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• Sandy Peñaloza Mercado

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UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR FACULTAD DE INGENIERÍAS Y TECNOLOGÍAS INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

DETERMINACIÓN DE Salmonella sp

ALBERNIA DELGADO JOHAN BOLIVAR ZULETA ELKIN GUERRERO MORENO NELSON HERRERA ROCHA FABIO ESTEBAN MARTINEZ MARTINEZ DAVINSON PEÑALOZA MERCADO SANDY

VALLEDUPAR CESAR 12/ 11 / 2014

PROCEDIMIENTO 1. ENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO

Mezclar muy bien la muestra (si es liquida) para asegurar su homogenización. Desinfectar con alcohol al 75% el sitio por donde se vaya a extraer la muestra. Abrir asépticamente ( con el mechero en medio) y adecuadamente la muestra. Si es sólida tomar porciones de diferentes sitios de la muestra. Pesar 25 gramos de la muestra en balanza analítica si es sólida, sobre un papel graff estéril o medir 25 mililitros si es liquida en recipiente estéril. Macerar, picar o triturar. Añadir al recipiente de dilución que contiene 225 ml de agua peptonada Cuando se analiza leche en polvo, utilizar agua destilada adicionada de 5 ml de solución verde brillante al 0.1% Incubar a 35º + / - 2ºC por 18 – 24 horas Realizar controles positivos y negativos con cepas conocidas

2. ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO Transferir 0.1 ml de cultivo obtenido del enriquecido no selectivo en 10 ml de caldo Rappaport – Vassiliadis Transferir 1ml para el Caldo Muller - Kauffmann Incubar el caldo Rappaport – Vassiliadis a 44.5°C por 18-24 horas y el caldo Muller – Kauffmann a 37°C durante 18-24horas. 3. SIEMBRA EN PLACAS CON MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES Se debe utilizar como minimo dos medio s selectivos por cada caldo de enriquecimiento no selectivo y selectivo para el aislamiento del microorganismo, se recomienda el agar bismuto sulfito, al agar verde verde brillante lactosa sacarosa con novobiocina y el agar XLD.

A partir de cada uno de los cultivos obtenidos del enriquecimiento no selectivo y selectivo, sembrar en superficie con asa por agotamiento placas con agar verde brillante lactosa sacarosa, agar bismuto sulfito o agar XLD. Incubar las placas a 35ºC + / - 2ºC durante 24 – 48 horas

Escoger 3 colonias típicas sospechosas de Salmonella Aislarlas en Agar selectivo para garantizar su pureza. Proceder a su identificación teniendo en cuenta que las colonias presuntivas de salmonella deben estar bajo este esquema: Salmonella tipica: TSI:

K/A, H2S + ; LIA: K/ k, K/A, H2S +

Salmonella atipica: TSI K/A, H2S - ; LIA: : K/ k, K/A, H2S – Salmonella grupo III: TSI: A/A , H2S + ; LIA: k/k, H2S +

4. IDENTIFICACIÓN DE Salmonella La identificación de cultivos sospechosos de pertenecer al género Salmonella sp incluye dos Etapas seguidas: Comprobación de las colonias sospechosas mediante pruebas bioquímicas confirmativas Identificación serológica de las cepas sospechosas mediante el uso de antisueros. 4.1. Realizar las siguientes pruebas bioquímicas coloración de Gram, prueba de oxidasa, fermentación de carbohidratos(glucosa, lactosa y sacarosa),prueba de la lisina descarboxilasa, movilidad, reducción de nitrato rojo de metilo – voges proskauer (MR-VP), producción de indol, reacción en agar citrato de Simmons, reacción en agar urea, desaminación de la fenilalanina(APP)

INTERPRETACION DE RESULTADOS La presente técnica para la detección de Salmonella en alimentos, describio un esquema general que consiste de 5 pasos básicos: 1. Preenriquecimiento, es el paso en donde la muestra fue enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permitio restaurar las células de Salmonella dañadas, logrando de esta manera una condición fisiológica estable. 2. Enriquecimiento selectivo, se logro a partir de un medio de cultivo que conjuntaras dos condiciones, por un lado debe incrementar las poblaciones de Salmonella y por otro inhibir otros microorganismos presentes en la muestra. En nuetro caso fue Caldo Vassiliadis-Rappaport y Caldo Müller – Kauffmann 3. Selección en medios sólidos, este punto se derivo directamente del anterior y se utilizaron medios selectivos, que restringieron el crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y que permitio el reconocimiento visual característico de colonias sospechosas. Los medios usados fueron Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD); Agar SS y Agar Bismuto Sulfito. Medio selectiv o

Agar XLD

Característic as coloniales de Salmonella spp Rosas o rojas pueden ser transparentes, con o sin centro negro. En algunos casos completament e negras o del mismo color del medio con centro negro. las colonias de Salmonella H2S negativo (ej. S. Paratyphi en el XLD son rosadas con un centro rosa oscuro y las de Salmonella lactosa positivas son de color amarillo con o sin centro negro.

