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• Yanira Darlin

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ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LOS NIVELES DE CONTAMINACIÓN DE LA SALMONELLA spp EN PESCADO FRESCO JUSTIFICACIÓN El siguiente trabajo de investigación tiene el propósito de dar a conocer a la población de Llallagua sobre la presencia bacteriana Salmonella Spp en muestras de pescado fresco del criadero del sector aguas calientes del municipio de Llallagua del departamento de Potosí, expendio público de Llallagua y expendio público de la ciudad de La Paz las mismas que serán analizadas mediante el medio de cultivo agar ss, caldo tetrationato, técnica de tinción Gram y diferentes pruebas bioquímicas. Con los resultados obtenidos nos servirán para plantear a la población consumidora propuestas de medidas preventivas necesarias de sanidad e higiene, para así retardar el deterioro de la muestra de pescado y evitar el desarrollo de la bacteria Salmonella Spp. Evitando posibles infecciones y enfermedades que afectarían a la población consumidora. Puesto que los pescados son un recurso muy consumido por los seres humanos debido a la presencia de omegas, propiedades nutritivas y aportan un balance de proteínas de alto valor biológico, vitaminas, minerales como el Fosforo. Aplicar medidas de inspección que garanticen un control eficiente por parte de las alcaldías a los diferentes puntos de venta así

incrementando la confianza del

consumidor. PLANTEAMIENTO DE PROBLEMA ¿Cómo realizar el análisis microbiológico de los niveles de contaminación de la Salmonella spp en pescado fresco en el laboratorio de microbiología de la carrera Bioquímica Farmacia durante la gestión 2017? METODOLOGÍA DE ESTUDIO: Es un estudio descriptivo y experimental porque el presente trabajo requiere de una investigación-análisis microbiológica.

Población: criadero del sector aguas calientes del municipio de Llallagua, expendio público del municipio de Llallagua y expendio público de la ciudad de La Paz. Muestra: pescados frescos. OBJETIVOS Objetivo General Determinar el análisis microbiológico de los niveles de contaminación de la Salmonella spp en pescado fresco en el laboratorio de microbiología de la carrera Bioquímica Farmacia durante la gestión 2017. Objetivos específicos  Identificar la Salmonella spp en la muestra de pescado fresco del sector aguas calientes mediante el medio de cultivo agar ss y el caldo Tetrationato.  Realizar la técnica de Tinción Gram para comprobar la presencia de la bacteria Salmonella spp en muestra de pescado fresco del expendio público de la ciudad de la Paz.  Emplear las diferentes pruebas bioquímicas para identificar la presencia de la bacteria Salmonella spp en muestra de pescado fresco del expendio público de la ciudad del Municipio de Llallagua.  Describir el fundamento del Agar ss , Caldo Tetrationato , Tinción Gram utilizados para la identificación de la bacteria Salmonella spp en muestra de pescado fresco. INTRODUCCIÓN El pescado aporta un buen balance de proteínas de alto valor biológico, vitaminas tanto hidrosolubles como liposolubles, algunos elementos minerales y un contenido calórico relativamente bajo. Las ventajas que presenta el consumo habitual de pescado están bien demostradas pero hay que considerar dos aspectos importantes; uno, su durabilidad y otro, la posibilidad de que sea vehículo de organismos agentes de infecciones e intoxicaciones alimentarias. Es bien sabido que los pescados son de los primeros en las listas de alimentos relacionados con enfermedades de origen alimentario aunque una gran proporción corresponde a intoxicaciones por biotoxinas e histamina (aprox. 80%) o a infecciones por virus. Sin embargo, los productos de la pesca también pueden ser vehículo de muchas de las bacterias patógenas que causan enfermedades en el hombre vía los alimentos. Son las bacterias las que más influyen

