requieran de técnicas aséptica.

-

Uso de guantes limpios de látex : En procedimientos que impliquen que la persona que ejecuta la acción esté en contacto con fluidos de alto riesgo o sangre. Es una medida de protección para el que realiza el procedimiento.

-

Uso de guantes de polietileno: Se utilizan en procedimientos en donde se tiene que tomar contacto con fluidos de bajo riesgo.

-

Uso de guantes domésticos : En todas las funciones de aseo que lo requieran según la norma; en el lavado y preparación de material o instrumental sucio; manipulación de ropa sucia y basura.

Para cualquier tipo de guante es necesario recalcar que: - Deben ser de uso personal. - Reponerse de inmediato si están rotos o pinchados. -

Cada usuario responde por su desinfección, secado y entalcado.

-

Deben estar identificados.

IV. USO DE PECHERA PLASTICA: Es necesario el uso de pechera plástica impermeable en todos los procedimientos en los que con frecuencia se producen derrames o salpicaduras con sangre o fluidos de alto riesgo. Ejemplos: - Lavado de material sucio y/o contaminado. - Procedimientos invasivos. - Trabajo en Laboratorio de Urgencia, Laboratorio de rutina y Unidad de Donantes. Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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Características de las pecheras: - Impermeables. - Largas (cubrir por lo menos bajo la rodilla). - Es suficiente su desinfección con solución de cloro(30 cc por 900 de agua). - Si se contaminan deben desinfectarse de inmediato con solución de cloro (100 cc por 900 de agua).

V. USO DE MASCARILLA: Su objetivo es proteger la mucosa bucal y nasal, así como también la piel de la cara de eventuales salpicaduras y aerosoles de sangre y fluidos de alto riesgo.

VI. USO DE ANTEOJOS PROTECTORES: Su objetivo es proteger la mucosa ocular ante eventuales salpicaduras o aerosoles de sangre y fluidos de alto riesgo. Recomendaciones: Los anteojos no requieren esterilización, solo lavar con agua y jabón (solución desinfectante) si se contaminan con sangre.

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PRECAUCIONES EN LOS LABORATORIOS La sangre y otros fluidos de todos los pacientes deben considerarse infectados. Recomendaciones: 1. Todas las muestras de sangre y fluidos corporales deben colocarse en cajas impermeables con una tapa segura, para prevenir accidentes, derrames o salpicaduras durante su transporte. Debe tenerse cuidado al recolectar las muestras para evitar contaminar el exterior del tubo. 2. Todo el personal que procesa muestras de sangre y fluidos corporales debe usar guantes y pechera impermeable. Se deben usar mascarilla y anteojos si se prevee que las membranas mucosas entrarán en contacto con sangre y fluidos corporales. Los guantes deben cambiarse y lavarse las manos después del procesamiento de las muestras. 3. Se deberán usar siempre pipetas mecánicas para manipular todos los líquidos en los laboratorios. 4. El uso de agujas y jeringas debe estar limitado a situaciones en las cuales no hay otra alternativa. Para prevenir lesiones o accidentes se deben seguir las siguientes recomendaciones: Uso de jeringas desechable: Se recomienda su uso en todas las atenciones de pacientes. En ningún caso se reutilizan. Disposición de eliminación: En lo posible se eliminarán junto con la aguja, de no ser así se debe retirar la aguja por medio de una pinza y eliminarla directamente en el reservorio destinado a la eliminación del material corto-punzante; la jeringa se elimina en los dispositivos para basura contaminada. Uso de Material de vidrio: En este tipo de material incluimos tubos de vidrio para exámenes, placas de vidrio, láminas, pipetas, etc., y antes de comenzar el proceso de lavado se procede a su desinfección, sumergiéndolos en una solución de cloro desinfectante por 30 minutos, posteriormente se eliminan los restos de la mezcla (solución desinfectante y restos de muestra y/o reactivos) en el desagüe. En este tipo de procedimientos se deben usar guantes domésticos. 5. La descontaminación de superficies y para la limpieza de mesones al finalizar la jornada de trabajo, siempre y cuando las superficies estén libres de derrames de sangre y/o fluidos corporales debe realizar con solución de alcohol al 70%. Cada vez que ocurran derrames de sangre y fluidos corporales se debe limpiar la superficie afectada con hipoclorito de sodio al 0,5%. Descontaminación de material inerte: - Autoclave. - Inmersión en solución desinfectante (hipoclorito de sodio al 0,5%). Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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- Incinerar. - Después de descontaminado se elimina a la basura común, de acuerdo a las normas. 6. Los equipos científicos que han sido contaminados con sangre u otros fluidos corporales deben descontaminarse limpiándolos antes de ser reparados o transportados donde el fabricante (alcohol al 70%). 7. No está permitido comer o fumar en las áreas de trabajo y menos cuando se están procesando muestras. 8. Las personas deben lavarse las manos después de terminadas las actividades en el laboratorio y retirarse la ropa protectora antes de abandonar el laboratorio. LA IMPLANTACION DE LAS PRECAUCIONES UNIVERSALES DE SANGRE Y FLUIDOS CORPORALES PARA TODOS LOS PACIENTES ELIMINA LA NECESIDAD DE ETIQUETAR "CONTAMINADO" LAS MUESTRAS DE LOS PACIENTES QUE SE CONSIDERAN INFECTADOS. LA ETIQUETA ACTUAL ES SÓLO PARA REFORZAR LA PRECAUCIÓN. Cada laboratorio debe establecer de acuerdo al área y al procedimiento que se realiza en esa área, las medidas de protección necesarias.

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REACTIVOS USO FRECUENTE EN BANCO DE SANGRE E INMUNOHEMATOLOGIA Solución salina (NaCl 0,9% o 0,15 M) Buffer fosfato salino 900 ml de salino 100 ml de mezcla de buffer (16 ml de solución A + 84 ml de solución B, Ph 7,3) Solución A - buffer ácido NaH 2 PO 4 H2 O 0,16 M en agua destilada Ph= 5 Solución B- buffer alcalino Na2HPO 4 0,16 M en agua destilada Ph= 9,0 EDTA 1,5% (en suero fisiológico) Ajustar a pH 7 con NaOH 10N o HCl 0.1 N Uso y mantención: suspensión de glóbulos rojos testigos para la prueba inversa, se debe mantener a 4º C. Solución de sulfato de cobre Solución de CuSO4 densidad 1.053 (Hb 12.5 gr./dl, varones) Solución de CuSO4 densidad 1.052 (Hb 12 gr./dl, damas) CuSO2 x 5 H2O: 159 grs Agua destilada: 1000 ml Medir la densidad la que debe ser 1.053 (Hb= 12,5 g/dl), si es necesario, ajustar. Uso y mantención: medición semicuantitativa de la Hb de donantes de sangre. Preparación de glóbulos rojos testigos A1 y B Glóbulos seleccionados para uso en la prueba inversa. Se separan 2 unidades, una del grupo A (cuyos glóbulos deben ser A1) y otra del grupo B. Reactivos: Lectina Dolichus Biflorus (anti A1). Antisueros monoclonales Anti A, anti B, anti AB y anti Rh. Los glóbulos rojos A1 y B se lavan por 3 veces en abundante PBS y se resuspenden en EDTA 1,5% a una concentración de 2-4%. Hacer control con sueros anti A y anti B, para cada célula testigo. Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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CALIBRACIÓN DE CENTRÍFUGA INMUNOHEMATOLÓGICA Calibración de centrifugas para determinar tiempo de lavados y lectura de las células. Las centrifugas de inmunohematología deben ser calibradas desde el momento de ser recibidas y después de ser ajustadas o reparadas. La calibración de lectura y lavados se realiza preparando una batería de 10 tubos control, 5 controles + y 5 controles – utilizándose suero que produzca aglutinación de 1 cruz y glóbulos rojos con el antígeno correspondiente para el anticuerpo. Para evaluar el tiempo de lavado se debe observar sobrenadante transparente y botón de GR definido, se bota todo el PBS y el botón se debe resuspender con facilidad. Se debe elegir el tiempo que cumpla con todos los requisitos detallados en la siguiente tabla: Criterio lectura

10’’

20’’

30’’

45’’

60’’

90’’

Sobrenadante Transparente Botón celular definido Resuspensión fácil de las células Intensidad de aglutinación Control Negativo es negativo

Criterio lavados Sobrenadante Transparente Botón celular definido Resuspensión fácil de las células

Materiales: - Suero de Antiglobulina Humana - 5 tubos control + - 5 tubos control – - PBS - Suero anti D - Suspensión de glóbulos rojos al 2-4%

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Procedimiento: 5 tubos control +: Suspensión de Gr. D+ al 2-4% incubados 15 min. a 37º C con anti D que de 1+ al agregar suero AGH 5 tubos control –: suspensión de Gr. D+ al 2-4% incubados 15 min. a 37º C con solución de albúmina al 6%. Llenar con PBS todos los tubos Centrifugar de a pares uno positivo y uno negativo a diferentes tiempos 45, 60,90, 120 segundos Agregar PBS a ambos tubos + y – que de el tiempo óptimo para el lavado. Lavar 2 veces de acuerdo al tiempo de lavado establecido Eliminar todo el sobrenadante Agregar a los 2 tubos (control – y control +) reactivo de Coombs Evaluar el tiempo de lectura a los 10, 20, 30 segundos

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PREPARACIÓN DE GLÓBULOS ROJOS SENSIBILIZADOS Principio La prueba de Coombs usa el suero Antinmunoglobulina Humana para la detección de anticuerpos unidos al glóbulo rojo in vivo e in vitro. En caso de resultados negativos en cualquiera de las dos técnicas se debe verificar la actividad del suero luego de realizar el análisis. Para esto se requiere la adición de glóbulos rojos cubiertos con anticuerpos, los que deben ser pesquisados por el suero de Coombs. Reactivos -

GR R1R1, R1R2 o R2R2. Plasma de donante con Anti D, previamente separado, titulado y alicuotado en tubos Eppendorf, para su uso como control. PBS.

Metodología Se deben mantener Glóbulos Rojos R1R1, R1R2 o R2R2 para este objetivo. Los glóbulos se seleccionan de las unidades más frescas disponibles para uso. Se determina su genotipo Rh más probable mediante el uso de los reactivos correspondientes. Una vez que se tienen los Glóbulos disponibles, se deben tomar 2 tubos Vacutainer rojos donde se colocan aproximadamente 4 ml de glóbulos rojos en cada tubo y estos son lavados 4 veces con PBS. Una vez lavados los glóbulos, se toman 4 Tubos de vidrio de 10 ml, donde se coloca 1 ml de glóbulos lavados a cada tubo. Paralelo a esto, debe descongelarse el plasma control Anti D a usar. En caso de que el plasma tenga un título mayor o igual a 128, se debe usar en proporción 1 es a 1, es decir, 1 ml de glóbulos por 1 ml de plasma Anti D. Por el contrario, si el título es menor a 128 debe usarse 1 ml de glóbulos y 2 ml de plasma, ya que esta es la cantidad necesaria para lograr una sensibilización óptima de los glóbulos rojos (esto significa que al agregar dos gotas de suero de Coombs a una gota de éstos glóbulos, se pueda leer una aglutinación de intensidad ++ a +++), la que va a depender del título previo del plasma Anti D a usar. Incubar posterior mente los tubos a 37°C por 1 hora, Agitando por inversión al comienzo de la incubación y cada 15 minutos hasta su término. Una vez finalizado el tiempo de incubación, se debe controlar los glóbulos obtenidos previo a su lavado, para lo cual se toma una gota de los glóbulos concentrados en un tubo Kahn y se le realiza una prueba de Coombs Directo Este resultado debe dar intensidad de aglutinación entre ++ y +++. Se debe lavar los glóbulos sensibilizados 4 veces con PBS, para eliminar el suero con anticuerpos que quede libre y que podría interferir al momento de usar los glóbulos como control. Luego resuspenderlos en PBS al 2-4%.

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Los glóbulos sensibilizados se deben alicuotar en frascos con gotario, los que deben ser rotulados como tal, con fecha de sensibilización y vencimiento de esta, que corresponde a dos semanas desde la fecha de su preparación. Consignar en la hoja de registro correspondiente la fecha, el número de la bolsa anti D utilizada, el título del Anti D, el número de la unidad de glóbulos rojos utilizados y la intensidad del Coombs Directo.

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PREPARACIÓN CONTROL ANTI-D Metodología 1. Tomar 2 tubos Eppendorff de plasma con Anti D. 2. Diluir el anti D con PBS en un vaso precipitado. Si el título es mayor a 1/128, diluir 3 ml aprox. (lo que tienen los tubos Eppendorff) en 100 ml de PBS. Si es menor, diluir los 3 ml en 50 ml de PBS. 3. Agregar a la dilución 0.5ml de Azida de sodio al 10% . Mezclar. 4. Alicuotar el plasma diluido en frascos de vidrio con gotario. 5. Marcar cada frasco con la etiqueta correspondiente, indicando fecha de elaboración y fecha de vencimiento. La fecha de vencimiento es 1 mes después de su elaboración.

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CONTROL DE CALIDAD DE LOS SUEROS CLASIFICADORES ABO Cada uno de los antisueros clasificadores ABO y Rh, deben cumplir ciertas condiciones de especificidad y potencia, y los criterios de avidez si se usan en lámina. El control de calidad de estos reactivos se debe realizar diariamente antes de su uso en el laboratorio. Estos sueros son anticuerpos de tipo IgM monoclonales, se usan y actúan a temperatura ambiente, causando aglutinación directa de las células con su antígeno respectivo. Se conservan entre 2-8 º C. Los reactivos anti A y anti B se deben controlar con células testigo A y B y para controlar el suero anti D, se usan células O+.

Inspección visual 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Etiqueta clara y legible, donde se considere especificidad y fabricante. Fecha de vencimiento. Identificación del Lote . Incluye inserto, donde se especifique naturaleza del anticuerpo (monoclonal, policlonal) y metodologías recomendadas (clasificación en tubo, lámina, y/o microplaca). Apariencia física no presentar hemólisis, turbidez, precipitados o gel. Cumple con los colores empleados internacionalmente (azul= anti-A, amarillo = anti-B, incoloro = anti-AB ). Volumen es el correcto.

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Avidez Capacidad de un reactivo para dar una reacción observable (aglutinación) en un tiempo determinado, debe dar como mínimo 3+ dentro de 1 minuto después de mezclar. Reactivos usados para aglutinación en lámina con sangre total. Los glóbulos rojos deben estar resuspendidos al 35-45 %. Procedimiento: En la placa de vidrio deposite 2 gotas del antisuero a estudiar y agregue el antígeno adecuado a la concentración utilizada. Inmediatamente encienda el cronómetro. Registre la intensidad de los aglutinados al tiempo adecuado para la concentración de la suspensión empleada.

Especificidad Capacidad de un anticuerpo para reaccionar selectivamente con su antígeno conocido, mediante la observación y estimación visual de la aglutinación. Se mide en cruces. Procedimiento: Utilizar muestra con EDTA con hematocrito entre 35-45% Depositar 2 gotas de los diferentes reactivos a evaluar anti A anti B anti AB y anti D en la lámina. Agregar una gota de la muestra de glóbulos rojos conocidos. Evaluar especificidad de los reactivos registrando la presencia o ausencia de aglutinación la que se informa como: Presencia de aglutinación = signo + (en grado de cruces +/-,1+,2+,3+,4+) Ausencia de aglutinación = signo menos encerrado entre paréntesis (-).

Potencia Mide la fuerza de reacción del anticuerpo contenido en el suero con su antígeno respectivo. Se realiza mediante diluciones del suero en estudio (Título) y se expresa con el número recíproco de la dilución más alta en la cual se observe aglutinación de una cruz. 1- Numerar 10 tubos Kahn con los títulos correspondientes (2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512,1024) 2- A cada tubo agregar 500 l de PBS. Posteriormente agregar al primer tubo 500l de suero a titular (dilución ½) y mezclar por agitación lateral. 3- De esta dilución tomar 500l y agregar al tubo siguiente (tubo n°4) y mezclar por agitación lateral. Hacer esto sucesivamente, en orden, con el resto de los tubos hasta obtener todas las diluciones necesarias. 4- Numerar 10 tubos Kahn 1-10 5- Transferir a estos tubos 100l de cada uno de los tubos con diluciones madres. Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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6- Paralelamente lavar dos a tres veces, más o menos 2ml de GR apropiados para realizar el título y luego dejarlos al 3% 7- Agregar a cada tubo 50l de glóbulos al 3%, apropiados para el título. 8- incubar todos los tubos a temperatura ambiente durante 45 min. 9- Centrifugar y leer, comenzando desde la dilución más alta. 10- Registrar resultados en cruces y/o score.

Valores de referencia de titulación.

Anticuerpo evaluado Células Titulo mínimo Células Titulo mínimo

anti-A frente a A1 128 anti-A frente a A2 64

anti-B frente a B 128

anti-AB frente a A1B 128 anti-AB frente a A2B 64

Recomendaciones de la OMS.

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CONTROL DE CALIDAD DE LOS SUEROS Rh, anti D Inspección visual 1. 2. 3. 4.

Etiqueta clara y legible, donde se considere especificidad y fabricante. Fecha de vencimiento. Identificación del Lote . Incluye inserto, donde se especifique naturaleza del anticuerpo (monoclonal, policlonal) y metodologías recomendadas (clasificación en tubo, lámina, y/o microplaca). 5. Apariencia física no presentar hemólisis, turbidez, precipitados o gel. 6. Cumple con los colores empleados internacionalmente ( incoloro = Sueros anti-Rh y anti-D ). 7. Volumen es el correcto.

Especificidad Corresponde a la capacidad de un reactivo de reaccionar selectivamente con antígenos conocidamente positivos y negativos, sin dar falsos positivos. Para su evaluación se necesitan células positivas y negativas para los antígenos según como muestras el siguiente cuadro.

Células

anti-D

D positivas

2

D negativas

4

Potencia Se titula con un pool de por lo menos 4 glóbulos rojos Rh positivos; se debe obtener un título mínimo de 16.

Avidez Se estudia con dos glóbulos RhD positivos; deben dar un grado tres dentro del primer minuto si se ocupan glóbulos rojos al 35-45 % o 2 minutos en caso de ocupar glóbulos rojos al 10-20 %. Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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Recomendaciones de la OMS.

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CONTROL DE CALIDAD DE ANTICUERPOS DE OTRAS ESPECIFICIDADES

Esto se aplica para todos los otros anticuerpos utilizados en banco de sangre.

Especificidad Estudiar por lo menos con dos glóbulos rojos que tengan dosis simple para el antígeno dependiendo del anticuerpo utilizado y 4 glóbulos rojos que sean negativos para ese antígeno. Los resultados deben ser positivos inequívocos y claros negativos.

Potencia Deben dar un título de 4 como mínimo con glóbulos rojos que tengan dosis simple para el anticuerpo estudiado. Tanto el suero puro como el diluido 1 en 2 deben dar una reacción de +++ como mínimo

Control de calidad reactivos celulares

Células recubiertas con IgG (Células control Coombs)

Estas células se utilizan en la técnica de antiglobulina humana, para controlar que la antiglobulina humana no se neutralice total o parcialmente, se usa en todos los test de Coombs directos e indirectos negativos.

Los glóbulos rojos O Rh positivos se les deben agregar suficiente anti-D como para que den un resultado negativo con antiglobulina humana, al agregar un volumen de glóbulos rojos y un volumen de suero diluido 1 en 1000, pero deben permanecer positivos si en vez de suero diluido se adiciona un volumen se suero fisiológico. Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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CONTROL DE CALIDAD REACTIVOS MISCELANEOS La soluciones de salina de baja fuerza iónica deben tener las siguientes parámetros:

pH 6,5 – 7 a 22 ± 1 ºC. Conductividad 3,4 – 4 mS/com Osmolaridad 285 – 305 mOsmol/Kg.

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CONTROL DE CALIDAD DEL SUERO DE COOMBS

ANTI-GLOBULINA HUMANA (SAGH) Para analizar el título y la sensibilidad del suero de Coombs se utilizan glóbulos rojos sensibilizados con anticuerpos a diferentes concentraciones.

Materiales: -Pipetas de 1ml -Baño termoregulado a 37º C -Centrífuga inmunohematológica -Tubos de 10x75 mm -Fuentes iluminadora

Reactivos -Suero anti-D IgG Humano -Glóbulos rojos O Rh Positivo

Metodología      

Preparar diluciones seriadas del suero anti-D ( ½......1/1024), 1 ml de cada solución. Preparar glóbulos rojos lavados al menos 3 veces (3 a 4) con P.B.S. y resuspenderlos al 5%. Agregar GR preparados Volumen /Volumen a cada dilución del suero anti-D. Colocar control negativo con PBS Incubar 60 minutos a 37º C. Luego de la incubación centrifugar y leer. Anotar sus resultados. Lavar 4 veces con PBS los GR sensibilizados y resuspenderlos en PBS a una concentración final de 2-4%.

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En el último lavado eliminar enérgicamente el sobrenadante, secar en toalla absorbente de tal manera de dejar un botón globular lo más seco posible.       

Agregar 2 gotas de suero de Coombs conocido a cada suspensión de GR. Anotar sus resultados. Preparar el suero de Coombs en estudio haciendo diluciones seriadas desde ½ a 1/64 teniendo presente de dejar un volumen final de 1,5 ml. Preparar 54 tubos enumerados según esquema adjunto (tablero Ajedrez) Agregar 2 gotas de GR sensibilizados con una dilución de ¼ a los tubos 1, 10, 19, 28, 37 y 46. Efectuar lo mismo con todas las diluciones de GRs. Agregar 2 gotas de la dilución de suero de Coombs ½ a los tubos que están en la fila 1, 2, 3, 4, 5,....9. Efectuar lo mismo con las demás filas. Mezclar la gradilla y centrifugar todos los tubos con procedimiento estándar. Leer en fuente luminosa, anotar sus resultados.

INTERPRETACIÓN  Título mínimo del suero de Coombs de ser de 1/64 (tubo 46)  La sensibilidad del suero de Coombs debe ser como mínimo con un título de 1/1024 (tubo 9), 200 a 300 IgG por GR.  El título del suero de Coombs está dado por la columna que se utilizaron GRs tratados con anti-D ¼.  La potencia está determinada por la fila en donde se utiliza la dilución de ½ del suero de Coombs. El control de sensibilidad y potencia del suero de Coombs se debe realizar cada vez que se cambia de lote y/o proveedor del reactivo y como control rutinario utilizando los títulos de sensibilidad y potencia límites.