Composicion y fundamento

Utiliza el desoxicolato de sodio como agente selectivo y, por consiguiente, inhibe los microorganismos gram positivos. Xilosa , Lactosa sacarosa (genera la producción de ácido haciendo virar el indicador (rojo fenol) de rojo a amarillo.) L-Lisina, se incuye para aumentar la diferenciacion de Salmonella ya que sin la lisisna estos microoganismos fermentan rapidamente la xilosa porduciendo acidificaciond del medio y no pudiendolas diferenciar. Cloruro sódico Extracto de levadura Rojo fenol Desoxicolato de sodio Citrato férrico de amonio , Tiosulfato sódico (indicador de produccion de H2S, colonias de centro negro) Agar

Resultados

Se observó colonias rosadas algunas con centro negro.

Agar SS

Translúcidas en ocasiones opacas. Algunas con centro negro. Las colonias fermentadoras de lactosa son rojas

Extracto de carne bovina Digerido pancreático de caseína Digerido péptico de tejido animal Lactosa Sales biliares Citrato sódico Tiosulfato sódico (formacion de SH2) Citrato férrico Rojo neutro (indicador) Agar Verde brillante pH: 7,2

Los microrganismos fermentadores de lactosa acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicado de pH obteniéndose como resultado colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Mientras que Salmonella que es un microorganismo no fermentador de la lactosa creció adecuadamente en el medio de cultivo y produjo colonias transparente. La producción de ácido sulfhídrico se evidenciaría como colonias con centro negro debido a la formación de sulfuro de hierro. Ninguna de las colonias presento centro negro. Agar Bismuto Sulfito

Café, grises o negras; con o sin brillo metálico. Algunas veces presencia de halo café o negro.

Extracto de carne, digerido pancreatico (inhibe crecimiento Gram (+), digerido peptico de tejido animal dextrosa, fosfto de sodio, sulfato ferroso, indicado de sulfito de bisuto, agar, verde brillante, agua destilada. Antes de inocular era opaco, verde palido

Se observaron colonias translucidas con centro negras con poco brillo metálico. (sin halo negro)

4. Identificación bioquímica, este paso permitio la identificación genérica de los cultivos de Salmonella y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.

Las reacciones biquimicas de Salmonella que fueron aplicadas en agar LIA y TSI. Se tomaron colonias presuntivas y se procedio a realizar pruebas biquimicas.

LIA FUNDAMENTO Y COMPOSICION la peptona y el extracto de levadura (nutrientes); La glucosa(hidrato de carbono fermentable) ; lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico; El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierr RESULTADOS 1. Decarboxilación de la lisina: Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo. 2. Desaminación de la lisina: Pico rojizo/fondo amarillo.. 3. Producción de ácido sulfhídrico:

Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del pico y fondo) Para Salmonella typhimurium y Salmonella enteritidis, el control de calidad es: Microoganismo Salmonella typhimurium Salmonella enteritidis

Color en el pico de flauta Purpura

Color en la base del tubo Purpura

Ennegrecimieto del medio Positivo

Purpura

Purpura

positivo

Informe de resultado para LIA

No se presento ennegrecimiento del medio, el fondo del tubo se manifesto color amarillo, el pico de flauta se manifesto color purpura. No se evidencio presencia de Salmonella typhimurium o de Salmonella enteritidi.

TSI FUNDAMENTO Y COMPOSICION extracto de carne, pluripeptona (nutrientes) cloruro de sodio

lactosa, sacarosa y glucosa (hidratos de carbonos fermentables) sulfato de hierro y amonio (produccion de acido sulfhidrico) tiosulfato de sodio (se reduce a sulfuro de hidrogeno que reaccina luego con una sal de hierro proporcionando el color tipico sulfuro de hierro de color negro) rojo de fenol(indicador acido) agar INTERPRETACION DE RESULTADOS 1. Superficie alcalina/profundidad ácida (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa 2. superficie acida/profundida acida (pico amarillo/fondo amarillo): el microoganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. 3. superficie alcalina/profundidad alcalina(pico rojo/fondo rojo):el microoganismo es no fermentador de azucares 4. la presencia de burbujas o ruptura del medio de cultivo indica que el microoganismo produce gas. 5. el ennegrecimiento del medio indica que el microoganismo produce acido sulhidrico.