en la vida útil del pescado aunque no todas las que están presentes en el momento de la captura o recogida van a ser capaces de multiplicarse durante el almacenamiento. Sólo una parte de éstas acabará dominando y será, en última instancia, responsable de la alteración. La alimentación, la época del año, el área geográfica, la especie de pescado y el sistema de captura son determinantes del número y tipo de bacterias presentes inicialmente; mientras que las condiciones de almacenamiento van a seleccionar la flora alterante. Evidentemente, todas las manipulaciones de que sea objeto la pescadora la captura o recogida van a afectar de forma notable a la calidad microbiológica del mismo. Los riesgos asociados al consumo de pescado y productos de la pesca pueden ser de naturaleza biológica o química. Entre los primeros se pueden diferenciar los causados por microorganismos, bacterias y virus, y por parásitos. Las bacterias patógenas humanas transmitidas por el pescado se pueden dividir en dos grupos: uno constituido por géneros y especies cuyo hábitat natural es el agua (Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae Plesiomonas shigelloides, Edwardsiella tarda, Aeromonas móviles, etc.) Y otro que incluye bacterias presentes en el agua pero procedentes de contaminación de origen fecal y/o asociadas con el procesado y la manipulación posterior del pescado (Salmonella spp, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus). Salmonella spp. Se encuentra distribuida a nivel mundial. Es un agente zoonótico importante y ha sido aislada a partir de una gran variedad de peces y crustáceos capturados en aguas contaminadas con heces pueden portar este microorganismo. HIPOTESIS: Alternativa: Las muestras analizadas de pescado fresco (trucha) mediante el medio de cultivo agar ss y caldo tetrationato evidentemente dieron un resultado positivo en Salmonella spp en comparación al agar TSI, agar SIM analizadas en el laboratorio de microbiología de la carrera Bioquímica Farmacia. Nula: Las muestras analizadas de pescado fresco (trucha) mediante el medio de cultivo agar TSI, agar SIM dieron un resultado negativo en Salmonella spp en comparación del agar

ss y caldo tetrationato analizadas en el laboratorio de microbiología de la carrera Bioquímica Farmacia.

7. MARCO TEÓRICO:

Taxonomía Dominio:

Bacteria

Filo: Clase: Orden: Familia: Género:

Proteobacteria Gammaproteobacteria Enterobacteriales Enterobacteriaceae Salmonella

Características del Pescado.-

El pescado, en general, es un alimento rico en

proteínas de alto valor biológico, las cuales contienen todos los aminoácidos esenciales, también es rico en grasas que contienen una alta proporción de ácidos grasos insaturados, así como en vitaminas y minerales. Esta composición tan adecuada para la nutrición humana, lo es también para los microorganismos que normalmente se localizan a nivel de las branquias, mucus que recubre la piel y contenido abdominal y que, durante su crecimiento tras la muerte del animal, lo irían descomponiendo progresivamente, si no se le pusiese freno al proceso. En este proceso de descomposición también intervienen las propias enzimas del

animal que, del mismo modo que los microorganismos, degradan las proteínas, grasas, etc,.. Por todos estos motivos se dice que el pescado (al igual que la carne, leche, etc.) es un alimento muy perecedero, es decir que se altera rápidamente, lo que requiere que sea mantenido en las debidas condiciones de conservación hasta que sea consumido y que sea adquirido lo más fresco posible. El grado de frescura con que el producto llega al mercado y por tanto se pone al alcance del consumidor, es un factor de gran importancia en relación con la calidad del pescado. Las características se pueden apreciar fácilmente a través de los sentidos, como la vista, olfato, tacto, etc., (por lo que se denominan características organolépticas), observando su aspecto general, consistencia, color, olor, etc. 

Respiración a través de branquias, un grupo muy reducido cuenta con respiración pulmonar.



Sus ojos carecen de párpados.



Inexistencia de órganos sexuales externos, generalmente las gónadas se encuentran en el interior de su cuerpo a excepción de algunas especies.



La mayoría de ejemplares poseen una excelente capacidad visual, su olfato, en cambio, está menos desarrollado, aunque cuentan con órganos sensoriales muy desarrollados para detectar vibraciones, presencia de enemigos…



Son heterotermos, es decir, no pueden regular su temperatura corporal sin la ayuda de un medio externo.



Carecen de miembros para la locomoción, éstos son sustituidos por aletas con diversidad de funciones.



En la mayoría de los casos su cerebro es pequeño en comparación con el cuerpo.



Su piel está revestida de escamas, aunque existen excepciones.



El cuerpo es fusiforme en la mayoría de especies.

Cuentan con esqueleto interno.



CARACTERÍSTICAS MORFOLOGICAS DE LA SALMONELA spp.         