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Diluciones

Glóbulos Rojos Sensibilizados con anti-D IgG

SAGH

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128

1/256

1/512

1/1024

1/2

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1/4

10

11

12

13

14

15

16

17

18

1/8

19

20

21

22

23

24

25

26

27

1/16

28

29

30

31

32

33

34

35

36

1/32

37

38

39

40

41

42

43

44

45

1/64

46

47

48

49

50

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54

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TÍTULO DE LA FRACCIÓN IgM y DE LA FRACCIÓN IgG DEL REACTIVO ANTI-D. Título de la fracción IgM: Se realiza una dilución madre del suero a evaluar y el suero de referencia (Novaclone IgM/IgG). Se usan GRO R2R2 al 3% para el título, los cuales están previamente lavados dos a tres veces. Realizar título, detallado anteriormente. Título de la fracción IgG: Se debe tratar el suero para eliminar la IgM en forma previa, esto se realiza con el tratamiento del suero con DTT (Dithiothreitol), el cual está congelado-30°C. Se diluye el DTT 0.2 M a una concentración 0.01 M. Por ejemplo 100l de DTT 0.2M y 1900l de PBS. Mezclar con el suero a tratar en proporción 1:1 (ej. 500l de DTT 0.01M y 500l suero). Al mismo tiempo hacer un tubo control, el cual se agrega un volumen de suero y PBS en proporción 1:1. Incubar ambos tubos a 37°C por 1 hora. Una vez terminado el periodo de incubación, probar la eliminación de la fracción IgM, para lo cual se rotulan dos tubos, uno para el suero con DTT 0.01M y el otro con PBS. Agregar dos gotas de suero con DTT 0.01M y dos gotas de suero con PBS a cada tubo según corresponda y agregar a los tubos una gota de GR O+. Centrifugar y leer, El tubo tratado con DTT debe dar una aglutinación negativa, mientras que el control con PBS debe dar una aglutinación fuertemente positiva, esto evidencia que el DTT fue capaz de inactivar la fracción IgM del Anti-D y que el suero no se inactiva por la incubación (tubo control). Realizar título, detallado anteriormente. Después del punto 7 incubar los tubos a 37º C por 5 minutos, luego de eso lavar tubos por 4 veces, repetir lavado por 3 veces más, luego del último lavado eliminar todo el PBS, agregar 2 gotas de suero de Coombs, centrifugar y leer. Registrar en cruces y score. El título que se lee no es el real, puesto que el antisuero ya está diluido ½ (tratado con DTT), por lo tanto el título es una dilución más de la que se observa, y el score son 10 puntos más.

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DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO ABO Y RH EN LAMINA Y TUBO Introducción Los antígenos A y B pertenecientes a este sistema, han sido la base para clasificar a los individuos en cuatro grupos sanguíneos: A, B, AB y O. Están presentes en la mayoría de las células del organismo, excepto en las del SNC y del tejido conectivo. Las personas con sangre del tipo A tienen glóbulos rojos que expresan antígenos de tipo A en su superficie y anticuerpos contra los antígenos B en el suero de su sangre. Las personas con sangre del tipo B tienen la combinación contraria, glóbulos rojos con antígenos de tipo B en su superficie y anticuerpos contra los antígenos A en el suero de su sangre Los individuos con sangre del tipo O no expresan ninguna de los dos antígenos (A y B) en la superficie de sus glóbulos rojos pero pueden fabricar anticuerpos contra ambos tipos, mientras que las personas con tipo AB expresan ambos antígenos en su superficie y no fabrican ninguno de los dos anticuerpos. Los anticuerpos contra el antígeno que no se expresa, son llamados anticuerpos naturales, generalmente de tipo IgM y aparecen a los 3 meses de vida. La clasificación ABO consta de 2 métodos: Método directo: se usan los sueros clasificadores, investigar antígenos en los glóbulos rojos. Método inverso: Se usan los glóbulos rojos testigos, investigar anticuerpos naturales (IgM) en el suero en estudio. 1. Método directo: prueba en lámina y tubo. Muestra: sangre total con o sin anticoagulante Materiales -Pipetas Pasteur -Tubos Kahn -Centrífuga para Inmunohematología. -Fuente de luz. -Láminas -Bagueta Reactivos -Sueros anti A, anti B, anti AB. -Glóbulos rojos testigos A1 y B lavados y resuspendidos en EDTA o PBS, al 4 %. La suspensión debe prepararse diariamente. -EDTA -PBS

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Técnica en lámina Sólo para reclasificar muestras sanguíneas. 1. 2. 3. 4.

En lámina de vidrio disponer de 1 gota de cada antisuero monoclonal conocido Agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos 50% en solución salina, suero o plasma. Mezclar con bagueta y hacer girar la lámina manualmente Leer en un máximo de 2 minutos.

Técnica en tubo Los tubos de Kahn se rotularán de la siguiente manera: A, B, AB, TS (testigo salino), y con las iniciales del paciente o número de donante. 1. Colocar una gota de anti-A monoclonal en un tubo limpio y rotulado. 2. Colocar una gota de anti-B monoclonal en un segundo tubo limpio y rotulado. 3. Colocar una gota de anti-AB monoclonal en un tercer tubo limpio y rotulado. 4. Añadir a cada tubo una gota de suspensión de glóbulos rojos problema al 2-4%. 6. Mezclar suavemente el contenido de los tubos y centrifugarlos según el tiempo estandarizado de lectura. 7. Resuspender suavemente los sedimentos de glóbulos rojos y examinar la aglutinación. 8. Anotar los resultados de la prueba. Confirmar los resultados con los obtenidos en las pruebas ABO en suero. 2. Método inverso. Muestra: suero o plasma Materiales -Pipetas Pasteur -Tubos Kahn -Centrífuga para Inmunohematología. -Fuente de luz. Reactivos Glóbulos rojos testigos A1 y B lavados y resuspendidos en EDTA 1,5 % o suspensión debe prepararse diariamente.

PBS, al

2-4 %. La

Técnica en tubo Los tubos de Kahn se rotularán de la siguiente manera: A1, B, (opcional A2), y con las iniciales del paciente o número de donante. Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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1. Colocar una gota de glóbulos rojos reactivos comerciales del grupo A1 en un tubo limpio y rotulado. 2. Colocar una gota de glóbulos rojos reactivos comerciales del grupo B en un segundo tubo limpio y rotulado. 3. Colocar una gota de glóbulos rojos reactivos comerciales A2 en un tercer tubo, si van a realizarse pruebas en paralelo con este reactivo. (Nota: las pruebas con glóbulos rojos A2 son opcionales. Ej.: Discrepancias o subgrupo del sistema ABO.) 4. Añadir a cada tubo una gota de suero problema. 5. Mezclar suavemente el contenido de los tubos e incubarlos a temperatura ambiente durante 5 minutos para potenciar reacciones débiles. 6. Centrifugar según el tiempo estandarizado de lectura. 7. Anotar los resultados de la prueba. Confirmar los resultados de la prueba en suero con los obtenidos en la prueba globular. Interpretación -La aglutinación de los glóbulos rojos en estudio y la hemólisis o la aglutinación en el suero, constituyen resultados positivos. -La suspensión uniforme después de la resuspensión de las células, constituye un resultado negativo. -Todas las discrepancias entre los resultados de las pruebas en el suero y las células deben resolverse antes de registrar el informe del grupo ABO y Rh de la muestra. Protocolo de registro de resultados Muestra

Método directo Anti-A Anti B Anti-AB

Grupo Rh Anti-D

Método inverso A1 A2 B

Interpretación

1 2 3 4

Lectura de aglutinación: La lectura de aglutinación debe hacerse en forma lenta y sobre una fuente de luz. De acuerdo a lo que se vea en los tubos se gradúa en cruces (+), según lo detallado: 4+ o ++++ 3+ o +++ 2+ o ++ 1+ o + W o +/-

: : : : :

Aglutinado grande y firme, fondo claro. Varios Aglutinados grandes, fondo claro. Aglutinados medianos y/o pequeños, fondo claro. Aglutinados muy pequeños, fondo rosado, reacción débil a simple vista. Aglutinados más pequeños aún, fondo rosado, reacción muy débil, difícil de leer.

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Score de aglutinación: Este indicador se usa para hacer control de calidad en antisueros y el reactivo que muestre mayor score en una titulación posee mayor potencia. El Score es la suma de cada uno de los scores individuales obtenidos, para ello se ha asignado valores a cada grado de aglutinación.

Interpretación aglutinación en tubo

Score(Puntaje)

Negativo

(-)

Suspensión de glóbulos rojos uniforme

0

Positivo

W

Granularidad débil en la suspensión de glóbulos rojos.

3

Muchos aglutinados de pequeño tamaño y un fondo de

5

+/1+

glóbulos rojos libres. 2+

Aglutinados grandes en un mar de aglutinados más

8

pequeños, sin glóbulos rojos libres. 3+

Reacción potente. Varios aglutinados grandes.

10

4+

Aglutinado único. No se detectan glóbulos rojos libres

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Ref. Manual Técnico AABB 13ª Edición.

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CLASIFICACIÓN Rh El sistema Rhesus, está constituido por unos 40 antígenos siendo 5 de estos importantes desde el punto de vista clínico. Son los llamados antígenos mayores D, C, E, c, e. En los bancos de sangre generalmente solo se estudia el antígeno D, ya que produce la aloinmunización más frecuente. Los anticuerpos anti D son de tipo IgG y se producen por aloinmunizaciones previas, ya sea por embarazo o transfusiones. Reaccionan mejor en SAGH a 37 º C. El 85% de los individuos caucásicos expresan el antígeno D y se les denomina Rh positivos, si el antígeno no se expresa 15% , se denomina Rh negativos. Muestra Sangre completa con o sin anticoagulante Reactivos Suero anti D (mezcla IgM e IgG) PBS Técnica en lámina 1. En lámina de vidrio disponer de 1 gota de suero anti D 2. Agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos 50% en solución salina, suero o plasma. 3. Mezclar con bagueta y hacer girar la lámina manualmente 4. Leer en un máximo de 2 minutos. Técnica en tubo Los tubos de Kahn se rotularán de la siguiente manera: D, TA (testigo albuminoso), y con las iniciales del paciente o número de donante. 1. Colocar una gota de antisuero anti-D en un tubo limpio y rotulado. 2. Colocar una gota de albúmina al 30% como testigo en un segundo tubo limpio y rotulado. 3. Añadir a cada tubo 1 gota de la suspensión de glóbulos rojos problema al 2-5%. 4. Mezclar y centrifugar según el tiempo estandarizado de lectura.. 5. Resuspender suavemente el sedimento de glóbulos rojos y examinar la aglutinación. 6. Anotar los resultados de la prueba y los controles. Interpretación -Si hay aglutinación, se denomina Rh D positiva -Si no hay, seguir estudiando la muestra para investigar presencia de antígeno D débil.

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CLASIFICACIÓN ABO Y RH EN MICROPLACAS Tipificación ABO de los glóbulos rojos y suero en microplacas. La microplaca es una matriz de 96 microcubetas en forma de U o de V. La más utilizada es la microcubeta en forma de U, porque permite leer los resultados después de centrifugar la placa. Las técnicas en microplacas pueden usarse para investigar antígenos ABO en los glóbulos rojos y anticuerpos en el suero.

Materiales Microplacas Micropipetas automáticas Tubos khan Equipos Centrifuga con porta microplacas, estandarizadas Agitador estandarizado para resuspensión de Gr. Muestra Sangre coagulada o anticoagulada. Reactivos Anti A monoclonal Anti B monoclonal Anti AB Estandarizados para microplaca Glóbulos rojos A1, A2 (opcional) y B (suspensión al 2-5%)

Procedimientos: Prueba en glóbulos rojos 1. 2. 3. 4. 5.

Colocar 1 gota de cada antisuero en cada una en distintas microcubetas Agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 2-5% en solución salina Mezclar, golpeando el borde de la microplaca Centrifugar bajo condiciones apropiadas Resuspender las células manualmente o mediante agitador mecánico

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6. Leer. Comparar resultados con los obtenidos en el suero. Pruebas en suero 1. Agregar 1 gota de glóbulos rojos A1, A2 (opcional) y B (suspensión al 2-5%) en cada una en distintas microcubetas 2. Agregar 1 gota de suero o plasma en estudio a cada microcubeta 3. Mezclar, golpeando el borde de la microplaca 4. Centrifugar bajo condiciones apropiadas 5. Resuspender las células manualmente o mediante agitador mecánico 6. Leer. Comparar resultados con los obtenidos en los glóbulos rojos. Nota: Para potenciar reacciones débiles, es factible incubar las placas a temperatura ambiente durante 5-10 minutos y repetir centrifugación, lectura y registro.

Tipificación Rh en microplacas. Reactivos Anti D monoclonal IgG o IgG + IgM, además tener un suero anti D de otra marca para repetir las muestras negativas en tubo o gel. Procedimiento

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Colocar 1 gota de anti D en 1 microcubeta de una microplaca Agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 2-5% en solución salina Mezclar, golpeando el borde de la microplaca Centrifugar bajo condiciones apropiadas Resuspender las células manualmente o mediante agitador mecánico Leer, interpretar y registrar los resultados.

Interpretación - La aglutinación en las microcubetas de los glóbulos rojos en estudio y la hemólisis o la aglutinación en las microcubetas del suero, constituyen resultados positivos. - La resuspensión uniforme de las células, constituye un resultado negativo. - Todas las discrepancias entre los resultados de las pruebas en el suero y las células deben resolverse antes de registrar el informe del grupo ABO y Rh de la muestra.

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Equipamiento Sistema Automatizado Equipo de carga para microplacas. Centrífuga. Agitador. Lector de reacción. Programa computacional Reactivos Antisueros diluidos. Glóbulos rojos testigos. Diluyente. Solución de lavado. Microplacas. 96 pocillos en forma de U. Fila A dispensar 1 gota de anti-A Fila B dispensar 1 gota de anti-B Fila C dispensar 1 gota de anti AB Fila D dispensar 1 gota de anti-D Fila E dispensar 1 gota de anti-D Fila F dispensar 1 gota de PBS Fila G y H dispensar 1 gota glóbulos rojos testigos a cada pocillo para prueba inversa.

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DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO POR TÉCNICA EN GELES BIOTYPE® Consiste en una tarjeta gel, constituida por 6 microtúbulos, cada uno de ellos conformado por una columna y una cámara de dispersión/ incubación. La tecnología de microtipificación en gel se basa en la separación por tamaño de los glóbulos rojos aglutinados, durante el proceso de centrifugación en un gel poroso, los aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequeños a lo largo de la columna, esta aglutinación se produce al reaccionar el antígeno con los anticuerpos correspondientes. Los eritrocitos que no reaccionan quedan en el fondo de la columna. Materiales -

Pipetas automáticas 100 µl. Puntas de pipetas desechables Tubos de vidrio Tarjetas Gel Bio-Type ABO/D/D/PI, ABO / Rh con Prueba Inversa Incubador para Tarjetas Gel Centrífuga para Tarjetas Gel Hematíes Testigos A1 y B para prueba inversa. Solución I (Liss)

Reactivos La tarjeta Bio-Type ABO/D/D/PI contiene anticuerpos Monoclonales Anti-A Anti-B, Anti-D IgM, Anti-D IgM/IgG y Anti-D IgG. Suspensión neutra adecuada para realizar la prueba inversa en presencia de glóbulos rojos A1 y B.

Preparación de la muestra a.- Determinación ABO y Rh (prueba directa) Preparar una suspensión de Glóbulos Rojos al 1% en la solución I de la siguiente forma: Dispensar 2 volúmenes de solución I (Liss) (1 ml) a un tubo y agregar 10 ul de glóbulos rojos concentrados. b.- Prueba Inversa. Se puede utilizar suero o plasma. Los G.R. A1 + B deben se diluidos al 1% en solución I, de acuerdo a la siguiente proporción: Dispensar un volumen (500 ul) : 4 gotas de GR. Dispensar dos volúmenes (1000 ul) : 8 gotas de G.R Dispensar tres volúmenes (1500 ul ) : 12 gotas de G.R Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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1.- Determinación de antígenos de sistema ABO/Rh - Identificar tarjetas y muestras a utilizar. - Añadir 50 ul de la suspensión de glóbulos rojos del paciente a c/u de los pocillos 1 al 4. ( A, B, D). 2.- Determinación prueba inversa ABO -

Añadir 50 ul de glóbulos rojos A1 al pocillo 5, y 50 ul de glóbulos rojos B al pocillo 6. Agregar 50 µl de suero o plasma del paciente a los pocillos 5 y 6. Incubar 10 min a Tº Ambiente Centrifugar 10 min a velocidad estandarizada, leer resultados.

Resultados NEGATIVO

-

Banda de hematíes al fondo de la columna, resto de la columna sin aglutinados

POSITIVO

+/1+ 2+ 3+ 4+

Escasos glutinados de pequeño tamaño en la columna. Algunos aglutinados pequeños en la columna aglutinados pequeños en la columna y a lo largo de la columna Banda superior de aglutinado Banda de aglutinados en la parte superior de la columna. Doble población (doble banda de hematíes , en el fondo y en la parte superior.

DP

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ANÁLISIS DE CAUSAS DE DISCREPANCIAS EN LA CLASIFICACIÓN ABO/Rh Discrepancias en la clasificación ABO/Rh La mayoría de los grupos sanguíneos ABO que se determinan en el banco de sangre cumplen con leyes establecidas de antígenos y anticuerpos correspondientes para ese sistema, pero hay una población que presenta discrepancias que deben ser resueltas para definir el grupo exacto. Estas diferencias se pueden presentar al detectarse subgrupos débiles de A ( A3, Am, Ax, Ael, Aend ) y de B (B3, Bx y Bm) que se resuelven generalmente con técnicas de adsorción-elusión e investigación de sustancias A, B y H en la saliva de secretores que presentan estas incongruencias. Otro tipo de discrepancias se presentan en personas con anticuerpos naturales irregulares como anti-A1, antiH, -M, -N, -P1, Lea, Leb; anticuerpos inmunes que se detectan en medio salino como producto de una reacción primaria o en pacientes con anemia hemolítica autoinmune y en sujetos con complejos inmunes relacionados a SIDA o con proteínas anormales como en el mieloma múltiple. Las posibles causas de discrepancias en la clasificación se pueden deber a diversos factores, entre los cuales los más comunes son:  Los subgrupos sanguíneos  Doble población  Presencia de gelatina de Wharton en las muestras de recién nacidos  Incompatibilidad materno-fetal, que en el momento de la clasificación se hace evidente.

ANÁLISIS DE SUBGRUPOS SANGUÍNEOS Los subgrupos son fenotipos ABO que difieren en la cantidad de antígeno presente en los eritrocitos y en la saliva de los secretores. Se hallan con mayor frecuencia y tienen más relevancia clínica los de A, que los de B. Al utilizar lectinas se definen los subgrupos: A1 y A2: con el extracto de Dolichos biflorus se aglutinan los eritrocitos A1, pero no los de A2; y el anti-H, proveniente de la semilla Ulex europeus, aglutina los eritrocitos que tienen antígeno H. Los eritrocitos de recién nacidos que son genéticamente A1 reaccionan de forma relativamente débil con el anti-A1 humano. Los eritrocitos fetales A2 se comportan como los Ax adultos porque las transferasas actúan de manera lenta en los RN. Cuando se comparan las reacciones de los eritrocitos de los niños y adultos de grupo A con sueros anti-A, sólo se encuentran pequeñas diferencias en cuanto la aglutinación de los eritrocitos suspendidos en medio salino, pero las diferencias son más evidentes en la prueba de antiglobulina indirecta (anti-IgG) y las pruebas de LISS (Low Ionic Strength Solution).

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Lectina Anti- A1 (Dolichos biflorus) El sistema de grupos sanguíneos ABO sigue siendo el primero a tener en cuenta en el momento de realizar una transfusión de sangre. Los antígenos A y B son productos génicos fácilmente detectables y constituyen marcadores genéticos de gran valor. Entre los individuos A, se distinguen 2 categorías: A1 y A2. La diferenciación entre ambas se realiza mediante la utilización de anticuerpos monoclonales y lectinas específicas de grupo sanguíneo Dolichos biflorus (anti A1), la cual reacciona aglutinando las células que poseen el antígeno A1.

MATERIAL Y EQUIPO · Tubos Kahn · Cronómetro · Marcador · Centrífuga serológica

MUESTRA BIOLÓGICA REACTIVO Glóbulos rojos de donante o · Lectina anti-A1 paciente

Adicione una gota de anti-A1 a tubos adecuadamente marcados. Adicione una gota de una suspensión de eritrocitos a una concentración aproximada del 4% en solución salina (PBS). Mezcle completamente el contenido del tubo.

Centrifugar según el tiempo estandarizado de lectura. Agite suavemente el tubo y resuspenda el botón celular. Examine las reacciones resultantes macroscópicamente. Registre resultados.

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Lectina Anti –H (Ulex europeaus) La lectina Ulex europeaus tiene la propiedad de aglutinar las células que expongan el antígeno H en su superficie. Existe un fenotipo eritrocitario relativo a la ausencia del antígeno H en la superficie llamado “Fenotipo Bombay”, en el cual el paciente que necesitase recibir transfusión de glóbulos rojos, necesita exclusivamente eritrocitos con la ausencia del antígeno H, ya que puede poseer anticuerpos anti-H; antígeno presente en la mayor parte de la población. MATERIAL Y EQUIPO · Tubos Kahn · Cronómetro · Marcador · Centrifuga serológica

MUESTRA BIOLÓGICA REACTIVO Glóbulos rojos de donante o · Lectina anti-H paciente

Adicione una gota de una suspensión de eritrocitos a una concentración aproximada del 4% en solución salina (PBS) en un tubo de ensayo debidamente marcado. Mezcle completamente el contenido del tubo. Adicione dos gotas de lectina anti-H y mezcle completamente el contenido del tubo. Incube durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Centrifugar según el tiempo estandarizado de lectura. Agite suavemente el tubo y resuspenda el botón celular. Examine las reacciones resultantes macroscópicamente. Registre resultados.

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· Prueba positiva: Aglutinación de los globulos rojos. · Prueba negativa: Ausencia de aglutinación de los globulos rojos

CONCLUSIONES: Para realizar una transfusión sanguínea se debe tomar en cuenta los subgrupos del donante y del receptor. Los subgrupos con mayor frecuencia y tienen más relevancia clínica los de A, que los de B. Se identifican por medio de lectinas. Los subgrupos A más importantes son: A1 y A2.

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ANTIGENO B ADQUIRIDO POR INDIVIDUOS A1 El “B adquirido” podría deberse a la acción de la desacetilasa bacteriana, que convierte la Nacetilgalactosamina en α-galactosamina, la cual es muy similar a la galactosa, el principal determinante de B. Las células B adquiridas se hacen más reactivas frente al extracto de Dolichus biflorus. También pueden presentar activación T o Tk, estando mediadas todas esas alteraciones por enzimas bacterianas en pacientes que cursan con una infección importante como la de colon. Otro mecanismo de producción de grupo B adquirido secundario a la absorción de sustancias bacterianas semejante al grupo B se observa en personas infectadas por Proteus vulgaris o Escherichia coli. Se ha descrito un grupo B adquirido que se detecta sólo en células del grupo A de expresión débil.

Debilitamiento de antígenos A, B y H El debilitamiento de la expresión de antígenos AB puede observarse en las personas de edad avanzada (aparentan ser grupo O); los anticuerpos anti-AB también pueden sufrir cambios en estos sujetos. En pacientes que estén recibiendo quimioterapia inmunosupresora la concentración de anticuerpos disminuye significativamente. En ocasiones la sangre parece contener una mezcla de células de los grupos A y O, o de A1 y A débil; en otros casos, los eritrocitos reaccionan débilmente con el anti-A y se comportan de manera parecida al A3 o al Am.

