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• roxana vidal

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Practico de Laboratorio determinación de salmonella en alimentos Integrantes: Carrera: Nivel: Asignatura: Docente:

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Índice:

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Introducción: De acuerdo con el reglamento sanitario de los alimentos la sola presencia de Salmonella en un alimento es considerada como causa de rechazo. El fundamento del método para la detección en alimentos se basa en que la presencia de Salmonella está en menor número que el de la flora acompañante especialmente en alimentos sin tratamiento previo como lo es el alimento a ser analizado (carne molida cruda) En este laboratorio los métodos realizados fueron convencionales para su recuperación consideran todos estos factores permitiendo recuperar Salmonella mediante procesos de pre enriquecimiento y enriquecimiento en las etapas preliminares y posterior siembra en agares selectivos, realización de pruebas bioquímicas para su comprobación.

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Objetivo general: 

El presente procedimiento tiene como objetivo describir la metodología llevada a cabo por el Laboratorio de Microbiología para realizar la detección, aislamiento e identificación de Salmonella spp. En muestras de alimento carne molida de la carnicería ubicada en sector de franke llamada el rancho de don mati

Objetivos específicos: 

Realizar la detección, aislamiento e identificación de Salmonella spp. En muestras

   

de alimentos. Con distintas técnicas Realizar técnica de pre enriquecimiento no selectivo en caldo Realizar técnica de enriquecimiento selectivo en caldo Realizar aislamiento en agar selectivo Realizar técnicas bio químicas para la La confirmación de Salmonella spp.

Marco teórico 4

Familia Enterobacteriaceae. Aunque los miembros de este género son capaces de moverse por medio de flagelos perítricos, existen variantes no móviles, S. enterica serovar Pullorum y S. enterica serovar Gallinarum, así como cepas no móviles debido a la presencia de flagelos disfuncionales. Las especies de Salmonella son quimio organótrofas, con habilidad para metabolizar nutrientes por las vías fermentativa y respiratoria. Las bacterias crecen óptimamente a 37°C y pueden catabolizar la D-glucosa y otros carbohidratos con producción de ácido y gas. Estos microorganismos son oxidasa negativos y catalasa negativos, crecen en citrato como única fuente de carbono, generalmente producen ácido sulfhídrico, descarboxilan la lisina y ornitina, y no hidrolizan la urea. La mayoría de estas características se utilizan para la identificación bioquímica de cepas aisladas de Salmonella.

De acuerdo con la definición contemporánea, una cepa de Salmonella típica produce ácido y gas a partir de la glucosa en el agar hierro tres azúcares, pero no es capaz de utilizar lactosa y sacarosa en éste medio, o en medios sólidos selectivos tales como verde brillante, xilosa lisina desoxicolato y/o entérico de Hektöen. Las especies típicas de Salmonella producen en agar hierro lisina, una rápida reacción alcalina por la descarboxilación de la lisina y generan cadaverina. La variabilidad genética observada en este microorganismo ha originado mutaciones, e intercambio intra e intergenérico de plásmidos lo cual ha reducido los biotipos típicos de Salmonella. En muestras clínicas y de alimentos se han encontrado biotipos lac+ y/o sac+; biotipos que no descarboxilan la lisina, que incluso hidrolizan la urea, que producen indol y que crecen rápidamente en KCN. Esta situación ha llevado a reevaluar el esquema de identificación del género, e especies

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La dosis infectiva en humanos fluctúa entre 1 a 10 células. La

composición química del alimento es otro factor

determinante

en

la

salmonelosis

además

de

la

heterogeneidad inmunológica en la población humana y la virulencia de las cepas infectivas. Un denominador común de los alimentos involucrados, es la presencia de un alto contenido de grasa en alimentos como el chocolate, el queso y la carne. Se ha sugerido que las células de Salmonella englobadas en las micelas lipídicas pueden resistir el efecto lítico de los ácidos gástricos. Las infecciones por Salmonella en humanos pueden originar varias condiciones clínicas, incluyendo fiebre entérica (tifoidea), enterocolitis e infecciones sistémicas por microorganismos no tifoides. La fiebre entérica es una infección grave asociada con las cepas