Son bacilos gran negativos Miden de 0,7-1,5um de ancho por 2-5um de largo Móviles flagelos No desarrollan capsula ni forman esporas La parad celular posee el antígeno “Ag” somatico “O” Los flagelos representan el “Ag” flagelar “H” Algunas salmonelas poseen capsula. Antígeno K en la capsula Salmonella puede crecer entre7-49 grados y sobrevive a una temperatura de 3

grados pero no se multiplica  Crese a un pH que varía entre 4-9 TAXONOMIA       

Dominio: bacteria Filo: proteobacteria Clase: gammaproteobacteria Orden: enterobacteriales Familia: enterobacteriaceae Género: Salmonella Especie: Salmonella spp.

Salmonella pertenece a un grupo de bacterias que están presentes en el intestino de personas y animales sanos, de forma que las heces son el principal foco de contaminación a los alimentos y al agua. La transmisión tiene lugar por vía fecal – oral por medio de la cual el contenido intestinal de un animal infectado es ingerido con un alimento o con el agua. Cuando llega a los alimentos frescos, tiene la habilidad de multiplicarse muy rápidamente y cuando una persona ingiere dicho alimento

contaminando

el

gran

número

de

bacterias

provoca

salmonelosis

infección

gastrointestinal provocada por dicha bacteria. Los factores que cooperan en los brotes son principalmente el tiempo de uso incorrecto de la temperatura y un tratamiento térmico insuficiente. También en alimentos sin pasteurizar como leche y sobre todo en la cáscara de los huevos frescos de aves de corral ya que contienen heces o materia fecal de la cloaca de la gallina. Los productos vegetales como por ejemplo las hortalizas que se utilizan para preparar ensaladas, han sido relacionados con brotes accidentales de fiebre tifoidea y salmonelosis, debido a la utilización de agua de riego contaminada o de deyecciones humanas y de estiércol de los animales como abono. FUNDAMENTO DE SALMONELLA SHIGELLA AGAR. ( AGAR SS) Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. Y de algunas especies de Shigella spp. A partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche

su

presencia.

Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, está dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría

de

los

coliformes

y

el

desarrollo

invasor

del

Proteus

spp.

Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido sulfhídrico

a

partir

del

tiosulfato

de

sodio.

Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas

o

rojas

sobre

un

fondo

rojizo.

Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en

el

medio

de

cultivo,

y

producen

colonias

transparentes.

La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro negro debido a

la

formación

de

sulfuro

de

hierro.

Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente la muestra en Selenito caldo (B02-120-05). COMPOSICION: Fórmula (en gramos por litro) Pluripeptona Extracto de carne Lactosa Mezcla de sales biliares Citrato de sodio Tiosulfato de sodio Citrato férrico Agar Verde brillante Rojo neutro pH final: 7.0 ± 0.2

Instrucciones 5.0 5.0 10.0 8.5 8.5 8.5 1.0 13.5 0.00033 0.025

Suspender 60 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta homogeneizar. Calentar a ebullición durante 2 o 3 minutos. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50°C y distribuir unos 20 ml por placa. Secar la superficie del medio unos minutos en la estufa.

SIEMBRA: Sembrar por estriado la superficie del medio de cultivo. INCUBACIÓN: Durante 24-48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis. CONSERVACIÓN Y CADUCIDAD Todos los contenedores de medios de cultivo deshidratados deben permanecer herméticamente cerrados y almacenados en un lugar seco a 10 a 25°C hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del envase. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Después de la incubación,

registrar el crecimiento de microorganismos. Las

características típicas a observar incluyen: tamaño de la Colonia, color y morfología.

Después del crecimiento nocturno, los no fermentadores de lactosa, aparecerán como colonias sin color mientras que cualquier comensal fermentador de lactosa que sea hábil para crecer en el medio aparecerá en forma de colonias rosa o rojas. La mayoría de las Salmonella y Shigella son no-lactosa fermentantes y aparecen como colonias sin color. Las Salmonella a menudo aparecerán con un punto negro en el centro que indica producción de H2S.

FUNDAMENTO DE AGAR TETRATIONATO CALDO. Medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonella spp. a partir de

heces,

orina,

alimentos

y

otros

materiales

de

importancia

sanitaria.