Secretores y no secretores Los genes secretores Se y se controlan la secreción de H, A y B. Alrededor de 80 % de los individuos son secretores y segregan la sustancia H, independientemente de su grupo ABO; así la saliva de secretores de grupo O contiene H y la de secretores de grupo A contiene A y H. 20% de los individuos que no segregan sustancia H (no secretores) tampoco segregan A ni B.

Aglutinación de campo mixto Término que trata de describir la presencia de eritrocitos aglutinados y no aglutinados en suspensiones tratadas con una aglutinina. Esto quiere indicar que existen dos poblaciones fenotípicamente distintas, como sucede en pacientes transfundidos, en mujeres que contienen en circulación eritrocitos fetales, o cuando alguno de los eritrocitos de un sujeto ha sufrido transformación T o Tn.

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Puede verse una morfología similar en mezclas de suspensiones eritrocitarias de un único fenotipo, cuando los eritrocitos tienen pocos lugares antigénicos (por ejemplo, variantes débiles de A), o cuando la aglutinina es de título bajo.

Discrepancias entre pruebas con eritrocitos y suero Los resultados de las pruebas con eritrocitos y con suero pueden ser discrepantes debido a los problemas intrínsecos de los eritrocitos o del suero, debido a problemas relacionados con la prueba, o a errores técnicos, ya sea que se han obtenido resultados negativos cuando se esperaban positivos o viceversa.

Falsos negativos Pueden tener lugar debido a la omisión de: - Agregar reactivo o suero de prueba a un tubo. - No Identificar la hemólisis como una reacción positiva. - Uso de una relación inapropiada entre suero (reactivo) y eritrocitos. - Centrifugar insuficientemente las pruebas. - Interpretar o registrar incorrectamente los resultados de las pruebas.

Falsos positivos Los resultados pueden ocurrir por: - Sobrecentrifugación de los tubos. - Uso de reactivos, eritrocitos o solución salina contaminados. - Uso de material de vidrio sucio. - Autoaglutinación de los eritrocitos del paciente y realización sólo del grupo directo sin autotestigo. - Interpretación o registros incorrectos de los resultados de las pruebas.

Resolución de discrepancias ABO El primer paso debe ser la repetición de las pruebas en la misma muestra. Si las pruebas iniciales fueron efectuadas con eritrocitos suspendidos en suero o plasma, se debe repetir la prueba, usando una suspensión salina de células lavadas. Si persiste la discrepancia se procede a lo siguiente:      

Obtener una nueva muestra (donante o receptor) y someter ésta a prueba; esto resuelve las discrepancias debidas a un rotulado equivocado o contaminación de muestra. Lavar los eritrocitos varias veces para eliminar componentes séricos o químicos que puedan estar causando reacciones positivas. Someter a prueba los eritrocitos con anti-A, B, anti-A1 o anti-H, según corresponda. Si se sospecha anti-A1, examinar el suero contra varios ejemplos de eritrocitos del grupo A2. Revisar los resultados de la prueba de investigación de anticuerpos contra eritrocitos del grupo O para detectar efectos de interferencia por aloanticuerpos fríos inespecíficos. Incubar las pruebas durante 30 minutos a temperatura ambiente para facilitar la detección de antígenos o anticuerpos débiles.

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Resolución de discrepancias debidas a la ausencia de antígenos esperados Se pueden usar los siguientes procedimientos para intensificar la detección de antígenos débilmente expresados: 



 

Incubar eritrocitos lavados con anti-A y anti-A, B durante 30 minutos a temperatura ambiente para incrementar asociación de anticuerpos con escasa cantidad de antígeno. Incubar a 4 °C puede intensificar aún más la fijación del anticuerpo, pero deben ser controladas con eritrocitos de grupo O y autólogos para asegurar que las reacciones son debidas a anti-A y anti-B y no a otras aglutininas frías. Tratar los eritrocitos del paciente con una enzima proteolítica, como ficina, papaína, o bromelina. El tratamiento enzimático incrementa la reacción antígeno-anticuerpo con anti-A o anti-B. Paralelamente se deben incluir eritrocitos del grupo O tratados con enzimas como control de la especificidad de la reacción ABO. Realizar adsorción-elusión con anti-A o anti-B humanos para adsorber el anticuerpo a los correspondientes antígenos eritrocitarios. No se debe usar anti-A1 o reactivos monoclonales y debe hacerse en paralelo con eritrocitos de grupo O para control. Buscar en la saliva la presencia de sustancias H, A o B.

Resolución de discrepancias debidas a reacciones inesperadas con anti-A y anti-B Las pruebas de agrupación de eritrocitos dan reacciones inesperadas, pueden ser responsables alelos variantes en el locus ABO o problemas no relacionados con los genes ABO. Para confirmar que los eritrocitos del grupo A1 portan la estructura adquirida B: 

Verificar el diagnóstico del paciente. Los antígenos adquiridos B suelen relacionarse con afecciones hísticas que permiten ingresar a las bacterias del colon a la circulación.



Someter a prueba el suero del paciente contra eritrocitos autólogos. El anti-B del individuo no aglutina sus propios eritrocitos que portan el B adquirido.



Someter a prueba los eritrocitos con suero anti-B humano que ha sido acidificado a pH 6,0. El anti-B humano acidificado no reacciona con el antígeno B adquirido.



Si el paciente es secretor, comprobar la presencia de A y B en la saliva. Los secretores cuyos eritrocitos portan estructuras B adquiridas tienen sustancias A, pero no B en su saliva.

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Eritrocitos revestidos por anticuerpo Los eritrocitos de lactantes con EHRN, o adultos que padecen de afecciones autoinmunes o aloinmunes, pueden estar tan intensamente revestidos de moléculas de anticuerpos IgG como para aglutinarse en forma espontánea en presencia de diluyentes de reactivos que contengan altas concentraciones de proteínas. Se puede usar una elusión suave a 45 °C o con glicina a pH ácido, para eliminar gran parte de este anticuerpo de los eritrocitos de modo que se pueda someter a prueba en forma confiable con anti-A y anti-B. Los eritrocitos de una muestra que contenga autoaglutininas IgM reactivas con el frío pueden aglutinar en forma espontánea en pruebas de solución salina. Por lo común, los anticuerpos pueden ser eliminados incubando la suspensión celular a 37°C y luego lavando varias veces con solución salina calentada a 37 °C. Si la aglutinación relacionada con IgM no es eliminada por esta técnica, los eritrocitos pueden ser tratados con ditiotreitol (DTT).

Resolución de discrepancias debidas a reacciones séricas inesperadas Algunos acontecimientos pueden ocasionar resultados inesperados o erróneos de pruebas en suero, que pueden ser resueltos. 

Los pacientes inmunodeficientes pueden no producir niveles detectables de anti-A y antiB; estos anticuerpos están ausentes del suero de recién nacidos, o ser muy débiles en personas seniles normales, pacientes que cursan con hipogamaglobulinemias y pacientes con transplantes de medula ósea. Cuando esto sucede en la prueba inversa: aumentar el tiempo de incubación 15-30 minutos a temperatura ambiente. incubar a 4 º C junto con tubo que lleve Gr O y un autocontrol (PA).



Concentraciones anormales altas de anti-A y anti-B han causado reacciones prozona que dieron lugar a resultados falsos negativos; en estos casos, el grupo ABO se puede inferir mediante pruebas en eritrocitos por dilución del suero mediante el uso de suero tratado con EDTA.



El anti-A en el suero de individuos A2, A2B u otros subgrupos aglutina eritrocitos testigos A1.



Las autoaglutininas frías como anti-I y anti-IH, pueden aglutinar los eritrocitos de todos los adultos, incluidas las células autólogas y eritrocitos testigos, cuando esta reactividad interfiere en la interpretación de las pruebas: - Calentar el suero y los eritrocitos testigos a 37 ° C antes de mezclarlos y realizar las pruebas en suero a 37 ° C y convertirlas a la fase antiglobulina si es necesario. - Eliminar la autoaglutinina fría del suero mediante un método de autoadsorción fría, el suero adsorbido puede ser sometido contra eritrocitos testigos A1 y B. - Tratar el suero con DTT y usar el suero tratado para pruebas de agrupación inversa.

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

Aloanticuerpos inesperados que reaccionan a temperatura ambiente como anti-P o anti-M, pueden aglutinar los eritrocitos usados en las pruebas con suero si portan el correspondiente antígeno, para ver el tipo correcto de ABO de un suero que contenga otros aloanticuerpos fríos realizar: - Elevar la temperatura a 30-37 °C antes de mezclar el suero y las células, si la temperatura del aloanticuerpo es inferior a la cual reaccionan anti-A y anti-B, esto puede resolver la discrepancia.

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DETECCIÓN DE ANTÍGENOS SOLUBLES EN SECRECIONES Identificación de antígenos solubles A, B, H en la Saliva. Determinación del estado secretor. La secreción de la sustancia ABH se produce en individuos que presentan el gen secretor ya sea homocigotos SeSe o heterocigotos Sese para dicho gen. Aquellos individuos secretores tienen en su saliva la sustancia H, independiente de su grupo ABO, así los individuos del grupo O tienen o secretan en su saliva la sustancia H y los del grupo A, la sustancia H y A. La determinación de individuos secretores o no, se basa en la detección de antígenos solubles presentes en la saliva inactivada. Si esta está presente, neutralizará la actividad de sus anticuerpos correspondientes por lo tanto, no se observará aglutinación de los glóbulos rojos una vez que estos se agreguen, si el líquido orgánico no contiene el antígeno, no se producirá la neutralización del anticuerpo por lo que estos aglutinarán los glóbulos rojos respectivos. El 80 % de los individuos caucásicos, heredan el gen Se y son llamados secretores. El 20 % restante no son secretores y de genotipo sese. La determinación de secretores tiene escasa importancia tanto clínica como de laboratorio, pero puede ser útil en la determinación de grupo sanguíneo ABO de un individuo si el grupo de sus hematíes no es constituyente.

Muestra Saliva Reactivos Suero clasificador ABO Lectina anti H Glóbulos rojos A-B-O lavados PBS Técnica 1. Enjuagar la boca 2. Recolectar 5-10 ml de saliva en un tubo de centrifuga 3. Centrifugar durante 9 min. 4. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y colocar en baño termoregulado durante 810 min. Para inactivar la saliva. 5. Centrifugar 9 min. Extraer el sobrenadante transparente o algo opalescente en otro tubo, descartar el material opaco o semi sólido. 6. Diluir el sobrenadante (500ul) con un volumen igual de PBS (500ul). 7. Por otra parte prepare diluciones de los antisueros para tipificar, esta dilución debe permitir una aglutinación de las células correspondientes de 2 +

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8. Colocar una gota de reactivo para tipificar (antisuero diluido) en dos tubos, una marcado como solución salina (control +) y el otro como desconocido. Para cada anticuerpo en análisis. 9. Agregar una gota de solución salina al tubo marcado como control+ y una gota de saliva diluida e inactivada al tubo respectivo. 10. Mezclar e incubar a temperatura ambiente 10 min. 11. Agregar una gota de glóbulos rojos testigos suspendidas al 3 % a cada tubo del grupo A, B u O. 12. Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 10 min. 13. Centrifugar bajo condiciones estandarizadas, leer y registrar los resultados.

Interpretación Ejemplo: Saliva en estudio + anti A + Gr A ++ -

PBS+ anti A+ Gr A ++ ++

Interpretación Sese o No Secretor SeSe, Sese o Secretor

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PRUEBA DE COOMBS DIRECTA E INDIRECTA EN TUBO Técnica de antiglobulina humana. Para la detección de anticuerpos de tipo IgG o fracciones del complemento adheridos a los glóbulos rojos, es decir la sensibilización de estos, se utiliza el reactivo de Coombs o AGH poliespecífica, la cual contiene anti IgG y anti C3d del complemento humano. Este reactivo se prepara inmunizando animales con IgG y complemento C3 humano. Hay 2 tipos de pruebas de la antiglobulina: Prueba de Coombs directa y prueba de Coombs indirecta. Ambas tienen el mismo fundamento. Las pruebas de Coombs directas positivas, son generalmente indicativas de glóbulos rojos del paciente que han sido sensibilizados in vivo por anticuerpos de tipo IgG y/o fracciones del complemento C3d, como por ejemplo enfermedad hemolítica autoinmune y enfermedad hemolítica del recién nacido. La prueba de Coombs indirecta, detecta la sensibilización in Vitro de los glóbulos rojos, esta se utiliza para: detectar anticuerpos en el suero problema, determinación de fenotipos y pruebas cruzadas.

Prueba antiglobulínica directa en tubo El tubo de hemólisis se rotulará de la siguiente manera: PCD (prueba de Coombs directa) y con las iniciales del paciente o el número del donante. 1. Tomar una alícuota de sangre conservada con anticoagulante. 2. Lavar los glóbulos rojos 3 veces con solución fisiológica. Descartar totalmente el sobrenadante del último lavado. Preparar una suspensión globular al 2-5 %. NOTA: Si se tratase de sangre de cordón umbilical, la muestra deberá ser lavada con solución salina entre 6 y 8 veces con el objeto de eliminar al máximo los restos de gelatina de Wharton. 3. Tomar una gota de dicha suspensión y agregarle 1 gota de suero antiglobulina humana. 4. Mezclar, centrifugar y examinar la presencia de aglutinación de los glóbulos rojos. Clasificar y anotar los resultados de la reacción. El modo en que se despegan los glóbulos rojos del fondo del tubo de hemólisis es muy importante. El tubo debe agitarse en primer lugar suavemente, para desalojar totalmente el sedimento de glóbulos rojos, y a continuación agitar suavemente hasta producir una suspensión uniforme de glóbulos rojos o aglutinados.

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5. En los estudios inmunohematológicos (no rutinarios), incubar a temperatura ambiente durante10 minutos, centrifugar y leer de nuevo. 6. En caso de un resultado positivo, repetir la reacción con los sueros antiglobulina humana monoespecíficos anti-IgG, anti-C3d y eventualmente anti- IgA. Interpretación Si se observa aglutinación de los eritrocitos, indica de que estos fueron recubiertos por anticuerpos IgG o fracciones del complemento in vivo. Prueba antiglobulínica indirecta con albúmina en tubo Se rotularán 2 tubos de Kahn con las iniciales del paciente o el número de donante y número del vial (ej.: I y II). 1. Añadir 1 gota de suero a dos tubos rotulados. 2. Añadir 1 gota de albúmina bovina al 3%. 3. Añadir 1 gota de suspensión de glóbulos rojos (reactivo o de donantes) al 2-5% a cada tubo y mezclar. 4. Incubar a 37º C durante 30 minutos. 5. Centrifugar y observar en busca de hemólisis y/o aglutinación. Clasificar y anotar los resultados. 6. Lavar los glóbulos rojos 3 veces con solución salina y descartar totalmente el sobrenadante del último lavado. 7. Añadir 1 gota de antiglobulina humana, centrifugar durante 15 segundos a 2.500 rpm. Leer y anotar los resultados. Interpretación Si después de incubar a 37º C y de centrifugar hay aglutinación significa que en el suero del paciente hay anticuerpo tipo IgM, si se intensifica la aglutinación a 4 º C, significa que hay presencia de una crioaglutinina. Si después de agregar la AGH y de centrifugar, se observa aglutinación de los eritrocitos, indica de que en el suero del paciente hay anticuerpos de tipo IgG o fracciones del complemento in vivo.

Control del test Adicionar 1 gota de células sensibilizadas o células control de Coombs a todos los tubos negativos para asegurar que la AGH está activa y no se ha neutralizado por alguna proteína presente en el tubo. Estas deben ser aglutinadas por la antiglobulina, si no es así, esta prueba queda invalidada y se debe volver a repetir. Se debe obtener una lectura positiva de 1+ a 2+ . Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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TÉCNICA EN GEL PARA PRUEBA DE COOMBS DIRECTA E INDIRECTA (Bio-Type)

Detección de anticuerpos irregulares en gel PRINCIPIO El reactivo de Coombs o prueba de Antiglobulina Humana Poliespecífica, es una prueba utilizada de rutina en la detección de aloanticuerpos, pruebas de compatibilidad y pruebas de Coombs Directo. Sueros de Coombs poliespecíficos contienen anticuerpos dirigidos hacia IgG de origen humano y el componente C3d del complemento humano. Indudablemente, la detección de la fracción IgG es la de mayor importancia. La importancia en la detección de fracciones de complemento como C3d se manifiesta principalmente en las pruebas de Coombs Directo, en la investigación de anemias hemolíticas autoinmunes. Pruebas de Coombs Directo positivas, generalmente son indicativas de glóbulos rojos sensibilizados in vivo, por inmunoglobulinas y/o complemento. Reactivo La tarjeta Bio-Type AHG contiene suero de Coombs Poliespecífico con fracción anti-IgG obtenida de conejos inmunizados con IgG humana purificada, y anticuerpos Monoclonales Murinos Anti-C3d. (BRIC 8). Glóbulos rojos sensibilizados con fracción de complemento C4d no reaccionan con este reactivo. Este reactivo ha sido formulado para uso en Detección e Identificación de anticuerpos irregulares, Pruebas de Compatibilidad y Coombs Directo. Precauciones Este reactivo contiene 0.1% p/v Azida de Sodio. Puede ser tóxico al ser ingerido y reacciona con las tuberías de plomo y cobre.

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Almacenaje Almacenar entre 18-25ºC. El reactivo se mantendrá estable por todo el período indicado. Toma de la muestra La muestra de sangre debe ser extraída en forma aséptica y preferentemente en Citrato, EDTA, Heparina o CPD-A. Para obtener resultados confiables se recomienda el uso de sangre fresca. Se puede utilizar suero o plasma frescos. Reacciones de Hemólisis dependientes de complemento podrían pasar desapercibidas al utilizar plasma en vez de suero. La muestra de suero o plasma, una vez separada, puede ser almacenada durante 48 horas a temperatura de refrigeración (2-8 °C), o congelarse entre –20 a –80 °C por períodos mayores. Al utilizar suero, este debe ser aclarado mediante centrifugación a 1.500 g por 10 minutos, para evitar residuos de fibrina que pudieran interferir con la reacción. Preparación de la muestra Preparar una suspensión de Glóbulos Rojos al 1% en la solución I de la siguiente forma: 1. Las Células de screening deben ser diluidas al 1% en Solución I de acuerdo a la siguiente proporción, dependiendo del número de muestras diarias: Vol. Gr (uL) 40 200 (4 gotas) 400 (8 gotas)

Vol. Solución I (uL) 100 500 ( Dispensar 1 Volumen) 1000 ( Dispensar 2 Volúmenes)

Vol. Total (uL) 140 700 1400

Nº de pruebas 2 14 28

2. Agregar 50 ul (1 gota) de Glóbulos rojos I y II al 1% a cada pocillo 3. Agregar 25 ul de suero o plasma 4. Incubar 15 minutos a 37ºC 5. Centrifugar 10 minutos 6. Leer

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Coombs directo en gel 1.

Agregar 50 ul de G.R. lavados y resuspendidos al 1% (diluidos en Solución I) a cada pocillo. 2. Centrifugar 10 minutos 3. Leer

Falsos negativos Neutralización del reactivo antiglobulínico humano. Interrupción de la prueba. Almacenamiento incorrecto de los reactivos. Procedimientos incorrectos. Complemento. Solución salina. Exceso de antígenos Omisión de adición de AGH Tiempo de incubación y temperatura inadecuada Falsos positivos Células aglutinadas antes de los lavados. Presencia de coágulos de fibrina Problemas con la limpieza de material Células con PAD positiva. Complemento. Contaminación de AGH

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INVESTIGACIÓN DE MUESTRAS Rh NEGATIVAS, Rh POSITIVAS DÉBILES o Rh POSITIVA PARCIAL Principio El antígeno Rh D puede expresarse de forma completa y por lo tanto estamos en presencia de un resultado Rh D Positivo o simplemente no expresarse y por tanto ser un Rh D Negativo o hacerlo de forma débil o parcialmente y por lo tanto ser clasificado como un Rh D Positivo débil. Dicha expresión obedece al gen RHD que se encuentra en el brazo largo del cromosoma 1, siendo heredado tanto del padre como de la madre 1. Colocar una gota de antisuero anti-D en un tubo limpio y rotulado. 2. Añadir una gota de la suspensión al 2-5% en solución salina de glóbulos rojos problema. 3. Mezclar y centrifugar durante 15 segundos a 1800 rpm o 10 segundos a 2000 rpm 4. Resuspender suavemente el sedimento de glóbulos rojos y examinar en busca de aglutinación. Si se observara en este punto una aglutinación mayor a 1+, informar como D positivo. No será necesario continuar con la fase de AGH. 5. Si los glóbulos rojos problema no se hubiesen aglutinado o mostrasen una aglutinación dudosa, incubar por 15 a 30 minutos a 37 grados Celsius, una vez terminada la incubación, 6. Lavar los tres a cuatro veces con abundante solución salina tamponada (PBS). Después del último lavado, descartar totalmente el PBS y secar los bordes, invirtiendo el tubo en forma enérgica de una sola vez sobre papel absorbente. 7. Añadir 2 gotas de AGH, puede utilizarse un reactivo poliespecífico anti-IgG y anti-C3d o monoespecífico anti-IgG. 8. Mezclar suavemente y centrifugar durante 15 segundos a 1800 rpm. 9. Posteriormente en la fase de lectura resuspender suavemente el sedimento de glóbulos rojos, examinar en busca de aglutinación y anotar el resultado de la prueba. 10. Si el resultado fuera negativo, la reacción podrá confirmarse añadiendo glóbulos rojos sensibilizados por IgG, centrifugar de nuevo para lectura y volver a examinar en busca de aglutinación. La aparición de aglutinación en este punto confirma la presencia de antiglobulina humana activa en la mezcla de la prueba.

Interpretación Si el resultado es negativo, se puede afirmar que esa persona es Rh D negativa. Si el resultado es positivo puede ser porque la persona tiene un antígeno D débil o un D parcial.

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DETERMINACIÓN DEL FENOTIPO Rh-Hr Y CÁLCULO DEL GENOTIPO MÁS PROBABLE La existencia de genes estrechamente ligados en el mismo cromosoma, heredándose como una unidad, en donde cada gen determina un antígeno eritrocitario específico fue la propuesta de Fischer y Race en el año 1943 y le asignaron el nombre de Sistema Rh, siendo los tres alelos más importante: D, C-c, E-e que están codificados por dos genes, el gen D y el gen CE. La presencia de cada antígeno (D,C,c,E,e) puede realizarse con antisueros específicos, excepto para el antígeno d cuyo anticuerpos aún no ha sido descubierto, por tanto la ausencia de D se debe anotar como d. El cálculo de la probabilidad genotípica se basa en la frecuencia con que se asocian los alelos en el cromosoma. Materiales. - Centrífugas Inmunohematológicas - Pipetas Pasteur. - Recipiente para desechos. - Tubos Kahn. - GR R1R2 como control positivo para cada antisuero del Sistema Rh-Hr - GR R1R1 (E, c), R2R2 (C, e), como control negativo para cada antisuero del Sistema Rh-Hr - Centrífuga para muestras. - Pizetas plásticas con PBS. - Papel desechable. - Guantes. - Parafilm. - Refrigerador para guardar muestras y reactivos en general.