tifoidea

y

paratifoidea,

las

cuales

están

particularmente bien adaptadas para invadir y sobrevivir en los tejidos del huésped. Las manifestaciones clínicas de la fiebre entérica aparecen después de un periodo de incubación de 7 a 28 días y pueden incluir diarrea, fiebre prolongada con variaciones en la misma, dolor abdominal, dolor de cabeza, y debilitamiento. El diagnóstico de la enfermedad radica en la detección del agente infectivo en etapas tempranas en la sangre o en heces al inicio de la sintomatología clínica. El tratamiento incluye el uso de cloramfenicol, ampicilina, o trimetroprim con sulfametoxasol para eliminar la infección sistémica. En países subdesarrollados como el nuestro, el uso indiscriminado de estos antibióticos ha originado la existencia de cepas resistentes que causan altas tasas de mortalidad cuando se presenta un brote de este tipo. La infección en humanos con Salmonella spp. no tifoide provoca enterocolitis, ésta aparece de 8 a 72 h después de tener contacto con el patógeno invasivo. La condición clínica es auto limitante y la evacuación de heces típicas diarreicas no sanguinolentas y dolor abdominal se presentan a los 5 días. El tratamiento solo implica reemplazo de fluidos o electrolitos. El 6

uso de antibióticos está contraindicado ya que prolonga la sobrevivencia y la excreción intermitente del microorganismo.

Fundamento 7

La presente técnica para la detección de Salmonella en alimentos, describe un esquema general que consiste de 5 pasos básicos: Pre enriquecimiento, es el paso en donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella dañadas, logrando de esta manera una condición fisiológica estable. Enriquecimiento selectivo, se logra a partir de un medio de cultivo que conjunte dos condiciones, por un lado debe incrementar las poblaciones de Salmonella y por otro inhibir otros microorganismos presentes en la muestra. Selección en medios sólidos, este punto se deriva directamente del anterior y se utilizan medios selectivos, que restringen el crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y que permitan el reconocimiento visual característico de colonias sospechosas. Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los cultivos de Salmonella y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.

I.

Procedimiento de laboratorio

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Materiales 1Balanza 1Vortex Placas petri estéril Pipetas de 1 y5 ml estériles 1Asa Tubos de ensayo con tapa rosca y estériles 1 frasco shott 500 ml estéril Estufa de incubación a 35°cy 42°c Medios de cultivos a ser utilizados Agua peptonada tamponada PH =7,2 Caldo rappaport vassiliadis( CRV) Caldo selenito cistina (CSC) Agar xilosa –lisina-desoxicolato (XLD) Agar salmonella -shigella (SS) Agar TSI Agar LIA

II.

Preparación de la muestra

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1 paso.- pre enriquecimiento no selectivo  Se procede a pesar

25g

de la

muestra y homogenizamos con 225 ml de agua peptonada tamponada lo cual quiere decir que tiene PH 7,2  Homogenizamos la muestra para que se mescle con el agua y luego se incuba por 18 a

24 horas a

temperatura de 35°c

2 paso.- enriquecimiento selectivo 

La muestra se toma del la estufa de



incubación y se agita suavemente se trasfiere 1ml a 10 ml de caldo selenito cistina se incuba a temperatura de 35°c por 24horas etiquetando el tubo

de ensayo  Se toma otro tubo de ensayo estéril y se le agrega 0,1ml de la muestra en 10ml de caldo rappaport vassiliadis se etiqueta y se incuba por 24 horas a t° de 42°c

Caldo rappaport

Caldo selenito cistina

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3 paso.- Aislamiento en agar selectivo

 Observamos los tubos de ensayo y procedemos a

agitar para luego aislar en

agar

Caldo rappaport se observa como el color

azul se redujo en presencia de

bacterias Caldo selenito cistina esta de color medio rojo y turbio se procede a realizar las siembras en los agares XLD y SS

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3 Paso.- aislamiento en agar selectivo

Agar ___________ salmonella –shigella SS  Se aíslan en placas  en siembra en superficie