El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, y carbonato de sodio que neutraliza y absorbe metabolitos tóxicos. La selectividad está dada por la presencia de tiosulfato de sodio, tetrationato (generado en el medio por el agregado de la solución iodo-iodurada) y sales biliares, los cuales permiten el desarrollo de bacterias que contienen la enzima tetrationato reductasa,

como ser la Salmonella spp. e inhiben el desarrollo de la flora acompañante. Para evitar la proliferación de especies de Proteus spp., se recomienda agregar 40 mg/l de Novobiocina, antes de la solución iodada COMPOSICION:

Fórmula (en gramos por litro) Peptona 5.0 Sales biliares 1.0 Carbonato de calcio 10.0 Tiosulfato de sodio 30.0 pH final: 8.4 ± 0.2 Solución iodo iodurada Iodo 6.0 Ioduro de potasio 5.0

Instrucciones Suspender 46 g del polvo en 1 litro de

agua

destilada.

Mezclar

vigorosamente y llevar a ebullición. Enfriar a 45°C o menos. Agregar 20 ml de solución iodurada. Mezclar y distribuir 10 ml por tubo, en tubos estériles. No debe calentarse luego de agregar la solución iodada. El medio base puede mantenerse a

Agua

20.0

4°C , dura varios meses, pero una vez agregada la solución iodada debe usarse en el mismo día.

SIEMBRA Puede realizarse la siembra partiendo de un caldo de preenriquecimiento o en forma directa conservando la proporción 1:10. INCUBACIÓN Durante 12-24 horas a 35-37 ºC, en aerobiosis. FUNDAMENTO DE TINCION GRAM El fundamento de esta técnica se basa en la diferenciación entre las paredes celulares de Las bacterias Gram positivas y Gram negativas.

La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano además de acidos teicoicos. Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las Gram negativas es delgada y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior

por medio de

lipoproteínas la membrana exterior está compuesta de proteína, fosfolípido y lipopolisacarido. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las gram negativas es soluble en solventes orgánicos (mezcla de alcohol acetona). La capa de péptido glicano que posee es delgada como para poder retener el primer colorante el cristal violeta y por lo tanto se pierde la coloración azul violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas poseen una pared celular gruesa en péptidoglicano, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escapar el primer colorante y mantiene la coloración azul violáceo. RESULTADOS Bacterias Gram Positivas = Color Violeta Formas redondeadas abastonadas. Bacterias Gram Negativas = Color Rojo o Rosado Formas redondeadas abastonadas. PRUEBAS BIOQUÍMICAS: Para identificar el género Salmonella spp. Se realiza dos pruebas bioquímicas de tamizaje: 1. Agar Lisina Hierro (LIA). 2. Agar Simmons Citrato. 3. Agar SIM. 4. Agar Triple Azúcar Hierro (TSI).

FUNDAMENTO DE AGAR LISINA HIERRO (LIA). Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico. En el LIA hay glucosa en escasa cantidad y la lisina es la principal fuente de energía. Para aprovechar la lisina la bacteria necesita tener alguna de las enzimas que la pueda degradar. Enzima lisina descarboxilasa (anaerobios). Enzima lisina desaminasa (aerobios). En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el carbohidrato fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y desaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro. COMPOSICION:

Fórmula (en gramos por litro) Peptona de gelatina 5.0 Extracto de levadura 3.0 Glucosa 1.0 Lisina 10.0 Citrato de hierro y amonio 0.5 Tiosulfato de sodio 0.04 Púrpura de bromocresol 0.02 Agar 15.0 pH final: 6.7 ± 0.2

FUNDAMENTO DE AGAR SIMMONS CITRATO. Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía. Fundamento En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa. Fórmula Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar en posición inclinada. Siembra A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inóculo ligero , usando una ansa sin arrastrar el agar. Incubación A 35-37 ºC, durante 24-48 horas, en aerobiosis. Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 días de incubación. Resultados -Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.

-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color Limitaciones -Si se usa un inóculo denso para sembl medio de cultivo, puede variar el color del pico del verde al amarillo-amarronado. Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede afectar la visualización azul de un resultado positivo. -Inóculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos. -Cuando se siembra una serie de pruebas bioquímicas a partir del mismo cultivo, se debe esterilizar la aguja de inoculación antes de inocular la prueba del citrato o sino inocularla primero. Cualquier arrastre de materia orgánica puede originar resultados falsos positivos.

Características del medio Medio preparado: verde. Almacenamiento Medio deshidratado: a 10-35 ºC. Medio preparado: a 2-8 ºC.