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Técnica En el refrigerador de Inmunohematología se deben mantener Glóbulos Rojos R1R1, R1R2 o R2R2 como control (-) o +. Los glóbulos se seleccionan de las unidades (Concentrados de Glóbulos Rojos) más frescas disponibles para uso. Se determina su genotipo Rh más probable mediante el uso de los reactivos correspondientes. 1. Preparar 5 tubos de Kahn marcados como D, C, E, c, e 2. Colocar en cada tubo lo que corresponda, 1 gota del antisuero anti-Rh es decir una gota de antisuero D al tubo marcado D, etc. 3. Hacer una suspensión de los glóbulos rojos a estudiar del 2-4% en solución salina y añadir una gota a cada tubo. No olvidar los controles Negativos y positivos para cada antisuero (D, C, c, E, e). Para los controles se puede usar cada antisuero a una dilución de ¼ en PBS. Para esto tomar 50 microlitros de antisuero y resuspenderlo en 150 microlitros de PBS quedando un volumen final de 200 microlitros, que nos alcanza para realizar 2 determinaciones y 2 controles para cada uno. Luego de lavados los glóbulos y hechas las diluciones, 4. Tomar 50 microlitros de antisuero diluido y ponerlo en un tubo Kahn, 5. Agregar 50 microlitros de glóbulos a analizar mezclar. Realizar esto con los tubos rotulados como Anti D, Anti C, Anti c, Anti E y Anti e, y también para los controles Negativos y positivos de cada antisuero. 6. Centrifugar los tubos y leer sobre la fuente luminosa. 7. Validar los resultados con los controles. 8. Interpretar el resultado registrando la intensidad de aglutinación observada de cada tubo en la plantilla de resultados, luego según lo observado asignar un genotipo Rh más probable de acuerdo a la tabla adjunta.

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Tabla 1. Genotipos probables. ANTI D

C

E

Genotipo probable c

E Wiener

+

+

0

+

+

+

+

0

0

+

0

0

0

+

+

+

+

+

+

+

+

0

+

+

+

+

0

+

+

0

+

0

0

+

+

0

+

0

+

+

0

0

+

+

+

FischerRace

1

DCe/dce

Rr R1R1 rr R1R2 R2r R2R2 Ror r´r r´´r

DCe/DCe dce/dce DCe/DcE DcE/dce DcE/DcE Dce/dce dCe/dce dcE/dce

Tabla 2. Frecuencia Genética en Población de Santiago. Cuadro Comparativo. Wiener Haplotipo 1

R r R2 R0 r’ r’’ Rz ry

FischerRace DCe

Chile % 49,9

Frecuencia Blancos 42

dce

22,2

37

26

DcE

22,2

14

11

Dce

2,3

4

44

dCe

0,9

2

2

dcE

1,4

1

0

DCE

0,9

0

0

dCE

0

0

0

Negros 17

Rev.Méd.Chile 116:28-33, 1988

Tabla 3. Frecuencia Genética de Antígenos Rh GEN D d(Ausencia de D) C E c e

Frecuencia (%) 85 15 70 30 80 98

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CLASIFICACIÓN ABO Y RH EN EL RECIÉN NACIDO Tipo de muestra: sangre capilar anticoagulada Sangre de cordón umbilical Reactivos: sueros tipificadotes anti A, B, AB, D. PBS Técnica: Si es sangre de cordón, lavar 4 veces con solución salina para eliminar la gelatina de Wharton. Hacer suspensión celular al 4 % en PBS 1. 2. 3. 4. 5.

Marcar 5 tubos A, B, AB, D y AGH. Agregar 2 gotas de los antisueros según corresponda. Agregar a cada tubo 1 gota de la suspensión de GR. Mezclar y centrifugar Remover los eritrocitos sedimentados, observar si existe aglutinación. Informar en cruces

Protocolo Identificación Anti A

Anti B

Anti AB

Anti D

TAD

Grupo ABO

No se realiza la prueba inversa debido a que los RN no presentan anticuerpos naturales propios hasta los 4-6 meses de vida.

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CLASIFICACIÓN ABO Y RH EN EL RECIÉN NACIDO EN GEL(Bio-type) Principio El fenotipo ABO de un individuo es determinado por la aglutinación de sus glóbulos rojos en la presencia de suero Anti-A, Anti-B y Anti-AB. (Prueba directa). En adultos, la confirmación del grupo ABO puede llevarse a cabo por la reacción del suero de este individuo con una suspensión de glóbulos rojos A1 y B. ( Prueba Inversa). Debido a que la presencia de estos anticuerpos no ocurre antes de los 4-6 meses de vida, la prueba inversa no puede llevarse a cabo en recién nacidos. Los antígenos A y B no se encuentran totalmente desarrollados en los recién nacidos, motivo por el cual sus reacciones de aglutinación pueden ser más débiles y subgrupos no pueden ser identificados. La tarjeta Bio-Type Recién Nacido le permite al usuario efectuar la prueba directa, determinación del grupo Rh y la prueba de Coombs directo. Los pacientes que presenten un grupo D (-) pueden ser llevados a Du de acuerdo a las normas de cada institución. Sangre de cordón o de talón puede ser utilizada. Generalmente no es necesario lavar la sangre previo a su clasificación. Se recomienda lavar 1 vez la muestra de cordón en PBS, para una mejor estandarización. Hay que lavar la sangre de cordón si no está anticoagulada para eliminar microcoágulos. Reactivo La tarjeta Bio-Type Recién Nacido consta de los siguientes pocillos: 1-Anticuerpos Monoclonales Anti-A (Línea celular BIRMA-1). 2- Anti-B (Línea celular KLB-2). 3- Anti-AB (Línea celular BIRMA-1, ES-4, ES-15). 4 - Anti-D IgM/IgG (Anti-D IgM línea celular TH-28 y Anti-D IgG derivado de la línea celular MS-26). 5- Gel neutro para control Rh. 6-Suero de Coombs Poliespecífico con fracción anti-IgG obtenida de conejos inmunizados con IgG humana purificada, y anticuerpos Monoclonales Murinos Anti-C3d. (BRIC 8). Glóbulos rojos sensibilizados con fracción de complemento C4d no reaccionan con este reactivo. Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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Este pocillo ha sido diseñado para detección de muestras con Coombs Directo Positivo (+). Precauciones Este reactivo contiene 0.1% p/v Azida de Sodio. Puede ser tóxico al ser ingerido y reacciona con las tuberías de plomo y cobre. Almacenaje Almacenar entre 18-25ºC. El reactivo se mantendrá estable por todo el período indicado. Toma de la muestra Sangre de cordón o punción de talón puede ser utilizada. Generalmente no es necesario lavar la sangre previo a su clasificación. Cuando se utilice sangre de cordón debe evitarse la contaminación con gelatina de Wharton. La muestra de sangre debe ser extraída en forma aséptica y preferentemente en Citrato, EDTA, Heparina o CPD-A. Para obtener resultados confiables se recomienda el uso de sangre fresca. Preparación de la muestra Preparar una suspensión de Glóbulos Rojos al 1% en la solución I de la siguiente forma: En un tubo de ensayo limpio, colocar 1 ml de “Solución I” y 10 ul de sedimento de glóbulos rojos. Procedimiento. No utilizar tarjetas que presenten deshidratación o variación en su presentación al examen ocular. No utilizar muestras hemolizadas o contaminadas. 1.- Identificar cada tarjeta con el nombre del paciente. Retirar el sello que recubre la tarjeta. 2.- Añadir 50 ul de glóbulos rojos suspendidos al 1% en solución I a los pocillos 1 al 6. 3-Centrifugar por 10 minutos a la velocidad indicada. 4- Leer y anotar los resultados. Interpretación Las muestras positivas se presentan como una línea roja en la superficie del reactivo, (4+) o dispersadas a través del pocillo (1-3 +). Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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Las muestras negativas forman un botón compacto en el fondo del pocillo. La reacción en el tubo control debe ser negativa. En el caso que diera positiva, la reacción en el tubo D(Rh) es invalida y debe ser repetida de la siguiente forma: Lavar los glóbulos rojos en solución salina tibia o solución I. Luego proceder a preparar nuevamente la solución de trabajo al 1%. Una reacción positiva en el tubo Coombs, indica que los glóbulos rojos de la muestra se encuentran sensibilizados.

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IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES Los anticuerpos irregulares detectados en pacientes previamente expuestos a antígenos externos como en politransfundidos, embarazos y menos frecuente en donantes, deben identificarse con el objetivo de conocer su especificidad, importancia clínica y antes de realizar la prueba cruzada. Para esta identificación se utilizan un set de 11 células grupo O IV cada una de un solo donante, suspendidas en una solución preservante, en una concentración del 2 al 4%, con antígenos de importancia clínica conocidos que presentan expresión de doble dosis (homocigotos), estas se utilizan para la determinación de anticuerpos irregulares clínicamente significativos. La identificación de los anticuerpos detectados previo a la prueba cruzada tiene la finalidad de encontrar sangre compatible para el paciente que la necesita, por lo tanto negativa para el antígeno correspondiente al anticuerpo encontrado. Es de importancia clínica la investigación de estos anticuerpos en reacciones postransfusionales (causen hemólisis), enfermedad hemolítica del recién nacido (atraviesen placenta) o anemia hemolítica autoinmune, estos anticuerpos son en su mayoría anticuerpos IgG que reaccionan a 37°C y en antiglobulina humana. La técnica se realiza entre el suero en estudio y el panel o set de células (glóbulos rojos) con antígenos conocidos además del medio y temperatura adecuada. Reactivos: Panel de GR (DE 11, 12 o 16 células) Plasma o suero del paciente o donante PBS Suero de Coombs Células control de Coombs Técnica en tubo 1. Rotular los tubos para cada una célula a usar (11), Se puede incluir una prueba autóloga como tubo número 12. 2. Poner 2 a 3 gotas de suero o plasma a ser evaluado en cada uno de los tubos. 3. Agregar una gota de la suspensión globular en los tubos correspondientes, en la prueba autóloga, agregar una gota de glóbulos del paciente o donante al 2- 4%, resuspendidas en PBS o en su propio suero. 4. Mezclar los tubos y centrifugar según condiciones estandarizadas 5. Leer los tubos en busca de aglutinación o hemólisis sobre la fuente de luz. Registrar resultados positivos. 6. Incubar los tubos por 45 a 60 minutos a 37° C.

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7. Centrifugar. Leer los tubos en busca de aglutinación o hemólisis sobre la fuente de luz. Registrar resultados positivos. 8. Lavar los tubos cuatro veces con PBS. En el último lavado luego de botar el PBS, secar los tubos sobre un papel absorbente, a fin de dejar el botón de glóbulos seco en el fondo del tubo. 9. Agregar dos gotas de suero de Coombs a cada tubo. Mezclar. 10. Centrifugar los tubos y leer. Interpretación: Ausencia de aglutinación en todos los tubos indica que no se encuentra antígeno para el anticuerpo. Presencia de antígenos para el anticuerpo, estos se deben comparar con la tabla de antigenicidad que proporciona el kit. Control de calidad Se utilizan las células control de Coombs para validar los resultados con AGH negativos.

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CALCULO DE PROBABILIDAD MÉTODO EXACTO DE FISHER Compara el número de resultados positivos y negativos con el número de células que expresan o carecen de los antígenos correspondientes. El valor de p de 0,05 es el máximo aceptado para que la interpretación se considere estadísticamente valida, por lo tanto habría un 95% de posibilidades de que la interpretación de los datos sea correcta.

Interpretación Resultados

Antígeno Presente

Antígeno Ausente

TOTAL

Positivo

A

B

A+B

Negativo

C

D

C+D

TOTAL

A+C

B+D

N

A=Número de reacciones positivas con células que poseen el Ag B= Número de reacciones positivas con células que carecen el Ag C= Número de reacciones negativa con células que poseen el Ag D= Número de reacciones negativa con células que carecen el Ag Luego p:

P: (A+B)! x (C+D)! x (A+C)! x (B+D)! N! x A! x B! x C! x D!

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TITULACIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES La titulación de anticuerpos es un método semicuantitativo usado para determinar la concentración de anticuerpos en muestras de suero o comparar la intensidad de la expresión antigénica en distintas muestras de glóbulos rojos. Durante el embarazo, la titulación de anticuerpos se realiza para identificar a las mujeres con niveles significativos de anticuerpos que podrían provocar una EHRN. En este caso es importante no utilizar técnicas potenciadoras como albúmina, PEG, LISS o glóbulos rojos tratados con enzimas, porque podrían observarse títulos falsamente elevados. Para la titulación de anti-D usar glóbulos rojos R2/R2 para evitar efectos de posición. Aplicaciones: 1. 2. 3. 4.

Madres embarazadas alo inmunizadas. Estudio de Auto anticuerpos. Estudio de anticuerpos con alto título y baja avidez. Evaluar el efecto de reactivos sulfhidrilos usados en el reconocimiento de inmunoglobulinas.

Muestras: suero a titular. Reactivos y Materiales: 1. Glóbulos rojos que expresan los antígenos correspondientes a los anticuerpos en estudio, en suspensión al 2% - 5% en solución salina. 2. Solución salina. 3. Tubos de vidrio de 10x75 mm. 4. Pipetas de 0,1 – 0,5 ml. 5. Suero de antiglobulina humana. Procedimiento 1. Rotular 10 tubos de acuerdo con la dilución del suero 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512. 2. Colocar 1 volumen de solución salina en todos los tubos (se recomienda usar volúmenes de 0,5 ml para evitar errores causados por la inexactitud de las mediciones). 3. Agregar al tubo marcado como 2 un volumen de suero igual al agregado de solución salina ya adicionado. 4. Con una pipeta limpia, mezclar varias veces cuidando de no hacer burbujas el contenido de la dilución 1 en 2 y transferir 1 volumen al tubo siguiente (dilución 1 en 4). Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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5. Repetir el paso anterior para todas las diluciones, cuidando de usar una pipeta limpia para mezclar y transferir cada dilución. Retirar 1 volumen de suero diluido del tubo final y guardarlo para diluciones siguientes. 6. Marcar 10 tubos de 10x75 mm, para las diluciones apropiadas. 7. Usando pipetas individuales para cada dilución, transferir 2 gotas de suero a cada uno de los tubos del paso 6 y agregar 1 gota de la suspensión de glóbulos rojos. Se puede ocupar la misma pipeta si se comienza del tubo más diluido al más concentrado. 8. Mezclar bien e incubar según la técnica empleada para la detección e identificación del anticuerpo en estudio. 9. Examinar los resultados y registrar las reacciones. Se recomienda comenzar desde el tubo más diluido. Interpretación 1. Observar la dilución más alta que produce aglutinación macroscópica de 1+. 2. En los estudios comparativos la diferencia significativa en los títulos es de tres o más diluciones. Observaciones 1. En el caso de madres sensibilizadas con especificidad anti-D se deben utilizar glóbulos rojos con fenotipo R2R2, al igual que para cualquier antígeno que presente efecto de dosis se deben enfrentar glóbulos rojos con antígeno en doble dosis. 2. Para cada control de título se debe hacer en paralelo con la muestra de control anterior y se debe realizar una nueva identificación para cada control. 3. En los estudios con anticuerpos dirigidos contra antígenos de baja incidencia, 4. considerar el empleo de glóbulos rojos paternos. No usar técnicas potenciadoras (como PEG y medios de baja fuerza iónica LISS) o glóbulos rojos tratados con enzima porque podrían obtenerse títulos elevados.

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ESTUDIO DE MUESTRAS CON TEST DE ANTIGLOBULINA HUMANA DIRECTA POSITIVA El estudio de muestras con PAD +, se emplea para determinar la existencia de glóbulos rojos recubiertos con anticuerpos IgG y/o complemento in vivo. Sin embargo la presencia tanto de IgG o C3 en glóbulos rojos no significa necesariamente que esos glóbulos rojos se destruyen in vivo, se debe buscar evidencia adicional, como presencia de anemia. Se utiliza la AGH poliespecífica que reaccione tanto con IgG como C3 presentes en los glóbulos rojos. Si la PAD es + se podría utilizar y repetirse con reactivos anti IgG y anti C3 por separado.

Causas de pruebas de Coombs directas positivas Enfermedad hemolítica del recién nacido En esta patología se puede observar una prueba de Coombs Directa positiva, debido a que el eritrocito del recién nacido está recubierto por los anticuerpos maternos que se unen a los antígenos complementarios presentes en la membrana del glóbulo rojo. Anemia hemolítica autoinmune por anticuerpos calientes y Lupus eritematoso sistémico El Coombs Directo resulta positivo debido a que el paciente genera una respuesta inmune contra sus propios antígenos, por lo que sus anticuerpos se unen a estos y atacan sus propias células con el fin de hemolizarlas. Transfusión previa incompatible con hemólisis extravascular Si previamente el receptor estaba sensibilizado contra algún anticuerpo irregular o fue transfundido con un plasma incompatible (grupo O a otro grupo sanguíneo o donante con anticuerpo irregular), genera una hemólisis extravascular, por lo que la prueba de Coombs Directo resultaría positiva. Medicamentos e infecciones Algunos medicamentos tales como el antihipertensivo alfa-metildopa, penicilina, cefalotina, o infecciones virales pueden causar Coombs Directo positivo, lo importante en estos casos es saber determinarlo, esto puede ser a través de la ficha clínica del paciente y/o la comunicación con el médico tratante. Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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Metildopa induce la formación de autoanticuerpos mediante su efecto inhibidor sobre las células T suprimiendo estas la producción de anticuerpos por las células B. la mayor parte de estos pacientes no presentan hemólisis pero si una PAD +.

Síndrome de Crioaglutininas Las Crioaglutininas son anticuerpos inespecíficos que generalmente se pueden visualizar a temperatura de 4ºC, generalmente sin relevancia clínica pero que es necesario estudiarlas y demostrar su inocuidad. Una crioaglutinina puede estar enmascarando un anticuerpo clínicamente significativo (Aloanticuerpo; alo de griego Allo=otro) o estar relacionado con alguna patología como por ejemplo Síndrome de aglutininas frias, que se da en pacientes con enfermedades lifoproliferativas, mononucleosis infecciosa, o neumonía atípica por Mycoplasma pneumoniae, Hemoglobinuria paroxística por frío o Síndrome de Donath-Landsteiner, hemoglobinuria paroxística nocturna pueden desarrollar anticuerpos IgM debido a cierta similitud antigénica frecuentemente contra el antígeno I (antígeno i grande) del glóbulo rojo generando un fenómeno autoinmune lo que se refleja en la producción de autoanticuerpos fríos dirigidos en contra del huésped, por tanto hay una relación directa entre el título del anticuerpo y la severidad del cuadro clínico de Neumonía. Estudio serológico para evaluar la PAD + - Analizar con anti IgG y anti C3d para determinar qué tipo de proteínas recubren los glóbulos rojos. - Analizar suero/plasma para detectar e identificar anticuerpos contra antígenos eritrocitarios significativos. - Examinar el eluato preparado a partir de los glóbulos rojos recubiertos. Este se examina con una batería de células reactivas, para determinar si son aloanticuerpos (reacción transfusional o EHRN) o fracciones del complemento en donde los eluatos no son reactivos. Para facilitar los resultados de las pruebas, se debe revisar la historia clínica, el diagnóstico, antecedentes terapéuticos, gestacionales y transfusiones recientes del paciente. Además complementar con los resultados de laboratorio: Hematocrito, bilirrubina, haptoglobina y recuento de reticulocitos. Observar destrucción eritrocitaria: reticulositosis, hemoglobinemia, hemoglobinuria, disminución de la haptoglobina sérica, elevación de la lactato deshidrogenada, además paciente se observa anémico. Averiguar si el paciente fue transfundido en fecha reciente: La fijación de anticuerpos en los glóbulos rojos, puede ser indicador de una respuesta inmunológica en desarrollo. En la inmunización primaria los anticuerpos podrían aparecer ya a los 7-10 días de la transfusión y en la secundaria a los 2-7 días. Elución: Libera los anticuerpos de los eritrocitos sensibilizados y los recupera en forma utilizable. Cuando no se conoce la causa de TCD se puede preparar eluido y probarlo contra un panel de eritrocitos. Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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Por lo general se puede detectar la misma especificidad en el suero del paciente. Cuando el eluído reacciona con todas las células del panel la explicación más probable es la de un autoanticuerpo. Cuando no hay presentes anticuerpos irregulares en el suero y el paciente no ha sido transfundido recientemente no es necesaria otra prueba serológica para la detección de un autoanticuerpo aislado

Criterios para diagnosticar AHAI - Evidencia serológica de un autoanticuerpo: TCD positivo Autocontrol positivo Identificación de un autoanticuerpo en el eluato y suero. - Evidencia clínica o de laboratorio de Hemólisis Investigación de autoanticuerpos AHAI Suero debe ser separado a 37ºC; para permitir la cuidadosa evaluación de la amplitud térmica y titulación de cualquier autoanticuerpo frío presente. Esto permite evitar la absorción de anticuerpo frío por los GR. EDTA inhibe la activación de complemento in vitro, por lo tanto cualquier componente del complemento detectado será debido a activación in vivo Test en eluatos de GR AHAI -Para dilucidar la causa de un TCD positivo. -Permiten conocer la clase de Inmunoglobulina presente -Si no se encuentra anticuerpo en el eluato se puede deber a: Drogas como Penicilina Pacientes con grandes cantidades de complejos inmunes -Se pueden encontrar aloanticuerpos que simulen un autoanticuerpo: EHRN, RHT Problemas serologicos que plantean los autoanticuerpos: - Si hay presencia de aglutininas frías lavar con PBS calentado las células y hacer clasificación ABO y Rh a 37°C. Mantener la muestra a 37° C. Usar control paralelo de albúmina al 6 % en solución salina para verificar si continua la autoaglutinación. Para la prueba inversa hacer control autólogo - Si se emplea soluciones de Albúmina bovina o enzimas proteolíticas los GR sensibilizados pueden aglutinar espontáneamente. Lavar previamente en PBS -

Como las crioaglutininas casi siempre son IgM, tratar los glóbulos rojos con reactivos sulfidrilos DTT o ZZAP.

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TÉCNICA DE AUTOADSORCIÓN DE ANTICUERPOS CALIENTES Principio La técnica de autoadsorción se realiza a pacientes en los que existe la presencia de autoanticuerpos. Esto generalmente es solicitado cuando un paciente necesita transfusión. El Suero del paciente es puesto en contacto con glóbulos autólogos tratados, que permiten retirar el autoanticuerpo de su suero, para así probarlo y eventualmente descartar aloanticuerpos. Existen dos técnicas para realizar la autoadsorción, una usando ZZAP y otra usando PEG, las que pueden usarse indistintamente dependiendo de la disponibilidad de muestra del paciente y urgencia de la transfusión. Esta autoadsorción se hace más efectiva, si se retiran primero los autoanticuerpos, se tratan las células con enzimas, se dejan los sitios antigénicos libres para que se unan los autoanticuerpos libres del suero y así retirarse los aloanticuerpos del mismo. La autoadsorción no debe realizarse en pacientes que han sido recientemente transfundidos, ya que los eritrocitos transfundidos circulantes, pueden adsorber los aloanticuerpos libres.