CSC

CRV

Agotando el inoculo Resultado:

Colonias trasparentes u opacas con o sin centro oscuro

Agar ________ xilosa- lisina –desoxicolato (XLD )

CSC

CRV Resultado:

Colonias trasparentes con o sin centro oscuro

Se incuban por 24 a 48 horas a t° de 35°c las placas

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4 paso.-Pruebas bio químicas  Se selecciona colonias sospechosas de cada una de las placas de los agares selectivos  Se procede a inocular cada una de las colonias en los agares en tubos TSI y agar LIA tocando suavemente el centro de las colonias identificada con el asa en punta y se inocula el tubo en profundidad y en superficie sin flamear se inocula el tubo con agar LIA pinchando dos veces en profundidad y a ser las estrías en superficie  Se procede a incubar por los medios a t°de 35°c por 48horas Interpretación de las pruebas bio químicas y resultados

AGAR LIA

AGAR TSI

MICRO ORGANISMO

TSI

GAS

H2S

LIA

GAS

H2S

A/A

+

+

K/K

+

+

Salmonella spp

A/A

+

-

A/K

+

+

Salmonella spp

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Salmonella

Agar TSI

inoculado con colonia del agar SS

interpretación A/A

Producción de gas

por

desplazamiento del medio y negativo en H2S Agar LIA resultado

inoculado con colonia del agar SS K/K

Purpura sobre purpura

producción de H2S y gas porque se

con produce

ruptura y desplazamiento del medio

Agar TSI que fue inoculado del agar XLD el medio queda total mente negro

dando A/A

positivo en H2S y positivo en producción de gas por desplazamiento del medio Agar LIA inoculado de las colonias del agar XLD queda fondo amarilla

A/K

negro y superficie

dando positivo en producción de H2S y ruptura del medio producto del

gas

Conclusión de los resultados 14

Las pruebas dan positivas se encuentran salmonella .las mayorías de las especies de salmonella dan reacciones positivas indicando producción de gas y también algunas cepas de salmonella típicas

dan fondo amarillo con o sin producción de H2S en

negreciendo el medio Interpretación: Las cepas de Salmonella típica producen: En TSI: y fondo ácido (amarillo) con o sin Producción de H2S (ennegrecimiento del agar) En LIA: La mayoría de los cultivos de Salmonella producen H2S en LIA. Algunos cultivos que no son Salmonella producen un color rojo ladrillo en LIA. Deben ser retenidos para confirmación bioquímica y serológica los cultivos que dan: Fondo alcalino (violeta) en LIA sin importar la reacción en TSI ácido (amarillo) en TSI. Descartar como no Salmonella los cultivos que dan fondo ácido en LIA y picde flauta y fondo ácidos en TSI.

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Conclusión: En este practico quedo clara mente

al descubierto que el proceso de manipulación y de

conservación no se toma en cuenta en el local de venta de la muestra analizada comprada en la carnicería del sector de franque Muchos de los alimentos que se llevan a la mesa pueden estar contaminados y ser un riesgo para nuestra salud y para la de nuestras familias, por esta razón, es indispensable que se lleven a cabo por las entidades correspondientes como lo es el servicio de salud las fiscalizaciones as estos locales y realicen los análisis correspondiente a estos locales de alimentos realicen análisis microbiológicos a la mercancía como lo es la carne en especial la carne molida El análisis microbiológico no mejora la calidad del alimento, sino que permite valorar la carga microbiana, señalando los posibles puntos de riesgo de contaminación o multiplicación microbiana, para Muchos de los alimentos no pasan por un análisis microbiológico por lo que se convierten en un riesgo para la salud, debido a que pueden ocasionar enfermedades como, Salmonella y (Staphilococcus aureus) entre otras.

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Bibliografía: http://www.fao.org/ag/agn/agns/jemra_riskassessment_ecoli_es.as http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Pagogenosnorm.Salmonella_17364.pdf http://solutions.3m.com.pe/3MContentRetrievalAPI/BlobServlet? lmd=1365689968000&locale=es_PE&assetType=MMM_Image&assetId=1361583924433 &blobAttribute=ImageFile

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