FUNDAMENTO DE AGAR SIM (SULFURO-INDOL-MOTILIDAD): Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae. El triptófano es un constituyente peptonas, mente que

de y

de

la

puede

ser

algunas

bacterias

indol.

En

el

aminoácido

Fórmula (en gramos por litro)

muchas

Tripteína

20.0

Peptona

6.1

Sulfato de hierro y amonio

0.2

tripteína,

Tiosulfato de sodio

0.2

oxidado por

Agar

3.5

para formar

pH final: 7.3 ± 0.2

Particular-

proceso

interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

FUNDAMENTO DE AGAR TSI Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico. En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe 3+ , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro. Fórmula (en gramos por litro) Extracto de carne

3.0

Pluripeptona

20.0

Cloruro de sodio

5.0

Lactosa

10.0

Sacarosa

10.0

Glucosa

1.0

Sulfato de hierro y amonio

0.2

Tiosulfato de sodio

0.2

Rojo de fenol

0.025

Agar

13.0

pH final: 7.3 ± 0.2

PARTE EXPERIMENTAL DE LA BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA.

MATERIALES Y MÉTODOS - Aislamiento de Salmonella spp: Se analizaron un total de 50 muestras de pescado fresco expendido en diferentes lugares de venta de la ciudad de Pamplona, 25 correspondieron a muestras de lugares formalmente establecidos y las otras 25 fueron obtenidas a partir de las ventas callejeras de la Ciudad. Para el aislamiento de Salmonella spp. Se realizó la comparación entre la técnica tradicional y la basada en el empleo del Caldo Salmosyst de la siguiente manera: para el método tradicional, se tomaron 25 g de la muestra y se homogeneizaron en 225 ml de agua de peptona tamponada de Merck™ incubando a 37°C por 18-20 horas. Posteriormente se tomaron 0,1 ml y seinocularon en 10 ml de caldo RappaportVassiliadis de Merck™, incubando a 42°C/ 24 horas. Transcurrido este tiempo, se transfirió una asada sobre placas con agar XLD y Rambach de Merck™. Las colonias presuntivas se transfirieron a placas con Agar Nutritivo y se identificaron como se describe más adelante. Para el protocolo Salmosyst se siguieron las siguientes instrucciones: Tomar 25 g de la muestra y homogeneizar en 225 ml de caldo base Salmosyst de Merck™ incubando a 37°C por 5 horas. Transferir 10 ml de este caldo a un tubo estéril y adicionar una pastilla de Salmosyst y dejar 30 minutos en reposo. Posteriormente agitar vigorosamente e incubar a 37°C/ 18 - 22 horas. Luego tomar 0,1 ml o una asada sembrando sobre placas con agar XLD y Rambach de Merck™ incubando a 37ºC por 24 horas. Con el fin de someterlas a pruebas de identificación, se recogieron colonias típicas al azar que se subcultivaron en agar nutritivo. Las colonias típicas en Agar XLD, rojas con o sin centro negro y en Rambach, rojas, se transfirieron a Agar Nutritivo. - Identificación: A partir de las cepas crecidas sobre el agar nutritivo, se realizaron las pruebas de tinción de Gram, oxidasa y catalasa. Las cepas que resultaron ser bacilos Gram negativos, catalasa positiva y oxidasa negativas se identificaron mediante las siguientes pruebas: 1. Siembra en TSI: La reacción típica de Salmonella en este medio es producción o no de H2S, pico alcalino y fondo ácido.

3.

Rojo

de

Metilo-Voges

Proskauer: La mayoría de

las cepas de Salmonella dan una reacción positiva al rojo de metilo y negativa para la del Voges Proskauer. 4. Siembra en SIM: La mayoría de las cepas de Salmonella dan una reacción positiva al Ácido Sulfhídrico, negativa al indol (noproducción de un anillo rojo en la superficie del caldo) y positiva a la motilidad. 5. Siembra en Agar LIA: La reacción típica de Salmonella es fondo alcalino (púrpura) con o sin producción de H2S. 6. Siembra en medio con Citrato: La mayoría de las cepas de Salmonella son citrato positivo.

PROCEDIMIENTO: Esquematización del procedimiento del agar SS:

PROCEDIMIENTO DE TINCION GRAM 1.-

2.-

Realizar el frotis bacteriológico en forma circular, tomando de la placa con la ayuda de una asa, de una colonia representativa.