Materiales y Reactivos -

Muestra de sangre total con EDTA Células de Screening I y II R1R1, R2R2 Tubos de Khan, gradilla para tubos. PBS. Suero Antinmunoglobulina humana o suero de Coombs. Glóbulos rojos sensibilizados (Control Positivo). Baño de incubación a 37°C. Centrífuga inmunohematológica. Timer. Lápiz Marcador. Papel Absorbente. Fuente de Luminosa Papaína al 1% (activada con cisteína), almacenada a -18ºC. DTT stock 0.2 M, almacenado a -18ºC. Buffer fosfato salino (PBS) pH 7.3. Gamma PEG (Gamma Biologicals INC).

ZZAP: Reactivo preparado con papaína y DTT (Dithiothreitol), que permite “limpiar” la superficie de los glóbulos rojos a usar para la adsorción. PEG: Polímero soluble en agua usado como potenciador de reacción antígeno-anticuerpo.

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Metodología AUTOADSORCION CON ZZAP Modificación de los glóbulos rojos con reactivo ZZAP Preparación del reactivo ZZAP. Para 1 ml de ZZAP preparar: 0,5 ml de DTT stock 0.2 M. 0,1 ml de papaína stock 1% 0,4 ml de PBS. Tratamiento de los Hematíes: Centrifugar los glóbulos rojos autólogos con TAD positivo del paciente o glóbulos rojos control (+); remover el plasma de tal manera de dejar el concentrado de glóbulos rojos, no se requiere lavar. Mezclar un volumen de GR concentrados (según disponibilidad de muestra) más 2 volúmenes de ZZAP. Ej. 0,5 ml de GR autólogos con TAD +, y otro tubo control GR sensibilizados Incubar 30min a 37º C. Mezclar por inversión cada 15 minutos durante la incubación. Terminada la incubación, lavar 4 veces con abundante PBS (llenar hasta ¾ del tubo de Khan) mediante el uso de la centrifuga inmunohematológica. En el último lavado, centrifugar 3 minutos en vez de 1 minuto en High para dejar bien concentrados los glóbulos rojos tratados. Realizar un TAD a los glóbulos rojos tratados para verificar que la cantidad de IgG unida haya disminuido (verificado en intensidades de cruces) Adsorción: a. Agregar a razón de 1 /2 un volumen del suero paciente que se va a adsorber con dos volúmenes de GR modificados y tratados con ZZAP concentrados. b. Incubar 15 minutos a 37ºC. c. Centrifugar y extraer el suero autoadsobido. d. Con el suero autoadsorbido hacer un TAI con células I y II, el cual debería ser Negativo, si no lo es, repetir la autoadsorción usando una nueva alícuota de GR tratados con ZZAP. Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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AUTOADSORCION CON PEG Mezclar 0.5 ml de plasma a autoadsorber 0.5 ml de glóbulos rojos concentrados (no es necesario lavar los glóbulos) 0.5 ml de PEG Incubar 15 minutos a 37ºC. Centrifugar 7 minutos a 1.200 rpm en centrífuga inmunohematológica Separar el plasma autoadsorbido. Hacer un TAI al suero autoadsorbido para lo cual colocar 4 gotas de plasma autoadsorbido con 1 gota de células I , TUBO I y 4 gotas de plasma autoadsorbido con 1 gota de células II , TUBO II Incubar 15 minutos a 37ºC. Luego de la incubación, lavar 4 veces con PBS, en el último lavado no olvidar secar bien con tubo invertido sobre toalla nova. Agregar dos gotas de anti IgG (suero anti-Inmunoglobulina humana monoespecífico), tener cuidado de NO usar suero anti-Inmunoglobulina humana poliespecífico ya que la presencia de anti-Complemento genera falsos positivos. Si este resultado es negativo, guardar el resto de plasma autoadsorbido para realizar pruebas de compatibilidad, usar la misma relación anterior, es decir, 4 gotas de plasma autoadsorbido + 1 gota de los glóbulos a transfundir, incubar 15 minutos a 37ºC, lavar 4 veces con PBS, resuspenderlos en PBS a una concentración del 4% y finalmente agregar dos gotas de anti IgG (suero anti-Inmunoglobulina humana monoespecífico) Si el resultado es positivo, se debe repetir la autoadsorción del plasma con un nuevo volumen de GR concentrados, no se requiere agregar PEG de nuevo.

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TÉCNICA DE ELUCIÓN ÁCIDA El Término elución ácida consiste en alterar las fuerzas de unión no covalente entre los complejos antigenos anticuerpos, mediante la modificación del Ph liberando los anticuerpos de los glóbulos rojos sensibilizados y permite recuperarlos. Esta técnica es usada para la investigación de hemólisis producida por auto y/o aloanticuerpos calientes. También usada para la fenotipificación de eritrocitos cubiertos con IgG en AHAI por anticuerpos calientes. Muestra Glóbulos rojos concentrados PAD positiva Reactivos Solución de elución: Ácido cítrico, fosfato de potasio monobásico y solución salina cuyo pH es de 2,7 Solución neutralizante: Buffer Tris pH 9,5, su función es neutralizar la acidez en el eluido. Sobrenadante salino: salino del lavado final de los glóbulos rojos en estudio.

Técnica 1. Lavar 4 veces 1 ml de glóbulos rojos concentrados PAD + con PBS. 2. Guardar el último sobrenadante del lavado para utilizarlo posteriormente como control negativo al realizar la identificación del anticuerpo. 3. Agregar 1 ml de la solución de elución. Mezclar por inversión 5 a 6 veces. Dejar a temperatura ambiente por 1,5 a 2 minutos. 4. Centrifugar de acuerdo al tiempo de lavado estandarizado. Remover el eluído sobrenadante, colocarlo en un tubo kahn previamente rotulado que contenga la cantidad de solución neutralizante necesaria para que el pH del eluído quede entre 6,8 y 7,2. Esto depende de la cantidad de eluído obtenido, es decir por cada ml de eluído, son 200 microlitros de sol. neutralizante. 5. Mezclar por inversión varias veces y centrifugar para remover algún precipitado que se pudo haber formado después de la neutralización. Traspasar el eluído neutralizado a un tubo kahn limpio, previamente rotulado. 6. Realizar la identificación del anticuerpo del eluído, sin dejar de incluir como control negativo un test de Coombs indirecto con el sobrenadante del último lavado reservado previamente.

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ESTUDIO DE CRIOAGLUTININAS Crioaglutininas: Anticuerpos fríos. Las Crioaglutininas son anticuerpos inespecíficos que generalmente se pueden visualizar a temperatura de 4ºC, sin relevancia clínica pero que es necesario estudiar y demostrar su inocuidad. Una crioaglutinina puede estar enmascarando un anticuerpo clínicamente significativo (Aloanticuerpo; alo de griego Allo=otro) o estar relacionado con alguna patología como por ejemplo Síndrome de aglutininas frías, que se da en pacientes con enfermedades lifoproliferativas, mononucleosis infecciosa, o neumonía atípica por Mycoplasma pneumoniae, Hemoglobinuria paroxística por frio o Síndrome de Donath-Landsteiner, hemoglobinuria paroxística nocturna. Dichas patologías pueden desarrollar anticuerpos del tipo IgM debido a cierta similitud antigénica frecuentemente contra el antígeno I (antígeno i grande) del glóbulo rojo generando un fenómeno autoinmune lo que se refleja en la producción de autoanticuerpos fríos dirigidos en contra del huésped, por tanto hay una relación directa entre el título del anticuerpo y la severidad del cuadro clínico ( Neumonía). Las crioaglutininas por sus características anteriormente señaladas se pueden fijar a los Glóbulos rojos causando activación de la cascada del complemento, por tanto se puede obtener una prueba de Coombs Directa positiva al utilizar suero antiglobulina Humana poliespecífico o mono específico anti-C3, por otro lado si se requiere asegurar la presencia de una IgG adherida al glóbulo rojo es conveniente utilizar un suero antiglobulina humana monoespecífico anti-IgG. En este síndrome la aglutinación se produce a temperaturas bajas y es mínima por sobre los 30º C. La hemólisis intravascular en rara vez suficiente para causar hemoglobinuria y hemosideruria, pero su presencia es ayuda diagnóstica importante. En algunos pacientes no se puede encontrar una causa subyacente, ésta forma atípica suele observarse en personas mayores. Mycoplasma pneumoniae es una etiología más común en jóvenes. Independiente de la causa el sitio primario de destrucción es el hígado. Para realizar el titulo la muestra debe cuidadosamente tratarse a 37° C, es decir; al momento de extraer la muestra mediante punción venosa, inmediatamente se de llevar a 37°C, idealmente el tubo donde se extraiga debería calentarse a baño maría o simplemente con agitación con la palma de las manos, transportar al laboratorio rápidamente conservando la cadena de temperatura requerida. Una vez recibida por el laboratorio de inmunohematología, controlar la temperatura durante el transporte, no debe ser inferior a 32°C. Luego la muestra es dejada en el baño maría a 37°C hasta obtener una buena calidad del coagulo extraído o de lo contrario centrifugar la muestra en una centrífuga con temperatura controlada , tomar suero y trasvasijarlo a un tubo Kahn previamente rotulado con el nombre del paciente, dejar el tubo original en el baño a 37°C.

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Determinación de crioaglutininas Para este análisis se requiere que la muestra sea extraída y puesta inmediatamente en un baño a 37ºC. 1. Marcar 3 tubos, I, II y PA. 2. Agregar 0.1 ml de suero del paciente a cada uno. 3. Agregar a cada uno de estos tubos 0.05 ml de glóbulos correspondientes, es decir, screening cells I y II y glóbulos autólogos. 4. Incubar los tubos por 1 hora a 4°C 5. Leer los tubos sin centrifugarlos previamente, en busca de aglutinación o hemólisis sobre la fuente de luz. Interpretación Si no hay reacción en ningún tubo luego de 60 minutos a 4ºC, el resultado es negativo. Si existe aglutinación en los tubos de células I, II o ambos y no en el tubo antólogo, no estamos en presencia de crioaglutininas, sino de un aloanticuerpo frío. Si aglutinan los tres tubos por igual, estamos en presencia de crioaglutininas. Si va desde +/- hasta ++ en los tres tubos, se informa como débilmente positivas, sin realizar título. Si va de +++ o mayor, se realiza título para lo cual se debe marcar 11 tubos con las diluciones a realizar para titular. (1/2,1/4,…….,1/2048).

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Título de crioaglutininas Procedimiento 1. Marcar 3 tubos, I, II y PA. 2. Agregar 0.1 ml de suero a cada tubo. 3. Agregar a cada uno de estos tubos 0.05 ml de glóbulos rojos de células de screening I y II y glóbulos autólogos. 4. Mezclar los tubos por agitación lateral. 5. Incubar los tubos por 60 Minutos a 4°C. Una vez terminada la incubación. 6. Leer los tubos sin centrifugarlos previamente, en busca de aglutinación o hemólisis sobre la fuente de luz, anotar y registrar sus resultados. De no haber reacción en ningún tubo, el resultado es negativo. 7. Si existe aglutinación en los tubos de células I,II o ambos y no en el tubo autólogo, no estamos en presencia de crioaglutininas, sino de un aloanticuerpo frío. 8. Si aglutinan los tres tubos por igual, estamos en presencia de crioaglutininas. 9. Si la aglutinación es desde +/- hasta ++ en los tres tubos, se informa como débilmente positivas, sin realizar título. 10. Si la intensidad de aglutinación es de +++ o mayor, se realiza título para lo cual se debe marcar 11 tubos con las diluciones a realizar para titular. (1/2,1/4,…….,1/2048). 11. Colocar a cada uno de los tubos 0.1 ml de PBS. 12. Agregar al primer tubo de dilución (1/2) 0.1 ml de suero a investigar. 13. Mezclar por agitación manual y tomar 0.1 ml de la mezcla. Transferir estos 0.1 ml al tubo con PBS de la dilución siguiente (1/4). Realizar esto hasta el último tubo de la serie. 14. Preparar como primer tubo de la serie el tubo sin diluir, marcarlo como 1 y agregar 0.1 ml de suero a analizar. 15. Agregar a cada uno de los tubos 0.05 ml de glóbulos rojos, escoger screening cells I o II en la cual la aglutinación en el paso anterior haya sido más alta. 16. Mezclar los tubos por agitación lateral. Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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17. Incubar los tubos por 60 Minutos a 4°C en BSUI-R1. 18. Leer los tubos sin centrifugarlos previamente, agitándolos en busca de aglutinación o hemólisis sobre la fuente de luz, desde el tubo de la dilución mayor al menor. Registrar el tubo de mayor dilución donde se observa aglutinación.

El informe se hace según el siguiente ejemplo: Crioaglutininas positivas +++ (aquí colocar la intensidad mayor) Título: positivo a dilución 1/256. (aquí colocar la mayor dilución a la que se observó aglutinación). Anotar en el libro de exámenes especiales el resultado obtenido. Informar en el sistema SILC y revisar en conjunto a la auxiliar de turno.

Determinación de rango térmico. Esto debe realizarse solo en caso que lo soliciten expresamente en la orden del examen. El rango térmico incluye la incubación del set anterior de tubos correspondiente al título a distintas temperaturas. Deben incluirse incubaciones a 4°C, 16°C, 24°C y 37°C. La de 4ºC se realiza en el refrigerador del Banco de Sangre. La de los 16°C debe ser preparada, tomando una caja de plumavit , y colocar allí un ice-pack que se encuentran , agregar agua de la llave y controlar temperatura, manteniéndola a 16°C por 1 hora. La incubación a 24°C se hace en el plaquetario y la de los 37°C en el baño termoregulador. La lectura de resultados debe hacerse de la misma forma y el informe también, es decir en positividad de la reacción y el título, para las distintas temperaturas.

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ESTANDARIZACIÓN DEL LISS INTRODUCCIÓN: El medio de baja fuerza iónica nos permite acortar el periodo de incubación de un test de Coombs indirecto o test de antiglobulina humana AGH de una hora a 15 minutos o menos. Esto debido a que disminuye el potencial zeta. Este hecho es de particular importancia en la unidad de transfusiones ya que nos permite tener las pruebas cruzadas de las transfusiones solicitadas en menos de 30 minutos. DEFINICIONES LISS medio de baja fuerza iónica preparado en nuestro laboratorio. PANELES DE SCREENING E IDENTIFICACIÓN kits comerciales con glóbulos rojos o células con anfígenos conocidos. Nos permiten detectar e identificar a nuestros anticuerpos controles. ANTICUERPOS CONTROLES sueros de nuestra seroteca con anticuerpos conocidos detectados e identificados en nuestro trabajo diario que se guardan para este fin. CÉLULAS O GLÓBULOS ROJOS CONTROL heterocigotos para el anfígeno investigado. CÉLULAS CONTROL AGH glóbulos rojos recubiertos con anticuerpos, se usan para control de calidad de los test de AGH. TIEMPO ÓPTIMO tiempo mínimo que muestra una aglutinación igual o superior a la lograda al incubar durante una hora la prueba de AGH entre el suero control y las células apropiadas.

MATERIALES -

Tubos Kahn Centrifuga y lector de Inmunohematología Pipetas Pasteur y micro pipeta. Baño termo regulable. Timer. Células o glóbulos rojos Control heterocigotos para los anfígenos investigados Anticuerpos Controles Anti D, Anti Fya, Anti con una reacción débil Suero Antiglobulina Humana o Suero de Coombs Suero AB sin anticuerpos o Coombs Indirecto negativo Células control AGH

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ACTIVIDAD PRÁCTICA Sacar de nuestra seroteca los anticuerpos control. Un anti D marcado débil, si no está disponible el de más bajo título que se disponga. También un anti Duffy A o B y un anti K. Diluya los sueros 1: 4 o 1: 3 para que la reacción al hacer un test de Coombs indirecto, la reacción obtenida sea de una a dos cruces. Incube durante una hora los sueros control con los anticuerpos elegidos y diluidos según intensidad.

Ejemplo Anti D débil con célula del panel de identificación R1 r Anti Fya con célula del panel screening que contengan antígenos Fya+ Fyb+ Anti Kell con célula del panel screening que contengan antígenos K+ k+ Mientras se están incubando estos Coombs indirectos lave dos veces en PBS una cantidad suficiente (aprox. 1ml) de células control adecuadas a los anticuerpos elegidos, en el ejemplo serían célula 4 del panel de identificación R1/r y célula I del screening de anticuerpos, déjelos secos esperando diluirlos al 3- 4% en el nuevo lote de LISS. Preparar una batería de tubos marcados con los diferentes tiempos de incubación 8-10-12-15 minutos, en el ejemplo seria para anti D débil, anti Fya, anti Kell y suero AB sin anticuerpos. Una vez cumplido el tiempo de los Coombs indirectos lave y aplique la AGH. Registre los resultados para luego compararlos con los diferentes tiempos del nuevo LISS. Repartir los sueros a los tubos según su marca en una proporción idéntica entre suero y glóbulos o células apropiadas, es decir tres gotas de suero para tres de glóbulos rojos. Proporción 1:1 Prepare los glóbulos que había dejado secos al 3 % en el nuevo LISS. Comience a incubar los tiempos previamente establecidos comenzando por el mayor es decir 15 minutos. Coloque tres gotitas de glóbulos apropiados a los tubos marcados D débil, Fya, Kell y AB C. Ind. Neg. Incube por 15 minutos a 37º C. Programe el timer en 15 min. Cuando el timer marque 12 min. 15 segundos reparta las tres gotas de glóbulos apropiados a los tubos marcados 12 minutos e incube a 37º C .Repita lo mismo para los tiempos 10 minutos, a los 10 min. 15 seg. y a los 8 min. 15 seg. para el tiempo 8 min. Nota: Para el suero AB sin anticuerpos puede usar cualquiera de los glóbulos preparados se realiza para descartar reacciones falsas positivas de nuestro reactivo. Al terminar los tiempos de incubación se realiza un test de AGH a todos los tubos es decir se lavan 4 veces con PBS y se les agregan dos gotas de AGH a cada tubo. Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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Lea y registre los resultados cuidadosamente discriminando el grado de aglutinación en cantidad de cruces. Valide los resultados negativos con células control AGH. Ejemplo

MEDIO Y TIEMPO DE REACCION

AGH COOMBS INDIRECTO ANTI-D

ANTI - Fya

ANTI - K

SUERO AB

LISS – 8

+/-

+/-

+/-

-

LISS - 10

+

+

+/-

-

LISS - 12

+

++

+

-

LISS - 15

+

++

+

-

AGH – 1 Hr

+

++

+

-

RESULTADOS El tiempo de incubación a elegir para el nuevo lote es el que muestre una aglutinación igual o superior a la lograda al incubar los mismos sueros por una hora a 37 C y terminados en AGH. El tiempo óptimo en el ejemplo es de 12 minutos. Se selecciona el tiempo menor donde la reacción es igual a la obtenida en AGH en incubación 1 hora.

MEDIO Y TIEMPO DE REACCIÓN

AGH COOMBS INDIRECTO ANTI-D

ANTI - Fya

ANTI - K

SUERO AB

LISS – 8 LISS - 10 LISS - 12 LISS - 15 AGH – 1 Hr

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TÉCNICA DEL POLIBRENE El Polibrene al igual que el LISS y el PEG incrementan la reactividad de los anticuerpos y abrevian la incubación. El Polibreno es un polímero de amonio cuaternario catiónico de baja potencia iónica, que es capaz de interactuar con las cargas negativas de los glóbulos rojos sensibilizados con anticuerpos del suero y producir su agregación irreversible. Se incuban los glóbulos rojos con suero en un medio de baja fuerza iónica que facilita la fijación de los anticuerpos y luego se añade polibreno, se centrifuga para lograr la agregación de los hematíes. Luego se resuspenden las células adicionando citrato de sodio. La aglutinación mediada por anticuerpos persistirá, pero las cedulas no recubiertas se dispersaran. Su principal utilidad es potenciar la reactividad antígeno-anticuerpo de algunos sistemas como el Rh, pero no del sistema Kell. Usos: Detección e identificación de anticuerpos Determinación de antígenos eritrocitarios. Muestra: suero o plasma Reactivos: Solución salina normal Medio de baja fuerza iónica o MBPI (dextrosa al 5%, EDTA disódico). Solución de trabajo: Polibreno al 0,05% de una solución madre al 10% preparando 0,5 ml de Polibreno + 99,5 ml de suero fisiológico Solución de resuspensión: citrato trisódico 0,2 M, dextrosa al 5% Antiglobulina Humana con Polibrene. Técnica 1. En un tubo Khan poner 0,1 ml de suero en estudio y una gota de glóbulos rojos resuspendidos 2-5% en PBS, además agregar 0,1 ml de MBPI 2. incubar a TA por 1 minuto 3. agregar 0,1 ml de Polibreno 0,05%. Mezclar y centrifugar. Eliminar sobrenadante, sin resuspender las células. 4. agregar 0,1 ml de solución de resuspensión 5. leer muestra en estudio junto con los controles + y – 6. informar en cruces 7. si desea continuar con AGH se deberá lavar 4 veces y agregarle el reactivo de Coombs.

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TECNICA ENZIMATICA PAPAÍNA EN DOS ETAPAS Es una técnica enzimática usada para el tratamiento de glóbulos rojos en situaciones en que en las técnicas de rutina no se ha podido identificar un anticuerpo. La papaína es una enzima proteolítica que acrecienta la reactividad de los antígenos contra los anticuerpos. Reactivos . - Papaína al 0.1%. - Glóbulos rojos concentrados, lavados 2 veces en PBS. - Buffer fosfato salino (PBS). - Panoscreen Cells. Técnica Primera etapa 1. Diluir 10 veces la papaína stock para que quede a una concentración 0.1%. 2. Tomar un tubo kahn y poner un volumen de glóbulos (panoscreen cells) concentrados y lavados, con 4 volúmenes de papaína al 0.1 %. 3. Incubar por el tiempo determinado según la estandarización hecha a la papaína en uso, a 37°C. 4. lavar los glóbulos tratados 2 veces con PBS. 5. Preparar una suspensión de los glóbulos rojos al 3% en PBS. Estos pueden ser guardados a 4°C por 48 horas. Segunda etapa 1. Poner un volumen de los glóbulos al 3% con un volumen de suero a estudiar, en tubos Kahn numerados del 1 al 11. Incluir un tubo control de la técnica donde se use Control anti D a cualquiera de las células del panel papainizado que sea Rh positivo. Incubar 20 minutos a 37ºC. 2. centrifugar según tiempo de lectura estandarizada y leer suavemente en busca de aglutinación. 3. De ser negativo el resultado o muy débil se puede lavar 4 veces con PBS los tubos, y agregar suero de Coombs (siguiendo la técnica de Coombs indirecto), leer en busca de aglutinación. Preparación de un Stock de Papaína Reactivos -

Agua destilada. Papaína Sigma. Cisteína Sigma (como hidrocloruro). buffer sorensen.