Para Salmonella typhimurium el control de calidad debe ser:

Microoganismo

Superficie/profundidad

Salmonella typhimurium

K/A

Produccion de gas Negativo

Produccion de SH2 Positivo

Donde A es reaccion acida (color amarilla) y K es reccion alcalina (color rojo) Informe de Resultados para TSI

Se evidenca presencia de gas por la separacion del medio, K/A (pico rojo, fondo amarillo), no se evidencio enengrecimiento del medio, es decir, no hay produccion de acido sulfhidrico. Negativo para Salmonella typhimurium

Nuestro análisis fue comparado con la investigación Presencia del gen de invasividad inv A en cepas de Salmonella spp. aisladas de alimentos del Caribe Colombiano(Espinal-Prieto, et al; 2006) cuyo objetivo fue establecer la presencia del gen de invasividad invA en aislamientos de Salmonella spp. obtenidos de alimentos en la región Caribe Colombiana. Los resultados obtenidos en la investigacion fueron los siguiente: se recuperaron 74 aislamientos de Salmonella spp. , en carne de res 30 (40,5 %), embutidos 13 (17,6 %), pollo 12 (16,2 %), queso 9 (12,2 %), cerdo 6 (8,1 %) y otros 4 (5,5 %). Los serotipos más frecuentes fueron: S. anatum 14 (18,9 %), S. uganda 13 (17,6 %), S. newport 9 (12,2 %) y S. typhimurium 7 (9,5 %). el gen invA se detectó en 72 (97,3 %) aislamientos de Salmonella. El procedimiento que se realizo en el estudio fue similar al realizado en el laboratorio (con excepción de la realizacion de las pruebas serologicasque no fueron realizadas): se pesaron 25 g de cada muestra de alimento que fueron inoculados en 225 mL de medios de preenriquecimiento, agua peptonada y caldo infusión cerebro corazón y se incubaron a 37 °C durante 18-24 h. Se inoculó 1 mL de cada muestra anterior en 9 mL de medio Rappaport y se incubaron a 43 °C entre 18-24 h. Se inoculó 1 mL de cada muestra en 9 mL de Tetrationato líquido y se incubaron a 37 °C durante 18-24 h. Cada muestra fue subcultivada tomando una asada de los tubos de enriquecimiento y su siembra por agotamiento en agar base XLT4 (Difco Detroit, Mi USA), XLD, SMID (Biomeriux, etoiac, France), SS,

Hekctoen y Sulfito Bismuto; estas placas se incubaron a 37 °C por 18-24 h. A las colonias sospechosas de Salmonella se les realizaron pruebas bioquímicas convencionales (Urea, LIA y TSI) incubándolas a 37 °C durante 18-24 h para ser identificadas. Se confirmaron con antisueros polivalentes para Salmonella (Difco, Detroit, Mi, EE.UU.). Cada cepa se conservó por triplicado en tubos de Skin Milk a -70 ºC. Mediante las pruebas serologicas se detectó la presencia del gen invA en los serotipos de Salmonella circulantes en alimentos en la región Caribe Colombiana.los alimento que fueron analizados fueron:agua, arepa de huevo, carne de res, cerdo, embutido, pollo quesos viceras en ciudades como Barranquilla, Cartagena, Monteria, Sincelejo:

INFORME DE RESULTADOS DE LABORATORIO Ausencia de de Salmonella sp/ 25 gramos de muestra de salchicha Ranchera marca Zenu.

CONCLUCION Debido a que no se evidencio Salmonella sp. en una salchicha Ranchera marca Zenu, se puede deducir que es apta para el consumo humano y que cumple la Norma Tecnica Colombiana NTC 1325 el cual reza que entre los requisitos microbiologicos para productos carnicos procesados cocidos la deteccion de Salmonella,/25 g debe ser ausencia; sin embargo, no se descarta la evidencia de otros microoganismo en la muestra, por lo que no podemos concluir si es apta o no. Posiblemente se evidencio el crecimiento de otros microganismos debio a que la mala manipulacion y almacenamiento del producto, pues el producto se adquirio de un establecimiento donde para su comercializacion las salchichas son sacadas de su empaque original para ser comercializadas al detal, y expuestas a contaminacion cruzadas por otros productos almacenados en la cadena de frio, tales como verduras, frutas, carnes crudasde pollo y res , leches empacadas en bolsa, sanguazas, etc.

BIBLIOGRAFIA Instituto COLOMBIANO DE NORMAS TECNICAS Y CERTIFICACION. Industrias Alimentarias. Productos Cárnicos no Procesados.5ª actualización, Bogotá. ICONTEC (NTC 1325). ESPINAL MARIN, Paula; PRIETO SUAREZ, Edgar; OTERO JIMENEZ, Vanessa y MATTAR VELILLA, Salim. Presencia del gen de invasividad inv A en cepas de Salmonella spp: aisladas de alimentos del Caribe Colombiano. Rev Cubana Salud Pública [online]. 2006, vol.32, n.2 [citado 2014-11-04], pp. 0-0 . Disponible en: . ISSN 0864-3466. Referencia en internet Hoja técnica para LIA URL:http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/lisinahierroagar.htm Hoja técnica para TSI URL:http://www.britanialab.com/productos/332_hoja_tecnica_es.pdf Hoja técnica para Agar XLD URL:http://www.britanialab.com/productos/337_hoja_tecnica_es.pdf Hoja técnica para Agar SS URL: http://www.britanialab.com/productos/337_hoja_tecnica_es.pdf Hoja técnica para Agar Bismuto de Sulfito (laboratorio Pronadisa) URL:http://www.condalab.com/uploads/media/1011__AGAR_BISMUTO_SULFITO _REv_0_Abril_2010_01.pdf