COLORANTE PRIMARIO: Cubrir el frotis con violeta de genciana por 2 minutos, luego lavar con agua corriente

Fijar la muestra pasando el portaobjetos sobre la llama del mechero a una temperatura de 3840°C.

2D

3.-

Cubrir el frotis con lugol por 1 minuto, luego lavar con agua corriente.

4.-

Decolorar el frotis con alcohol acetona al 95% por 1 minuto, luego lavar con agua corriente.

5.-

COLORANTE SECUNDARIO: Cubrir el frotis con fucsina básica por 2 minutos, luego lavar con agua corriente. Secar al medio ambiente

6.-

Observar al microscopio óptico con el objetivo de 100X, con una gota de aceite de inmersión al portaobjeto.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS: ESQUEMATIZACIÓN DEL PROCEDIMIENTO DEL AGAR LIA: Realizar Cálculos Matemáticos:

35g…………..1000ml X………………40ml X= 1.40g para 40ml de H2O.

En un matraz Erlenmeyer suspender 1,40g del agar pesado + 40ml de agua destilada. El medio del preparado es de color violeta.

Dejar en reposo por 5 minutos. Llevar a estufa, calentar agitando con frecuencia y ebullición por 2 minutos hasta la disolución completa. Dejar enfriar a 45ºC con su respectivo capuchón el matraz.

Esterilizar a 121°C durante 15 minutos y distribuir en 10 tubos de ensayo a 4ml. Enfriar en pico de flauta los tubos.

Realizar el sembrado con el asa bacteriológica la colonia positiva del agar ss. En pico de flauta.

Esquematización del procedimiento del agar Simmons Citrato: Realizar Cálculos Matemáticos:

En un matraz Erlenmeyer suspender 0.97g del agar pesado + 40ml de agua destilada.

Dejar en reposo por 5 minutos. Llevar a estufa, calentar agitando con frecuencia y ebullición por 2 minutos hasta que la disolución sea completa. Llevar autoclave a 121ºC. durante 15 minutos. Retirar y dejar de enfria un poco.

Distribuir inmediatamente en 10 tubos de ensayo a 4ml, Enfriar en pico de flauta los tubos.

24.2g…………..1000ml X………………40ml X= 0.97 g para 40ml de H2O.

Realizar el sembrado con la asa bacteriológica por picadura profunda con aguja y luego por estrías. luego incubar 24 a 48 horas. Posteriormente observar la coloración.

ESQUEMATIZACIÓN DEL PROCEDIMIENTO DEL AGAR SIM: Realizar Cálculos Matemáticos:

30g…………..1000ml X………………40ml X= 1.2 g para 40ml de H2O.

En un matraz Erlenmeyer suspender 1,2g del agar pesado + 40ml de agua destilada.

Dejar en reposo por 5 minutos. Llevar a estufa, calentar agitando con frecuencia y ebullición por 2 minutos hasta que la disolución sea completa. Dejar enfriar a 45ºC con su respectivo capuchón el matraz.

Distribuir en 10 tubos de ensayo a 4ml y esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar en pico de flauta los tubos.

Realizar el sembrado con la asa bacteriológica la colonia positiva del agar ss. Realizar Cálculos Matemáticos: en pico de flauta.

X= 2.5g para 40ml de H2O. Medio preparado: color ambar 62.5g…………..1000ml X……………… ESQUEMATIZACIÓN DEL PROCEDIMIENTO DEL AGAR TSI: 40ml X= 2,5 gr

En un matraz Erlenmeyer suspender 2,5g del agar pesado + 40ml de agua destilada.

Dejar en reposo por 5 minutos. Llevar a estufa, calentar agitando con frecuencia y ebullición por 2 minutos hasta que la disolución sea completa. LLEVAR A AUTOCLAVE a 121°C durante 15 minutos. Dejar enfriar a 45ºC con su respectivo capuchón el matraz.

Distribuir en 10 tubos de ensayo a 4ml . Enfriar en pico de flauta los tubos.

Realizar el sembrado con la asa bacteriológica la colonia positiva del agar ss. en pico de flauta.