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Técnica 1. Pesar 1 gr. de Papaína Sigma y poner en un vaso pp. 2. Pesar 0.44 gr de Cisteína Sigma y poner en el otro vaso pp. 3. Poner el gramo de papaína en el mortero y pulverizar, adicionando 50 ml de buffer sorensen. Preparación Buffer Sorensen. -

KH2PO4 2.2 grs. Na2HPO4 x 2 H2O 0.09 grs. Disolver en 100 ml aprox. De agua destilada. Ajustar pH a 5.4, y llevar a volumen final de 250 ml. Conservar refrigerado

4. Poner sobre un embudo Papel whatman sin que queden espacios entre el papel y el embudo. Poner el embudo en un matraz de aforo de 100ml. Filtrar la mezcla sin mover. 5. Disolver los 0.44 grs de cisteína en la solución de papaína filtrada. 6. Enrasar a 100 ml con buffer sorensen e incubar 60minutos a 37°C. 7. Envasar en tubos Eppendorf en alícuotas de 0.5 ml.

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BANCO DE SANGRE Y MEDICINA TRANSFUSIONAL

PUNCIÓN SANGRE VENOSA EN BANCO DE SANGRE Preparación del sitio de venupunción. Para la adecuada elección del sitio de punción, se debe inspeccionar ambos brazos, extrayendo la sangre finalmente, de una vena de la región antecubital de gran calibre y libre de lesiones cutáneas. El torniquete incrementa la prominencia venosa, también es útil que el donante abra y cierre su mano varias veces. Para preparar la piel, se utiliza una solución antiséptica yodada para desinfectar el sitio de punción de la vena, esta se debe secar completamente después de su aplicación o limpiar con una gasa estéril seca antes de la venopunción (revisar las recomendaciones del fabricante). El área preparada no se debe tocar con los dedos antes de la punción. Donantes sensibles al yodo, usar clorhexidina o Alcohol al 70%. Preparación de las bolsas de extracción de sangre. Para la correcta recolección de sangre, se debe utilizar bolsas de extracción aprobadas por la FDA, las cuales deben cumplir con requisitos de esterilidad y ser apirógenas. Las bolsas deben ser inspeccionadas en busca de cualquier defecto, tener fecha vigente y anticoagulante suficiente de aspecto claro y transparente. Si el envoltorio exterior de las bolsas estériles llega a estar húmedo estas no se deben utilizar.

Soluciones anticoagulantes-conservantes mg

Relación solución/sangre Vida útil días Citrato de sodio Ácido cítrico Dextrosa Fosfato de sodio monobásico Adenina

CPD

CP2D

CPDA-1

1,4 : 10 21 1.660 188 1.610 140 0

1,4 : 10 21 1.660 188 3.220 140 0

1,4 :10 35 1.660 188 2.010 140 17,3

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Venupunción Esta se debe realizar en una sala que sea cómoda, equipada y aireada. Debe ser realizada por personal capacitado, mediante una venopuntura única, con aguja de diámetro de 16 G desechable y estéril. Antes de romper el sello de la aguja de extracción debe estar pinzada la tubuladura que comunica con la bolsa (ASEGURA CIRCUITO CERRADO). Durante la extracción de la sangre es de suma importancia mezclarla con el anticoagulante (agitación mecánica o inversión manual de la bolsa). La recolección de la sangre debe tener un flujo continuo, se puede extraer en un tiempo que varía entre 8-10 minutos, aceptable hasta 15 minutos. Reacciones adversas a la donación: Si bien el procedimiento es bien tolerado por la mayoría de los donantes existe un número de personas que reaccionan inesperadamente a la donación de sangre, por lo que es necesario estar preparado para reconocer y atender a estos donantes. Por lo mismo se hace necesario que exista entrenamiento en Reanimación Cardio Pulmonar (RCP) y los elementos básicos para atender un paro cardiorrespiratorio, así como manejar la cadena de sobrevivencia de apoyo vital básico de la institución a que pertenece el banco de sangre.

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EXAMEN FÍSICO AL DONANTE DE SANGRE Introducción La selección del donante de sangre debe ser de forma obligatoria y se basa en un breve examen físico y en un historial clínico, que determina que la donación no sea perjudicial para el donante ni el receptor (Reacciones adversas). Examen Físico El examen físico considera además de la impresión general el control de peso, pulso periférico, presión arterial, temperatura y hemoglobina. Control de Peso Determinar peso exacto en los donantes que no sepan su peso o que al entrevistador le revista duda el peso aparente. Personas que pesen menos del mínimo son más propensas a experimentar efectos adversos (mareos, debilidad) ya que la donación representa una mayor proporción de su volumen sanguíneo. Materiales Pesa o balanza Valores de referencia Peso mínimo es 50 Kg. en mujeres y 55 Kg. en hombres, la extracción representa aproximado el 12% del volumen sanguíneo. Pulso Periférico Son los latidos que experimentan las arterias producto del bombeo de la sangre realizado por el corazón. Indica la frecuencia cardiaca, en otras palabras, el número de veces que el corazón late por minuto. Materiales Reloj con segundero. Valores de referencia 50-100 pulsaciones por minuto. Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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Presión Arterial La presión arterial representa la presión ejercida por la sangre contra la pared de las arterias. La presión arterial tiene dos componentes: La presión sistólica: Se refiere al efecto de presión que ejerce la sangre eyectada del corazón sobre la pared de los vasos. La presión diastólica: Se refiere al efecto de distensibilidad de la pared de las arterias, es decir el efecto de presión que ejerce la sangre sobre la pared del vaso. La presión de pulso es la diferencia entre la presión sistólica y la diastólica. La presión arterial varía en las personas a lo largo de las 24 horas. Los factores que influyen son las emociones, la actividad física, la presencia de dolor, estimulantes como el café, tabaco o algunas drogas, etc.

Materiales Esfigmomanómetro de mercurio Valores de referencia Sistólica 100-160 mm Hg. Diastólica 60-100 mm Hg. Valores fuera de los rangos normales son causa de exclusión.

Temperatura La temperatura axilar del donante no debe ser superior a 37° C. Temperaturas inferiores a lo normal, no suelen ser significativas. Valor de referencia No mayor a 37° C

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TÉCNICA DE DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA (Hb) Método del Sulfato de Cobre Principio Este método se basa en la gravedad específica de una solución de sulfato de cobre equivalente a la concentración de Hemoglobina de una gota de sangre analizada. La gota al caer es encapsulada en un saco de proteinato de cobre que preserva su peso específico durante 15 segundos; durante este tiempo la gota queda en suspensión, se va al fondo o queda suspendida en la solución, así la lectura se realiza dependiendo del límite fijado de la hemoglobina. Materiales Solución de CuSO4 densidad 1.053 ( Hb 12.5 gr./dl, varones) Solución de CuSO4 densidad 1.052 ( Hb 12 gr./dl, damas) Estas soluciones deben ser cambiadas diariamente o después de cada 25 determinaciones. HemoCue Celdilla capilar del HemoCue para calibrar Metodología El sitio de punción capilar debe limpiarse con una solución antiséptica y secarse con una gasa o algodón limpio. La piel debe ser puncionada firmemente, a un costado del dedo en su parte distal, con una lanceta estéril o con dispensador de lanceta. La primera gota de sangre se debe descartar.

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Para medir la hemoglobina, se debe desinfectar la yema de uno de los dedos del donante con alcohol 70%.

Puncionar rápida y suavemente la yema del dedo con una lanceta estéril. Con un algodón limpiar la primera gota de sangre. Tomar un poco de sangre en un capilar y dejar caer una gota en un vaso con sulfato de cobre a una altura de 2 cm del líquido.

En caso de tener lector automático, encender lector y calibrar. Con otra celdilla capilar de HemoCue tomar una gota de sangre del donante que cubriendo el círculo central del capilar o idealmente que este quede lleno.

Colocar en el lector de hemoglobina HemoCue y cerrar. El resultado aparecerá en la pantalla en unos segundos.

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Interpretación en sulfato de cobre La gota debe observarse por 15 segundos. Si la gota de sangre tiene un peso específico más alto que la solución, se irá al fondo dentro de los 15 segundos, por el contrario, la gota se quedara suspendida o subirá. Interpretación en HemoCue Hombres: > 12,5 g/dL Mujeres: > 12,0 g/dL Valores menores son causa de exclusión.

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INSTRUCTIVO PARA LA SELECCION DE UN DONANTE DE SANGRE 1.- INTRODUCCIÓN: La seguridad de la transfusión de sangre o de sus componentes comienza con la apropiada selección del donante. Para lograr este objetivo se dispone de una serie de preguntas (encuesta), las que formuladas durante una entrevista, la que debe ser realizada en un ambiente privado y que asegure la confidencialidad, permita obtener una correcta selección de los donantes. Enfatizando que este proceso tiene como objeto la protección de la salud del donante como también proteger la salud del receptor. La entrevista debe ser apoyada con folletos informativos acerca de las enfermedades que se transmiten por la sangre, de la seguridad de la extracción sanguínea, de la importancia de la donación de sangre y que entregue información que favorezca la autoexclusión de los individuos con conducta sexual de riesgo. Es necesario ofrecer al Donante en forma permanente un proceso seguro y controlado. La atención que se realiza al donante, consta de una entrevista, de un pequeño examen físico y del acto de donación de sangre, todo lo cual debe quedar registrado en un documento escrito. El registro de la atención del donante debe tener los siguientes datos: 1. La Fecha y hora de atención 2. La identificación del donante: Contiene la información necesaria para identificar con seguridad al donante, debiendo llenar con el máximo de precisión todos los datos. 3. Examen físico que documente el estado general del donante: Incluye peso, pulso, presión arterial, hematocrito y/o hemoglobina y aspecto general del donante. 4. La encuesta: Comprende una serie de preguntas específicas que tienen por objeto recoger una clara información del donante, para determinar si cumple o no con los requisitos exigidos por el Banco de Sangre. 5. El consentimiento informado escrito del donante: Todo donante debe firmar su consentimiento al procedimiento, y declarar que entiende las preguntas formuladas y que la información entregada es verdadera. 6. Tipo y causa de rechazo: debe registrarse la causa del rechazo y el tipo, si el donante no cumple con los requisitos exigidos para una donación de sangre segura. 7. Las características de la donación: debe registrarse el tipo de punción y la duración de la donación. Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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8. Reacciones adversas a la donación: Debe anotarse las características de cualquier reacción que presente el donante durante o después de la donación y su tratamiento. 9. Identificación del encuestador y flebotomista: El responsable debe anotar su nombre en el lugar correspondiente. El encuestador debe incentivar la donación voluntaria por lo tanto junto con dar los agradecimientos por la donación debe invitar al donante a ser donante voluntario altruista, y pedir el consentimiento para ser llamado a donar sangre en el futuro.

DONACION EN BANCO DE SANGRE GLOSARIO DE TERMINOS DONANTE POTENCIAL: Toda persona que acude al Banco de Sangre u otra unidad de recolección de sangre, con la intención de donar sangre completa o algún componente sanguíneo en particular. DONANTE VOLUNTARIO : Toda persona que dona sangre o algún componente sanguíneo en forma voluntaria, altruista, no remunerada repetida en el tiempo y está libre de patógenos trasmitidos por la sangre y no presenta conducta de riesgo. DONANTE POR REPOSICION O RELACIONADO: Toda persona que aún cumpliendo con los requisitos anteriores dona sangre destinada a reponer transfusiones efectuadas a pacientes o potencialmente en situaciones específicas como futura cirugía. DONANTE ACEPTADO: Toda persona que acude a donar sangre o algún componente sanguíneo y que cumple con los requisitos establecidos por el, Banco de Sangre o Centro de Donación. DONANTE RECHAZADO: Todo donante potencial, que no cumple con los requisitos establecidos por el Banco de Sangre y Centro de Donación. EL RECHAZO PUEDE SER TEMPORAL O DEFINITIVO RECHAZO TEMPORAL: Aquél que no cumple con susceptible de hacerlo en plazos definidos por la causalidad

los

requisitos establecidos pero

RECHAZO DEFINITIVO: Aquél que no cumple con los requisitos establecidos y no susceptible de alcanzarlos en el tiempo. DONACION EFECTIVA: Procedimiento que logró la Sangría; en donante aceptado en el tiempo - en volumen (peso) en calidad adecuada, obteniendo una bolsa de Sangre o de un Hemocomponente en particular, susceptible de ser fraccionada o transfundida.

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DONACION FRUSTRA: Procedimiento que no logró ser efectivo por dificultad en acceso venoso, dificultad en la Sangría, Reacción Adversa a la donación o por problema técnico, incluyendo fallas en las bolsas. Si la causa es motivada por prolongación en el tiempo de la Sangría, se le denomina donación lenta. UNIDAD O BOLSA FRACCIONABLE: Es toda bolsa de recolección de sangre completa, que cumple con los requisitos de calidad volumen/peso ; aspecto ; ausencia de coágulos, etc. susceptible de ser fraccionada mediante procedimientos específicos para cada hemocomponente. UNIDAD O BOLSA POR AFÉRESIS : Es toda unidad o bolsa colectada mediante máquina de aféresis, que contiene un hemocomponente programado, específico y obtenida de donante previamente seleccionado, y susceptible de ser transfundida. REACCION ADVERSA A LA DONACIÓN FISICA/MENTAL : Es toda Reacción negativa, que se presenta en el donante, durante cualquier etapa del procedimiento y que puede también producirse durante o post donación. En este último caso la relación causa efecto dependerá de la patogenia de la Reacción Adversa. DONANTE AUTOEXCLUIDO: Persona que acudiendo al Banco de Sangre con el fin de donar sangre se autoexcluye sin necesidad de precisar causa en cualquier etapa. AUTOEXCLUSION PRE DONACION: La autoexclusión ocurre en la pre selección o durante la selección. AUTOEXCLUSION POST DONACION: Aquél que por cualquier medio verbal - por escrito, en documento Autoexclusión - teléfono Mail - carta correo etc. indica al centro colector que su sangre o hemocomponente no debe ser ocupada para transfusión. DONANTE PARA AUTOTRANSFUSION: Es toda persona sana o enferma, en condiciones de someterse al procedimiento de Sangría, que dona en forma autodirigida (Donante / Receptor) y requiere cumplir los requisitos que el centro de colección determine.

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2.- NORMAS PARA EL LLENADO DE LA ENCUESTA:

a) Quién: El personal profesional capacitado responsable de la sección . b) Cómo: Preguntando al donante uno a uno los aspectos que contiene la encuesta, recogiendo la información pertinente, teniendo presente la importancia de explicar en términos simples cada punto y de ganar la confianza del donante para lograr respuestas verdaderas. Dar las facilidades para la autoexclusión. c) Cuándo: Una vez que el posible donante ha leído la información acerca de las enfermedades de transmisión sanguínea, del procedimiento de la extracción y ha decidido no autoexcluirse

3.- NORMAS DE SELECCION DEL DONANTE:

a) El donante será entrevistado por un profesional capacitado . b) Se evaluará la información recogida, determinando la aceptación o rechazo del posible donante. c) En caso de rechazo se explicará al donante en la forma más clara y completa posible, si la causa es definitiva o transitoria, se darán las recomendaciones pertinentes, verificando que el donante ha comprendido la situación, y se registrará detalladamente dicha causa en la ficha del donante. d) Si no hay motivos de rechazo, se someterá a un examen físico dirigido a revisar especialmente las zonas de punción y a la toma de signos vitales. La piel de la zona de venopunción en ambos brazos no debe presentar lesiones o signos que indiquen que es adicto a drogas endovenosas. Lesiones poco importantes como Dermatitis y Sarna serán causa de rechazo temporal.

4.- CRITERIOS DE SELECCIÓN:

1.- EDAD: - 18 a 65 años. Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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- La excepción debe ser avalada por un médico. - Si se trata de una primera donación, la edad máxima será de 60 años.

2.- PESO: -Mínimo 50 kilos. Los donantes que pesan 50 Kg o más, pueden donar 450+/- 45 ml de sangre ya que tienen una volemia aproximada de 3750 ml, y por lo tanto la extracción representa más o menos el 12% del volumen sanguíneo, es importante que las muestras para los test pretransfusionales del donante, no deben exceder los 30 ml. La obtención de más del 15% de la volemia en un donante de 50 Kg puede significar una mayor frecuencia de reacciones adversas.

3.- PRESION ARTERIAL:

-Sistólica: 100 - 160 -Diastólica: 60 - 100

4.- PULSO: -

Entre 50 y 100 pulsaciones por minuto, regular y palpado a lo menos por 30 segundos.

5.- HEMOGLOBINA:

12.5 gr/dl en hombre 12.0 gr/dl en mujeres

6.- HEMATOCRITO:

38% en hombres 36% en mujeres

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7.- PREGUNTAS DE LA ENCUESTA:

1.- ¿ Se siente Ud. bien hoy y goza de buena salud?

Dirigida a detectar cualquier patología o antecedentes que no estén cubiertos por las preguntas de la encuesta y que pudieran causar daño ya sea al donante o al receptor. El donante debe tener un aspecto saludable, sin síntomas o signos de intoxicación por alcohol o drogas. Donantes bajo la influencia del alcohol, deben rechazarse transitoriamente hasta cumplir 12 horas sin ingesta de alcohol, debido a que generalmente no es posible obtener antecedentes clínicos fidedignos, la donación además puede ser dañina para el propio donante. Preguntar sobre antecedentes de alcoholismo crónico, daño hepático crónico, hemorragias digestivas etc. Si existen estos antecedentes, rechazar en forma definitiva al donante. Una pequeña cantidad de alcohol ingerida recientemente, en especial durante las comidas, no es causa de rechazo ya que en ese caso no existe riesgo para donante ni receptor. Pregunta adicional: a.- Ayuno de más de 6 horas, en cuyo caso debe rechazarse temporalmente al donante hasta que ingiera algún alimento.

2.- ¿Ha donado sangre alguna vez, cuando, donde?: Dirigida a tener antecedentes sobre el lugar, fecha, de donaciones previas, con el objeto de proteger tanto al donante como al receptor.

SI:

Se acepta solo si su donación fue hace más de 3 meses. Si tiene acceso a antecedentes previos del donante, estos deben estar de acuerdo con los requisitos de cualquier donante.

NO:

Se acepta.

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3.- ¿Ha sido rechazado alguna vez como donante de sangre? ¿por qué? Dirigida a conocer alguna causa temporal o definitiva que lo inhabilite como donante. Enfatizar acerca del conocimiento de resultados alterados de exámenes realizados a su sangre. Rechazar todo donante con antecedentes de exámenes positivos para : Hepatitis, Chagas, Sida, HTLV-I. En caso de Sífilis dependerá si hubo tratamiento, aceptándolo si existió y fue dado de alta hace un año por lo menos. Evaluar si el rechazo anterior fue por una causa definitiva o transitoria, en este último caso, el donante se acepta si el plazo determinado se ha cumplido.

SI:

Preguntar la causa y verificar si es causal o no de rechazo.

NO:

Se acepta como donante.

4.- ¿Tuvo algún problema con la donación?: Dirigida a detectar alteraciones o problemas en donaciones previas. Debe quedar registrada las características de la reacción adversa a la donación.

SI: Debe rechazarse todo aquel que haya presentado complicaciones mayores como vómitos, palpitaciones, desmayo, etc. NO:

Se acepta como donante.

5.- ¿Ha consultado por problemas de salud en los últimos 12 meses?: Dirigida a detectar patologías que lo inhabiliten como donante. a) Enfermedades Cardiovasculares: Se rechazan: Cardiopatías con insuficiencia cardíaca, Enfermedad reumática en tratamiento y Enfermedad coronaria (angina, infarto), por la posibilidad de una nueva crisis. b) Diabetes: Se rechaza quienes están bajo tratamiento con medicamentos normoglicemiantes. Se aceptan los que controlan su diabetes sólo con régimen.

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c) Hipertensión: Se rechaza aquellos que estén en tratamiento. En caso de detectar valores de presión fuera de los rangos establecidos, se debe esperar 15 minutos y volver a tomar la presión con el donante acostado. d) Enfermedades Gastrointestinales: Se rechaza las diarreas agudas o crónicas reactivadas. Se aceptan donantes con antecedentes de úlcera péptica asintomáticos y sin tratamientos. Otras patologías como pólipos rectales o hemorroides, pueden ser aceptados como donantes si en el momento del interrogatorio están asintomáticos y sin tratamiento médico. e) Enfermedades Respiratorias: Se rechaza las enfermedades broncopulmonares activas, Tuberculosis activa. Cuadros respiratorios agudos se rechazan hasta su curación. Se acepta a las personas que han padecido tuberculosis y que después de 1 año de haber cumplido el tratamiento y dado de alta. Resfríos activos se rechazan transitoriamente. f)

Cáncer: Se rechaza. Se aceptará solo con autorización médica, después de 5 años sin tratamiento.

g) Enfermedades Hematológicas: Se rechaza si ha presentado anemia crónica o enfermedades oncohematológicas como Linfomas, Leucemia, etc. h) Enfermedades Inmunológicas no alérgicas: Se rechaza en forma definitiva a quienes presenten enfermedades tales como: Lupus Eritematoso Sistémico, Artritis Reumatoídea, Enfermedad Mixta del Tejido Conectivo, Esclerodermia. i)

Enfermedades Endocrinológicas: Se rechaza en forma definitiva como donante a las personas que sufran endocrinopatías activas y las que han recibido hormona del crecimiento de origen humano.

j)

Enfermedades Hepáticas: Hepatitis ver pregunta Nº 15 Se rechaza en forma definitiva a quienes sufran Hepatopatías (cirrosis hepática).

k) Malaria: Se rechaza por un período de 3 años a quienes hayan sufrido de Malaria, tomado drogas antimaláricas, o quienes han vivido en países endémicos. l)

Piel: Se rechaza a quienes presenten lesiones en la piel especialmente en las áreas de punción venosa o vecinas. Lesiones poco importantes como dermatitis y sarna serán causa de rechazo temporal.

m) Enfermedades Renales: Se rechaza personas con enfermedades crónicas. Se rechazan por 2 meses las pielonefritis aguda. No se rechaza personas con antecedentes de cálculos renales (Litiasis). n) Retraso mental: Se rechaza en forma definitiva por no tener discriminación y por pertenecer a grupo de riesgo de enfermedades de transmisión sexual. Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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o) Sífilis y Gonorrea: Se rechaza por un período de 12 meses, ya que pudieran asociarse con transmisión de VIH.

6.- ¿Ha sido sometido a operaciones en los últimos 12 meses? NO:

Acepte al donante

SI:

Se rechaza toda cirugía por 12 meses. Se acepta solamente cirugía menor localizada a nivel de piel.

7.- ¿Ha recibido transfusiones en los últimos 12 meses?

NO:

Acepte al donante.

SI: Se rechaza hasta cumplir 12 meses desde el momento de la transfusión. Consultar la causa de la transfusión y registrarla en la hoja de encuesta, sección observaciones.

8.-¿Ha tenido sangramiento dentario, digestivo, y/o ginecológico?

NO:

Acepte al donante.

SI:

Consultar causa, frecuencia y temporalidad. Se rechaza si es frecuente, importante y

activo.

9.-¿Ha tenido convulsiones, desmayos o sufre de epilepsia? Dirigido a detectar personas que hayan sufrido desmayos frente a estímulos banales (stress, extracción de sangre, etc.), durante su vida adulta, o que estén en tratamiento por epilepsia.

NO:

Acepte al donante.

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SI:

Se rechaza si ha presentado desmayos frente a estímulos banales (stress, extracción de sangre, etc.). Se acepta si ha cumplido 3 años sin tratamiento para la epilepsia.

10.- ¿ Ha tomado aspirina o antinflamatorios en los últimos 3 días? La aspirina y productos que la contengan (Ewin, Mejoral, Gluspirin, Cafiaspirina, Cardioaspirina etc.), inhiben la actividad plaquetaria durante 1 a 3 días. La sangre de donantes que estén ingiriendo estos medicamentos hasta 3 días antes de la donación, no debe ser utilizada para preparar concentrados plaquetarios. Lo mismo se aplica para aquellos que tomaron Piroxicam o similares.(antinflamatorio) SI:

Se acepta como donante, rotulando la bolsa "NO PREPARAR PLAQUETAS".

NO:

Se acepta como donante.

11.- ¿Ha tomado algún medicamento en el último tiempo? ¿Cuál? En general los medicamentos que toma un donante no son perjudiciales para el receptor. Pueden ser aceptados como donantes la mayoría de las personas que toman medicamentos, incluso los que lo hacen por indicación médica. Normalmente el rechazo debido a la ingesta de algún medicamento no se debe a las propiedades de este sino a las características de la enfermedad que justifica su administración. Debe quedar registrado el medicamento que tomó el donante y cuando.

NO:

Se acepta como donante.

SI:

Preguntar cual y en que dosis. No son causa de rechazo: Anticonceptivos orales, analgésicos comunes, vitaminas, sustitutos hormonales y pastillas para adelgazar.

La aspirina y productos que la contengan (Ewin, Mejoral, Gluspirin, Cardioaspirina etc.), inhiben la actividad plaquetaria durante 1 a 3 días. La sangre de donantes que estén ingiriendo estos medicamentos hasta 5 días antes de la donación, no debe ser utilizada para preparar concentrados plaquetarios. Lo mismo se aplica para aquellos que tomaron Piroxicam. Se rechazan personas con antecedentes de ingestión reciente (1 semana atrás) o actual de los siguientes medicamentos: Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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 Antibióticos  Antihistamínicos  Corticoides  Neurolépticos (Antipsicóticos y tranquilizantes mayores)  Antiepilépticos - anticonvulsivantes.

12.- ¿Tiene alguna enfermedad crónica? Dirigida a detectar patologías que lo inhabiliten como donante.

NO:

Se acepta como donante.

SI:

Analizar si es o no causal de rechazo, en caso positivo, explicarle que nunca debe donar sangre y por qué.

13.- ¿Ha sufrido perdida inexplicable de peso? El peso es el parámetro biomédico de gran importancia. En el adulto tiende a mantenerse estable en el tiempo. La ganancia de peso por sobre los valores normales para estatura y sexo se definen como obesidad. La pérdida de peso inexplicada (4 - 5 kg y más en los últimos meses sin causa aparente) puede constituir un elemento de juicio médico indicador de enfermedad crónica como: cáncer, SIDA, TBC, hipertiroidismo, anorexia psicógena, etc. Por lo tanto, constituye motivo de rechazo como donante de sangre. Hace excepción la baja de peso motivada por régimen, asistida por médico. NO:

Se acepta como donante.

SI:

Analizar si es o no causal de rechazo, en caso positivo, explicarle las razones, y sugerirle que consulte un médico

14.- ¿ Ha tenido diarrea en los últimos 10 días?

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La diarrea es a menudo, un signo de infección del aparato digestivo, especialmente de su segmento intestinal. En este caso puede ser motivado por bacterias, virus, parásitos, hongos. Como estas infecciones pueden traspasar la barrera intestinal y pasar a la sangre constituyendo "bacteremias", "viremias". Al momento de la entrevista, al no poder hacer diagnóstico diferencial, con aquellas infecciones que no lo hacen, ni tampoco con diarreas de causa no infecciosa (como la secundaria a colon irritable) se debe rechazar como donante.

NO:

Se acepta como donante.

SI:

Se rechaza en forma transitoria hasta que cumpla 10 días del último episodio. Sugerirle que consulte un médico

15.- .- ¿Ha recibido hormona de crecimiento de origen humano? Esta pregunta está enfocada a prevenir la transmisión de la enfermedad de CreutzfeldtJacob, una alteración rara, degenerativa y fatal del sistema nervioso. No se ha demostrado aún la transmisión de la enfermedad por la transfusión sanguínea, sin embargo, no hay test para detectar la enfermedad, por lo tanto, se recomienda que no donen sangre aquellas personas que han recibido hormona del crecimiento de origen humano, Hormona Pituitaria de origen humano o injertos de duramadre o quienes tienen algún familiar que padezca de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob.

NO:

Se acepta como donante.

SI:

Se rechaza en forma definitiva si la hormona recibida es de origen humano o con historial familiar de la Enfermedad de Creutzfeldt-Jacob.

16.- ¿Ha viajado fuera del país en los últimos 3 años? ¿Dónde? Esta pregunta está enfocada a prevenir la transmisión de enfermedades parasitarias y otras tales como la malaria, Babeiosis, y otras infecciones como el Dengue. Las personas deben detallar su estadía en las zonas endémicas para ser diferidas temporal o definitivamente. La Historia de Babesiosis, Dengue es causal de rechazo definitivo. NO: SI:

Se acepta como donante Se evalúa la condición de diferido o rechazado.

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Para la malaria , se recomienda que aquellos que la han tenido, deben ser diferidos por tres años desde que se vuelven asintomáticos, diferir por un año a aquellos que han estado en alguna zona endémica para malaria (ver anexo zonas endémicas), y diferir por tres años a aquellos que han vivido en una zona endémica. Exposición al riesgo con o sin profilaxis, rechazar por 3 años

17.- Ha estado privado de libertad en los últimos 12 meses? Los individuos que han estado en una institución correccional (cárcel o prisión), por más de 72 hrs. consecutivas, se rechazan como donantes por 12 meses desde la fecha de última detención, por riesgo sexual y/o drogas.

18.- ¿Ha sido vacunado en los últimos 12 meses? Dirigida a detectar patologías que lo inhabiliten como donante.

NO:

Se acepta como donante.

SI:

Analizar si es o no causal de rechazo, en caso positivo, explicarle si es definitivo o transitorio.

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TIPO VACUNA

VACUNA

Agentes Vivos Atenuados

BCG

PERIODO DE RECHAZO

FIEBRE AMARILLA PAPERA

2 – 3 SEMANAS

POLIO ORAL (SABIN) SARAMPION Agentes Vivos Atenuados

RUBEOLA VARICELA ZOSTER

Agentes Muertos , Toxoides

4 SEMANAS

DIFTERIA TIFOIDEA TIFUS

Aceptar si el donante no presenta síntomas como malestar y fiebre

PARATIFOIDEA TETANOS COLERA COQUELUCHE INFLUENZA

HEPATITIS B

ANTIGENO RECOMBINANTE

POLIO (SALK) DIFTERIA

Anticuerpos

RABIA

1 AÑO

INMUNOGLOBULINAS:



PROFILACTICA: NO se rechaza

HEPATITIS B:



EXPOSICIÓN AL VIRUS Rechazo por 1 año.

ANTI-TETANOS:



Rechazo por 4 semanas

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19.- ¿Está Ud. embarazada, ha tenido parto o aborto en los últimos 6 meses? Mujeres embarazadas y que han tenido parto o aborto en los últimos 6 meses, no deben donar sangre debido a los altos requerimientos de fierro en éste período. Excepciones a esta regla deben ser hechas por el médico del Banco de Sangre. NO:

Se acepta como donante.

SI:

Se rechaza transitoriamente.

20.- ¿Ha tenido hepatitis después de los 12 años? Dirigida a detectar antecedentes de hepatitis viral. Es necesario en algunos casos explicar el término hepatitis en base a "ponerse amarillo". NO:

Se acepta al donante.

SI:

Se rechaza. Debe instruírsele en que nunca puede ser un donante de sangre. Solo se acepta un donante que refiere ictericia de causa obstructiva comprobada. Si documenta una hepatitis de tipo A, puede ser aceptado como donante.

21.- ¿Ha tenido relaciones sexuales con personas con hepatitis, dializados o politransfundidos, en los últimos 12 meses? Dirigida a identificar pacientes que pueden estar en fase de incubación de Hepatitis. Aunque el período de incubación es generalmente menor de 6 meses, debe rechazarse hasta 12 meses después de la última exposición. Personal de salud no se considera grupo de riesgo, a menos que haya sufrido accidentes corto-punzantes con material presuntamente contaminado, en cuyo caso debe rechazarse por 12 meses. NO:

Se acepta

SI:

Donantes con antecedentes de este tipo de contacto se rechazan por 12 meses.

22.-¿Usted o su pareja, se han inyectado drogas por vía de piel o venas? Dirigido a detectar personas que están en riesgo de infección por VIH y otras enfermedades infecciosas que podrían ser transmitidas al receptor de productos sanguíneos. Averiguar el tipo de droga, el período en que se consumió, rechazar en forma Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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permanente si es drogadicto crónico, drogadicto endovenosos, o si ha tenido conductas de riesgo en los últimos 12 meses, producto de su drogadicción.. NO:

Se acepta como donante

SI:

Se rechaza en forma definitiva.

23.- ¿Se ha hecho tatuajes, sometido a acupuntura o realizado perforaciones en el cuerpo en los últimos 12 meses? Dirigida también a la identificación de personas que pueden estar en fase de incubación de hepatitis u otra enfermedad de transmisión sanguínea. En caso de personal de salud pregunte sobre algún accidente como corte o punción que haya sufrido en los últimos 12 meses, en cuyo caso debe rechazarse por igual período. NO:

Se acepta al donante.

SI:

Tatuajes: se rechaza por un período de 12 meses. Acupuntura y perforación auricular: se rechaza por un período de 12 meses. NOTA: Preguntar sobre tratamientos inyectables con material no desechable ya que sería causal de rechazo por 12 meses.

24.-Si es hombre. ¿Ha tenido relaciones sexuales con otros hombres? Dirigido a detectar personas que están en riesgo de infección por VIH y otras enfermedades infecciosas que podrían ser transmitidas al receptor de productos sanguíneos. NOTA: Algunas personas pueden desear dar otro tipo de explicación a sus acompañantes por haber sido rechazados en cuyo caso podrá ofrecerse respuestas factibles de ser utilizadas: resfrío, presión arterial elevada, etc.

NO:

Se acepta

SI:

Se rechaza en forma definitiva.

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25.- ¿Ha tenido relaciones sexuales con prostitutos/as, drogadictos o personas privadas de libertad? Dirigido a detectar personas que están en riesgo de infección por VIH y otras enfermedades infecciosas que podrían ser transmitidas al receptor de productos sanguíneos. NO:

Se acepta como donante

SI:

Se rechaza en forma definitiva.

26.- ¿Ha tenido relaciones sexuales con más de una persona en los últimos 12 meses? Dirigido a detectar personas que están en riesgo de infección por VIH y otras enfermedades infecciosas que podrían ser transmitidas al receptor de productos sanguíneos. NO:

Se acepta como donante

SI:

Evaluar el riesgo real , y la promiscuidad de la conducta sexual. Si es el caso, rechazar por 12 meses.

27- ¿Usted quiere donar sangre para hacerse el examen del SIDA? Si es así consultar el porqué y enviarlo a los consultorios de CONASIDA en que lo hacen en forma gratuita. NO:

Se acepta como donante

SI:

Rechazarlo como donante

28.- ¿Ha sido trabajador sexual, o ha aceptado dinero o drogas por sexo? Dirigido a detectar personas que están en riesgo de infección por VIH y otras enfermedades infecciosas que podrían ser transmitidas al receptor de productos sanguíneos.

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NO:

Se acepta como donante

SI:

Rechazar en forma definitiva.

29.- ¿Viene a donar sangre por dinero? Dirigida a detectar donantes pagados. Explicar en forma clara y precisa la inconveniencia de la donación pagada. Asegurarse que el donante comprendió el concepto. Se le otorga al donante la oportunidad de aclarar sus motivaciones para donar sangre. NO:

Se acepta como donante

SI:

Rechazarlo en forma transitoria, asegurándose que él comprendió el concepto.

NOTA: Cualquier duda que se presente frente a las respuestas entregadas por un donante, que signifique aplicar un criterio diferente al escrito en este instructivo, o aparezcan aspectos no consignados en él, deben ser consultados al médico Jefe del Banco de Sangre.

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MEDICAMENTOS DISPONIBLES EN CHILE QUE PUEDEN AFECTAR LA AGREGACIÓN PLAQUETARIA  Ac Acetilsalicilico

Lertus (diclofenaco)

 Action (piroxican)

Meclomen ( ac meclofenamico)

 Adona (ibuprofeno)

Merpal (diclofenaco)

 Alka- Seltzen (aspirina)

Midol (ibuprofeno)

 Algipres (ketorolaco)

Mitrotil (tenoxicam)

 Artren (diclofenaco)

Mobex (meloxicam)

 Aspirina efervescente

Motrim (ibuprofeno)

 Aspirina

Moviflex ( indometacina)

 Astodol (ibuprofeno)

Naprosym ( naproxeno)

 Antigripales Maver (ac. acetilsalicilico)

Naproxeno

 Bioflan (tenoxicam)

Naproxeno Sodico

 Bodil (ibuprofeno)

Niofen (Ibuprofeno)

 Bladex (ibuprofeno)

Notagol (piroxican)

 Brevedol (diclofenaco)

Pediaprofen ( ibuprofeno)

 Brexicam (piroxican)

Pemar (piroxican)

 Burten (ketorolaco)

Pevoran ( diclofenaco)

 Butartrol (ibuprofeno)

Pirexyl ( sup.diclofenaco)

 Cafiaspirina (ac acetilsalicilico)

Piroflan (diclofenaco )

 Cardioaspirina (ac acetilsalicilico)

Pironal (ibuprofeno )

 Cataflan (diclofenaco)

Piroxicam

 Desinflan (tenoxicam)

Profenil (ketoprofeno)

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 Diclofenaco

Propalgin (piroxican)

 Diclofenaco Sodico

Recaflex (tenoxican)

 Dignofenac

Sicadol (ac mefenamico)

 Diclotaren (diclofenaco sodico)

Silartrin (ibuprofeno )

 Diclotaren-R ( diclofenaco sodico)

Sipirax (diclofenaco )

 Dolgenal (Ketorolaco trometanol)

Syndol (ketorolaco trometanol)

 Dolmix (ibuprofeno)

Talflex (ketoprofeno)

 Dolofar ( ketoprofeno)

Templadol (ac mefenamico)

 Dolo-Ketazon (ketoprofeno)

Tenoxicam

 Dolonase (ibuprofeno)

Tepronac (piroxican )

 Dolo-octirona (ibuprofeno)

Texicam DU (tenoxicam )

 Ecotrin 100 (ac. acetilsalicilico)

Trigesico ( ac acetilsalicilico)

 Ecotrin 325 ( ac acetilsalicilico)

Turbogesic (diclofenaco potasico)

 Efexicam ( tenoxicam)

Veradin ( ac acetilsalicilico)

 Ewin (ac acetil salicilico)

Voltaren ( diclofenaco sodico)

 fabudol (piroxican)

Zadetin (ketotifeno )

 Facitor ( ac acetilsalicilico)

Zolimin (tenoxicam)

 Fastum (ketoprofeno)  Feldene ( piroxican)  Felis ( tenoxicam)  Flexono ( indometacina)  Foldox ( piroxican)  Hassapirin ( ac acetilsalicilico)  IBU-2 (ibuprofeno) Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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 IBU-4

“

 IBU-6

“

 Ibupirac “  Ibuprofeno  Indometacina  Ketoprofeno  Ketorolaco  Ketorolaco trometadol  Ketotisin (ketorolaco)  Kin (ibuprofeno)

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MEDICAMENTOS CONTRAINDICADOS PARA DONAR SANGRE Si el donante de sangre a estado tomando o alguna vez ha tomado uno de los medicamentos que a continuación se señalan deben diferirse como donante de sangre. 

Proscar© (finasteride)  Tratamiento del agrandamiento prostático



Avodart© (dutasteride)  Tratamiento del agrandamiento prostático



Propecia© (finasteride)  Tratamiento para la calvicie



Accutane© (Amnesteem, Claravis, Sotret, isotretinoin)  Tratamiento para el acné severo



Soriatane© (acitretin) – Tratamiento para la soriasis severa



Tegison© (etretinate) – Tratamiento para la soriasis severa



Hormona del crecimiento de la gládula pituitaria  Utilizada sólo hasta 1985 en niños con retardo en el crecimiento



Insulina Bovina (Bovine, or Beef, Insulin)  Usada en el tratamiento para la diabetes



Inmunoglobulina contra la Hepatitis B – Utilizada en los que pudieron estar expuestos a la Hepatitis B NOTE: Esta es diferente a la vacuna, que es preventiva y que se da en tres dosis en un período de seis meses.



Vacunas no licenciadas – Usualmente asociadas con protocolos de investigación



Si el donante está tomando Proscar, Avodart, Propecia, Accutane, Soriatane, or Tegison, debe saber que estas drogas pueden causar malformaciones, la sangre donada a una embarazada podría contener suficiente para causar daño al feto. Debe diferirse por un mes después de la última dosis.



Hormona del crecimiento de la glándula pituitaria . Se difiere en forma permanente, riesgo a contraer Creutzfeldt-Jakob Disease (CJD, for short).

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

Insulina Bovina (Bovine, or Beef, Insulin), Esta insulina proviene de países que tienen el mal de las vacas locas, y por tanto puede estar infectada por los agentes causales de la enfermedad. Se difiere en forma permanente.



Hepatitis B Immune Globulin (HBIG) Riesgo a exposición de personas que han sufrido de hepatitis B. Diferir por 12 meses.



Vacunas no licenciadas Diferir por al menos un año, a no ser que el médico jefe del servicio diga lo contrario.

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RECONOCIMIENTO Y MANEJO INICIAL DE LAS REACCIONES ADVERSAS A LA DONACION INTRODUCCIÓN: Las reacciones adversas a la donación de sangre ocurren en aproximadamente un 4% de los donantes. Los más propensos a las reacciones son los más jóvenes, aquellos que donan por primera vez, los que antes de la donación tienen un pulso alto, y aquellos con una presión arterial baja. También tienen importancia los factores ambientales, la experiencia del personal que realiza la flebotomía, las características del local (lleno, caluroso), el tiempo de espera, y el estado anímico del donante. Las complicaciones se previenen con un personal amable, que transmita confianza y con una buena técnica de punción venosa. Se clasifican en tres grupos principales Efectos vasovagales Síncope Bradicardia Diaforesis Palidez Mareos Náuseas Convulsiones Tetania Venipuntura

Dermatitis local

Hematoma Punción arterial Daño del nervio Infección local Tromboflebitis superficial Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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El sindrome vasovagal o fatiga es la complicación más frecuente. Es provocado por motivos sicológicos o neurofisiológicos, pueden ser causados por la visión de la sangre, por ver a otros donando o por motivos inexplicados. Se caracterizan por sensación de debilidad general, sudoración, palidez, mareos, pudiendo llegar a pérdida de conciencia, convulsiones y relajación de esfínteres. La piel es pálida y sudorosa, el pulso disminuye en amplitud y frecuencia, lo que ayuda a distinguir las reacciones vasovagales de las hipovolémicas en las que es frecuente encontrar taquicardia. El estado ansioso puede producir hiperventilación que causa una disminución del C02 sanguíneo que puede llevar a una alcalosis respiratoria y a tetania.

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MANEJO DE LAS REACCIONES ADVERSAS A LA DONACION DE SANGRE Medidas generales

•

Tranquilizar al donante

•

Aislar la persona de los otros donantes

•

Solicitar ayuda si el cuadro no cede con las medidas específicas, es muy intenso o se prolonga en el tiempo.

•

Soltar la ligadura y retirar la aguja

Desmayos

•

Levantar las piernas

•

Soltar la ropa apretada (cinturones, corbatas, etc.,)

•

Mantener vía aérea permeable

•

Monitoreo de pulso y presión arterial

•

Si el cuadro aparece durante la donación, ésta se debe suspender.

•

Mantener al donante en la camilla o sillón hasta la recuperación de la conciencia y normalización de los signos vitales

Náuseas y vómitos

•

Colocar al donante en posición confortable y rotar la cabeza hacia un lado

•

Instruirlo para que respire lento y profundo

•

Proveer al donante de un recipiente para que vomite y toallas desechables

Espasmos musculares y calambres

•

Se producen por hiperventilación causada por estado ansioso

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•

Pueden ocurrir en la cara, en los brazos y en las manos

•

El personal, al observar a un donante ansioso, debe tranquilizarlo, desviando su atención a través de la conversación, y así disminuir la hiperventilación.

•

Si no cede se puede usar una bolsa de papel para que respire en ella

Hematoma

•

Puede ocurrir durante o después de la flebotomía

•

Remover la ligadura, sacar la aguja e intentar vaciar el hematoma por medios mecánicos

•

Colocar parches de gasa estéril sobre la zona de punción y presionar firmemente durante 7 a 10 minutos, manteniendo el brazo elevado sobre el nivel del corazón

Punción arterial.

•

Se debe sospechar punción arterial si el llenado de la bolsa es muy rápido, si la sangre es muy roja.

•

Se debe retirar la aguja, presionar firmemente por 10 minutos la zona de punción , controlar el pulso arterial, y si este es ausente, avisar al jefe del Banco de Sangre o al médico de urgencia en su ausencia.

Convulsiones

•

Pedir ayuda inmediatamente y prevenir que el donante se golpee.

•

Mantenerlo en el sillón de donación y si no es posible por la fuerza que desarrolla, colocarlo en el suelo evitando que se golpee. 

Mantener vía aérea permeable, avisar al médico del Banco de Sangre o al médico de urgencia en su ausencia.

Ante cualquier reacción que no ceda en pocos minutos o que sea muy intensa se debe avisar al médico del Banco de Sangre. En su ausencia, se avisará o se referirá al médico residente o de urgencia.

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Todas las reacciones adversas a la donación deben ser registradas en la ficha del donante, con una indicación clara si la persona es o no apto para una próxima donación. La mantención de stock de medicamentos para tratar las reacciones adversas a la donación será definida por el médico jefe del Banco de Sangre, así como las personas autorizadas para administrarlos

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PREPARACIÓN DE HEMODERIVADOS Y CONTROL DE CALIDAD

Objetivo El objetivo del servicio de banco de sangre, es la obtención de hemoderivados producidos por la separación aséptica de los componentes celulares de la sangre y del plasma, mediante un sistema cerrado estéril, el cual permite mantener la integridad de los hemocomponentes y así asegurar la calidad y seguridad que beneficien al receptor de estos. La sangre se recolecta en bolsas de extracción plásticas con bolsas de transferencia o satélite (doble, triple, cuádruple) o con solución aditiva. La bolsa de extracción contiene soluciones anticoagulantes-conservantes, destinada a evitar la coagulación y preservar la viabilidad y función celular, durante su almacenamiento. Las bolsas de extracción de sangre están diseñadas para un volumen de 450 ± 45 ml (405495 ml) con un 63 ml de anticoagulante-conservante. Para los pacientes que pesan menos de 50 Kg para los casos de autotransfusión pediátrica o en aquellas situaciones que el volumen extraído supere el 15% de la volemia se deben extraer una parte del anticoagulante.

Cálculo para la extracción de sangre de donantes que pesan menos de 50Kg. A = volumen a extraer (*) = (peso del donante Kg / 50 * 450 ml) (*) = alrededor del 12 % de la volemia. B = Cantidad de anticoagulante necesaria (¥) A / 100 * 14 (¥) = para las soluciones de CPD o ACDA-1 anticoagulante / sangre (1,4 / 10).

C = cantidad de anticoagulante a eliminar de la bolsa colectora 63 ml – B.

La solución anticoagulante usual contiene citrato (fija calcio del plasma), fosfato (sustrato para mantener el 2,3-DPG), dextrosa (azúcar), adenina (nucleótido). Según el hemocomponente que se desee, dependerá la temperatura de conservación y velocidad de centrifugación de la sangre recolectada.

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FRACIONAMIENTO DE LA SANGRE Comienza con un donante sano (evitar bacteriemia transitoria) y punción venosa limpia (minimizar contaminación bacteriana). La sangre se debe extraer de forma rápida (evitar activación de la coagulación) sin traumatizar el tejido, esta se puede extender hasta 15 minutos sin alterar las plaquetas y el plasma congelado. Al finalizar, la sangre se puede refrigerar a 1-6 º C, excepto si se empleara para la producción de plaquetas. La sangre se fracciona antes de 8 horas post extracción. La separación se realiza de acuerdo al peso específico de cada uno de los componentes, mediante centrifugación diferencial y de acuerdo a la calibración establecida (velocidad y duración para cada componente).

Plasma Plaquetas Glóbulos rojos

Densidad g/ml 1.023 1.03 1.100

Para cálculo de volumen de la bolsa de hemocomponente: Descontar al peso total del hemocomponente, el peso de la bolsa vacía. El volumen se calcula por la relación entre masa (g) y densidad (g /ml).

Sangre Total Es la sangre fresca no separada, contiene la solución anticoagulante y conservante (450 ml sangre + 63 ml anticoagulante-conservante.). Plaquetas y leucocitos dejan de ser funcionales. Hematocrito 35-45% Se conserva a 1-6° C Sin factores de coagulación lábiles Actualmente los bancos de sangre no la utilizan, sólo cuando es necesario reponer la masa eritrocitaria y la volemia (hemorragia masiva). Glóbulos rojos Son unidades de sangre casi sin plasma obtenidas por centrifugación fuerte. Este preparado contiene un concentrado de hematíes de 200 ml más unos 100 ml de plasma residual. Si la sangre se recoge en CPD-A, los concentrados pueden conservarse por 35 días a 4ºC. Hematocrito 60-80% CPD-A Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

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Si los glóbulos rojos son suspendidos en 100 ml de solución aditiva (SAG-M, ADSOL), pueden conservarse por 42 días, hematocrito 55-65%. Indicación: componente de elección en las anemias sintomáticas y en las transfusiones quirúrgicas. Glóbulos rojos leucodepletados Consisten en la suspensión o concentrado de glóbulos rojos contenidos en 5 x 106 leucocitos por unidad, que se preparan mediante el paso de estos a través de un filtro de leucodepleción, generalmente realizado antes de la transfusión. Indicación: Estos componentes pobres en leucocitos tienen valor en pacientes con reacciones transfusionales no hemolíticas febriles, evitar la aloinmunizacion HLA, disminuir transmisión de algunos virus (CMV, Epstein Barr). Glóbulos rojos irradiados Consiste en prevenir la proliferación de linfocitos T transfundidos en los receptores con riesgo de enfermedad injerto versus huésped. La dosis mínima necesaria de irradiación gamma es de 25 G. Los glóbulos rojos irradiados se conservan por un máximo de 28 días después de la colecta y procedimiento de irradiación. Indicación: Transfusiones intrauterinas, inmunocompetentes sometidos a trasplantes de medula ósea, unidades de donantes consanguíneos, neonatos bajo peso. Glóbulos rojos lavados Se requiere realizar en condiciones de asepsia, en 1-2 litros de solución salina normal, donde se remueve proteínas, electrolitos y anticuerpos plasmáticos. Estos deben usarse dentro de las 24 horas, debido a la realización del procedimiento con sistemas abiertos y se corre el riesgo de proliferación bacteriana. Indicación: En pacientes que tienen reacciones a las proteínas del plasma y en aquellos con anti IgA.

Plaquetas Se preparan a partir de sangre total a temperatura ambiente. Se obtienen plasma rico en plaquetas por centrifugación suave, mediante el sistema cerrado, el PRP se transfiere a la segunda bolsa (satélite), el que se centrifuga fuerte para obtener el concentrado plaquetario sedimentadas y resuspendidas en 40-60 ml de plasma. Estas se conservan a temperatura ambiente 20-24 º C por no más de 5 días en agitación constante. Indicación: pacientes con trombocitopenias o disfunción plaquetaria. Para prevenir hemorragias espontáneas o detener las existentes.

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Plasma fresco congelado Se obtiene a partir de la sangre total con menos de 6 horas de extraída. Se conserva congelado a -30 º C por 12 meses. Contiene factores de la coagulación lábiles y estables (cerca de 1 UI/ml). Su volumen aproximado es sobre 100 ml. Antes de usarse se debe descongelar en agua a 37º C. Indicación: se emplea para tratamiento de hemorragias secundarias a déficit de factores de la coagulación.

Crioprecipitado Se prepara a partir de plasma congelado dentro de las 6 horas de extraída. El PFC se descongela entre 1-6 º C, luego se somete a centrifugación fuerte para sedimentar el crioprecipitado, este se resuspende en 15 ml de plasma y se conserva a -30°C por 12 meses. El crioprecipitado contiene aproximadamente 250 mg de fibrinógeno y 80 U de FVIII. Antes de usarse se debe descongelar en agua a 37º C. Indicación: hemorragias secundarias a deficiencias de FVIII, hemofilia, enfermedad de Von Willebrand.

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CONTROL DE CALIDAD DE LOS HEMOCOMPONENTES Se basa en la evaluación de por lo menos 4 unidades de cada hemocomponente preparado en el banco de sangre, bajo las condiciones estandarizadas de velocidad y tiempo de centrifugación. Debe garantizar la efectiva separación y efectividad del hemocomponente a transfundirse. Control de calidad de los glóbulos rojos: -

Esterilidad: Cultivar sangre observar a las 24-48 horas. (hemocultivo) Volumen de la unidad (peso) > 250 ml Hematocrito: 60-80 CPDA , 55-65 SAG-M, ADSOL, OPTISOL

Control de calidad de plaquetas: Se realiza al final del período de almacenamiento. -

Esterilidad: sembrar sangre en placa de agar sangre observar a las 24-48 horas. Determinación del pH: > 6,2 o mas Recuento plaquetario /U: > 5,5 x 1010 Rec. Leucocitos/ U: 0.2 x 10 9 Volumen 40-60 ml Sin contaminación con glóbulos rojos. Antes de entregarlas se debe inspeccionar:

-

Agregados Aspecto arremolinado frente a una fuente de luz.

Tipo de hemocomponente

Volumen

Glóbulo rojo PFC

250-300 ml 100 ml

Crioprecipitado

10-30 ml

Temperatura conservación 1º-4º C -30º C -80º C -30º C

Plaquetas

40-60 ml

20º-24º C

de Tiempo de almacenamiento 21-35-42 días 1 año 2 años 1 año Descongelado 24hrs a 4°C Máx. 5 días en agitación horizontal constante

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PRUEBAS PRETRANSFUSIONALES Pruebas pretransfusionales El objetivo de las pruebas pretransfusionales, es prevenir las reacciones adversas a la transfusión por incompatibilidad entre donante y receptor. Los estudios pretransfusionales comprenden: • Identificación inequívoca del receptor de la transfusión. • Identificación inequívoca de las muestras del receptor de la transfusión. • Comprobación de los resultados obtenidos de las muestras con los obtenidos previamente y registrados, en el caso de anteriores transfusiones. • Determinación del grupo ABO y Rh en las muestras del receptor de la transfusión. • Descubrimiento de anticuerpos presentes en el suero del receptor de la transfusión. • Selección de los componentes sanguíneos apropiados para el receptor de la transfusión. . Reclasificación del grupo sanguíneo de la bolsa de GR del donante desde la tubuladura de esta. • Realización de las pruebas cruzadas de compatibilidad entre el suero del receptor y los hematíes del donante, excepto en casos de extrema urgencia en donde la falta de suministro de la sangre comprometa la vida del paciente, esto debe ir indicado por escrito por el médico responsable, en el laboratorio se debe proseguir con el estudio de compatibilidad luego de entregar la sangre. • Etiquetado de los componentes sanguíneos con la información adecuada del receptor de la transfusión.

Tipo de muestra: Sangre con EDTA para la determinación del grupo ABO y Rh. Sangre sin anticoagulante para obtener suero o con EDTA para determinar anticuerpos irregulares y prueba cruzada. No deben utilizarse muestras hemolizadas. (Las muestras pueden conservarse a 1-6º C hasta por 1 semana en el caso de necesitarse otra transfusión dentro de la misma)

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DESPACHO DE TRANSFUSIONES Selección de unidades a cruzar Antes de iniciar las pruebas de compatibilidad y una vez seleccionadas las unidades a cruzar, se debe confirmar el grupo ABO y Rh de las unidades. Compatibilidad ABO Siempre que sea posible, todos los pacientes deben recibir unidades de concentrado de hematíes ABO idénticos. Cuando ello no es posible, pueden seleccionarse componentes de grupos ABO compatibles, en función de los antígenos presentes en los hematíes y de los anticuerpos existentes en el plasma del receptor. Compatibilidad Rh Los componentes sanguíneos Rh positivos deben destinarse a los receptores D positivos, en tanto que las unidades Rh negativas, aunque sean compatibles con receptores D positivos, deben reservarse para los receptores D negativos En ocasiones y ante cuadros de urgencia y carencia de unidades Rh negativas un receptor D negativo puede recibir unidades Rh positivas, siendo consciente de que se va a producir una inmunización, valorando los riesgos y la posible administración ulterior de inmunoglobulina antiRh. Pruebas cruzadas de compatibilidad En todo paciente que precisa una transfusión y en aquellos que son sometidos a procedimientos quirúrgicos en donde es muy probable la administración de sangre, se deben realizar las pruebas cruzadas de compatibilidad, que consisten en enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante. Por medio de esta prueba debemos demostrar la compatibilidad ABO, Rh y la ausencia de anticuerpos antieritrocitarios significativos. Si se identifican anticuerpos relevantes, el paciente debe recibir sangre sin los antígenos correspondientes, aunque los glóbulos rojos del donante con los antígenos fuesen compatibles in vitro.

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Método: Pruebas de compatibilidad en tubo 1. Marque un tubo con el No de la unidad a transfundir 2. Lavar 4 veces con PBS los eritrocitos del dador obtenidos de la tubuladura de la bolsa, en el último lavado eliminar todo el PBS.

3. Preparar una suspensión al 2 % en Liss (19 gotas de Liss por 1 gota de glóbulos concentrados). 4. En un tubo previamente marcado colocar 2 gotas del suero del receptor y 2 gotas de eritrocitos del dador previamente preparados. 5. Centrifugar y leer. Lea en busca de hemólisis o aglutinación rotando suavemente el tubo frente a una fuente de luz. Registre el resultado.

6. Incubar según el tiempo estandarizado para el Liss a 37º C. 7. Centrifugar y leer. 8. Lavar 4 veces con abundante PBS y en el último lavado tener la precaución de eliminar la mayor cantidad de salino. 9. Agregar 1 gota de suero antiglobulina humano poliespecífico. 10. Centrifugar y leer 11. En los tubos con resultados negativos colocar 1 gota de células control de antiglobulina humana (Coombs). Centrifugar y leer.

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PRUEBAS DE COMPATIBILIDAD EN GEL 1. Glóbulos rojos lavados 4 veces en PBS, se deben diluir de la siguiente manera: Dispensar 1 volumen de Solución I (LISS) (500 ml) a un tubo y agregar 10 ul de Glóbulos Rojos lavados 2. Agregar 50 ul de G.R. al 1% a cada pocillo 3. Agregar 25 ul de suero o plasma del receptor 4. Incubar 15 minutos a 37ºC 5. Centrifugar 10 minutos 6. Leer

PRUEBA DE COMPATIBILIDAD RUTINARIA SALINA-POPIETILENGLICOL (PEG) 37ºC- anti-IgG Método 1. Rotular el tubo con las iniciales del receptor y número de unidad del donante. 2. Colocar 2 gotas de suero del receptor. 3. Añadir 1 gota de glóbulos rojos (reactivo o de donante) en suspensión al 2- 5% y mezclar. 4. Centrifugar y observar la presencia de hemólisis y/o aglutinación. Clasificar y anotar los resultados. 5. Mezclar 2 gotas de polietilenglicol e incubar a 37º C durante 15 minutos. 6. NO CENTRIFUGAR. Lavar 3 veces con solución salina. Eliminar el sobrenadante del último lavado. Agregar 1 gota de Suero de Coombs Anti-IgG. Centrifugar y leer en busca de aglutinación. Interpretación de las pruebas de compatibilidad

Investigación anticuerpos irregulares +

de Prueba cruzada -

-

+

+

+

-

-

Causa de la aglutinación

Compatible para la transfusión algún Fenotipar donante

El anticuerpo reacciona con antígeno de los hematíes reactivos El anticuerpo reacciona con antígeno de No baja incidencia Los hematíes del donante son PAD + Error en la técnica El anticuerpo reacciona con un antígeno No del donante y de hematíes del reactivo No se detecta anticuerpo si

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Inspección de la unidad Antes del despacho de la transfusión se debe verificar la integridad de la bolsa, evidenciar hemólisis en el plasma, presencia de turbidez, grumos o burbujas, evidenciar grandes coágulos. Identificación de la unidad Identificar la unidad a transfundir (etiqueta con nombre del receptor) Identificación del receptor Al receptor de la transfusión para ser identificado se le pide que diga su nombre completo o se puede identificar mediante un brazalete de identificación si este está inconsciente. Sus datos deben coincidir con su ficha clínica. Explicar al paciente el procedimiento Resolver la vía de administración (preexistente o instalar vía) Reclasificación ABO y Rh del paciente en la cabecera, y debe concordar con la unidad a transfundir y con la clasificación original del paciente.

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INDICACION DE LA TRANSFUSION (Extractos: 2ªEdición 2003 Sociedad Española de Transfusión Sanguínea Apartado de correos 40078, 28080 Madrid Deposito Legal: Copyright: SETS 2003© GUÍA SOBRE LA TRANSFUSIÓN DE COMPONENTES SANGUÍNEOS Y DERIVADOS PLASMÁTICOS)

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REACCIONES ADVERSAS A LA TRANSFUSIÓN SANGUÍNEA Se entiende por reacción transfusional a cualquier efecto desfavorable que se presenta en un paciente durante la administración de sangre total o de algún derivado de ella. Los efectos adversos y riesgos asociados a la transfusión de hemocomponentes se clasifican en: Agudos: Aparecen durante el acto transfusional, o poco tiempo después (Hasta 24 horas). Retardados: Tienen lugar más allá de las 24 horas después del inicio de la transfusión. Mecanismo productor inmune: Por reacción antígeno del donante con anticuerpo significativo del receptor. Mecanismo productor no inmunológico: Por administración de sangre lisada “in vitro”, o por la propia condición clínica del paciente, donde la hemólisis se produce “in vivo”.

Principales reacciones transfusionales agudas Tipo de reacción Hemolítica inmune

Etiología Incompatibilidad eritrocitaria

Hemolítica no inmune

Destrucción eritrocitaria por agentes físicos o químicos Anticuerpos antileucocitarios, Antiplaquetarios, pirógenos.

Febril no hemolítica

Alérgica Anafiláctica

Sobrecarga circulatoria

Lesión pulmonar aguda

Signos y síntomas Escalofríos, fiebre, dolor en la zona de infusión, dolor óseo, hemoglobinuria, fallo renal agudo, oliguria, coagulación intravascular diseminada hemoglobinuria

Fiebre(>1°C) cefalea, escalofríos, nauseas, vómitos, malestar general Alergia del paciente al producto eritema local, prurito soluble en plasma del donante Anticuerpos anti-IgA en pacientes con Tos, broncoespasmo, calambres déficit de IgA abdominales, vómitos, diarrea, shock, pérdida de conciencia Anticuerpos anti-HLA o anti Distres respiratorio agudo con o neutrófilos en el plasma del donante sin hipotensión que aparece generalmente entre 1-2 horas post transfusión Anticuerpos anti-HLA o anti- Distres respiratorio agudo con o neutrófilos en el plasma del sin hipotensión que aparece Donante generalmente entre 1-2 horas post transfusión

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Hipocalcemia

Transfusión masiva de hemocomponentes y disminución del metabolismo del citrato.

Parestesias, tetania, arritmias

Contaminación bacteriana

Administración de hemoderivados contaminados por bacterias

Hipotermia

Fiebre (generalmente >40°C), taquicardia, shock, CID, náuseas y vómitos, hipotensión, colapso circulatorio Arritmia cardiaca

Infusión rápida de hemocomponentes fríos Administración de varias unidades de Arritmia cardiaca hemocomponentes con niveles altos de potasio Introducción de aire Hipotensión, cianosis, en la vía venosa colapso circulatorio

Hiperkalemia

Embolia gaseosa

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Principales reacciones transfusionales retardadas Tipo de reacción Hemolítica

Aloinmunización

Enfermedad injerto contra huésped

Púrpura posttransfusional

Sobrecarga férrica

Transmisión de Enfermedades

Etiología Respuesta anamnésica antígenos eritrocitarios

Signos y síntomas a Malestar general, inadecuado aumento de los niveles de hemoglobina, elevación de la bilirrubina sérica Respuesta inmune frente a Generalmente ninguno, pero antígenos de las células puede dar un estado de sanguíneas refractariedad a la transfusión de plaquetas, dificultad para encontrar unidades compatibles, reacciones hemolíticas tardías ulteriores Acción de los linfocitos Eritrodermia,rash maculopapular, funcionales infundidos sobre anorexia, náuseas, vómitos, el sistema inmune diarrea, hepatitis, pancitopenia, fiebre Anticuerpos Cuadro purpúrico, Plaquetarios hemorragia, a los 8-10 días posttransfusion Múltiples transfusiones Transtornos endocrinos, de hemocomponentes en arritmias, pacientes con necesidades miocardiopatía, fallo hepático y reiteradas pancreático Contaminación por agentes Las propias de cada agente patógenos de las unidades patógeno transmitido administradas

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Pasos a seguir frente a una reacción adversa a la transfusión sanguinea • Detener inmediatamente la transfusión manteniendo la vena con suero fisiológico. • Tomar los signos vitales, anotar y describir sintomatología. • Verificar la etiqueta de la bolsa con los datos del paciente y que esta coincida, con el destinatario a quien se transfunde. • Notificar la incidencia al médico responsable del paciente para valorar la intensidad de la reacción, el tratamiento oportuno y la continuidad o no de la misma. • Realizar por otra vía distinta a la de la transfusión, la extracción de 10 mL de sangre con EDTA y 10 mL de sangre coagulada. • Enviar al banco de sangre la hoja de reacción transfusional, la bolsa de sangre con su equipo de infusión y las muestras extraídas (incluida la orina). • Comprobar toda la documentación administrativa, etiquetas, identificaciones en busca de posibles contradicciones o diferencias. • Inspeccionar visualmente las muestras plasmáticas pre y post-transfusionales para detectar la presencia de hemólisis (color rosado) o ictericia. • Realizar una prueba de aglutinación directa (Test de Coombs) en la muestra con EDTA pre y post-transfusional • Repetir la determinación de grupo ABO y Rh en las muestras pretransfusionales, transfusionales y en el componente o hemoderivado administrado.

post-

• Determinar el estudio de anticuerpos irregulares en las muestras pre y post-transfusionales del paciente. Pueden ser negativos en un principio por estar adsorbidos sobre los hematíes transfundidos. En este caso hacer eluido si la PAD es positiva. • Pueden repetir las pruebas cruzadas con la muestra pre y post-transfusional. • Determinar la posible existencia de hemoglobina libre en la orina del paciente emitida tras el incidente transfusional. • Realizar una tinción de Gram en una muestra de la unidad, así como cultivos microbiológicos si están indicado.

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SOLUCIONES INTRAVENOSAS Y SU RELACIÓN CON LA TRANSFUSIÓN SANGUINEA Y HEMOCOMPONENTES

Hemocomponente

Sangre

Glóbulos Rojos

Plasma

Plaquetas

Soluciones INCOMPATIBLES

Soluciones en caso de malos accesos

Soluciones Compatibles

- Suero glucosado - Dextrosa - Ringer Lactato - Soluciones que contengan calcio - Antibióticos - Calmantes - Cloruro de sodio hipotónico - Suero glucosado - Dextrosa - Ringer Lactato - Soluciones que contengan calcio - Antibióticos - Calmantes - Cloruro de sodio hipotónico - Ringer Lactato - Soluciones que contengan calcio - Antibióticos - Calmantes - Ringer Lactato

- Albúmina 5%

Suero fisiológico Plasma Compatible

- Albúmina 5%

- Suero fisiológico - Plasma Compatible

- Suero glucosado - Dextrosa

- Suero fisiológico

- Suero glucosado

- Suero fisiológico

- Soluciones que contengan calcio

- Dextrosa

- Antibióticos - Calmantes

Crioprecipitados

- Ringer Lactato - Soluciones que contengan calcio - Antibióticos - Calmantes

- Suero glucosado - Dextrosa

- Suero fisiológico

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BIBLIOGRAFÍA 1. Manual de la AABB 13ª Edición 2001. Traducido por la Asociación Argentina de Hemoterapia e inmunohematología. 2. Modern Blod Banking and Transfusión Practices. 4ª Edición. Denise M.Harmening. 1999. 3. Manual de la AABB. 15ª Edición. 2007. Traducido por la Asociación Argentina de Hemoterapia e inmunohematología. 4. Methods in immunohematology. 2° edition. W.John Judd, FIBMS, MIBiol. 1994 5. Blood Transfusion Therapy. A Physician’s Handbook. 7 edition. 2002 6. Administración de sangre y hemoderivados. Compendio de medicina transfusional. Elias Aguilar Ligorit. 2004 7. Guía para el uso clínico de la sangre. Tercera edición enero 2007. Asociación Mexicana de Medicina Transfusional, A.C. 8. Transfusión sanguínea. Bases teóricas y aplicación clínica. J.G. Kelton. Ed. Doyma 1988. 9. Revised Preventive Measures to Reduce the Possible Risk of Transmission of CreutzfeldtJakob Disease (CJD) and Variant Creutzfeldt-Jakob Disease (vCJD) by Blood and Blood Products FDA Center for Biologics evaluation and Research (CBER) - 8/27/2001 10. Transfusion Medicine. Jeffrey Mc Cullough Mc Graw Hill 1998 11. Recommendations for Donor Questioning Regarding Possible Exposure to Malaria. FDA CBER June 2000 Th

12. Guide to the preparation, use an quality assurance of blood components 5 Edition.

Council of Europe publishing 1999.

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