RESULTADOS: MEDIO DE CULTIVO AGAR SS. MUESTRAS SEMBRADO

CRECIMIENTO BACTERIANO

MERCADO

2 Placas

17 Placas

(Placas #2, #15)

OBSERVACION DE LAS PLACAS

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Presentan colonias con Centro negro. (Productoras de Ácido sulfúrico)

LA PAZ

12 Placas

6 Placas

Garachi

Placas:

Ispi

Garachi #4 ;#5

Mauri

Ispi #2; #3; #4

Presencia del cambio de color ennegrecimiento del medio debido a la liberación de sulfuros.

Mauri #1 AGUAS 20 Placas CALIENTES

1 Placas (Placa # 5)

Trucha TOTAL

49 Placas

9 Placas

Cambio de color negruzco debido a la liberación de sulfuros

TINCIÓN GRAM:

PROCEDENCIA DE LA MUESTRA LA PAZ

NÚMERO DE MUESTRA Karachi Placa N°4 Placa N°5

LLALLAGUA

Trucha Placa N°2 Placa N°15

AGUAS CALIENTES

Trucha Placa N°5

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

PRUEBAS BIOQUÍMICAS: Resultados de la prueba bioquímica agar LIA:

INTERPRETACION DE LA OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA Se observó bacilos Gram (-). De color rosado debido al segundo colorante fucsina básica, además tienen la capacidad de retener el segundo colorante debido a a la presencia de la capa externa compuesta de lipopolisacaridos, no retienen el primer colorante debido a la capa delgada de peptidoglicanos. Se observó bacilos Gram (-) y cocos aislados de color rosado debido al segundo colorante fucsina básica, además tienen la capacidad de retener el segundo colorante debido a a la presencia de la capa externa compuesta de lipopolisacaridos, no retienen el primer colorante debido a la capa delgada de peptidoglicanos. Se observó cocos Gram (-) de color rosado debido al segundo colorante fucsina básica, además tienen la capacidad de retener el segundo colorante debido a a la presencia de la capa externa compuesta de lipopolisacaridos, no retienen el primer colorante debido a la capa delgada de peptidoglicanos.

Procedencia de la muestra de pescado. Criadero del sector aguas calientes

Expendio público Llallagua

Numero de muestras positivas Muestra Nº 5 (TRUCHA)

resultados

Interpretación de resultados

Lisina positiva

La muestra Nº 5 de pescado trucha del criadero del sector aguas calientes dio un resultado positivo, porque la la bacteria Salmonella spp. utilizo la lisina como su fuente de energía lo cual se evidencio mediante la presencia de la enzima lisina descarboxilasa dando una coloración de pico violeta/fondo violeta. La muestra Nº 2 de pescado especie pejerrey del expendio público Llallagua dio un resultado positivo, porque la bacteria Salmonella spp. utilizo la lisina como su fuente de energía lo cual se evidencio mediante la presencia de la enzima lisina descarboxilasa dando una coloración de pico violeta/fondo violeta.

Muestra Nº 2 (PEJERREY)

Lisina positiva Expendio público Llallagua

Muestra Nº 15 (PEJERREY)

La muestra Nº 15 de pescado especie pejerrey del expendio público Llallagua dio un resultado positivo, porque la bacteria Salmonella spp. utilizo la lisina como su fuente de energía lo cual se evidencio mediante la presencia de la enzima lisina descarboxilasa dando una coloración de pico violeta/fondo violeta.

Lisina positiva Expendio público de La Paz

Muestra Nº 4 (QARACHI)

Lisina positiva Expendio público de La Paz

Muestra Nº 5 (QARACHI)

Lisina positiva

La muestra Nº 4 de pescado especie qarachi del expendio público de La Paz dio un resultado positivo, porque la la bacteria Salmonella spp. utilizo la lisina como su fuente de energía lo cual se evidencio mediante la presencia de la enzima lisina descarboxilasa dando una coloración de pico violeta/fondo violeta. La muestra Nº 5 de pescado especie qarachi del expendio público de La Paz dio un resultado positivo, porque la la

AGAR CITRATO SIMMONS. MUESTRTA Muestra 1

RESULTADO negativo

La paz(mauri) Muestra2

el citrato como fuente de Positivo

La paz(Ispi) Muestra 3

OBSERVACIONES La bacteria no consume carbono La bacteria consume el citrato como fuente de

positivo

carbono La bacteria consume el

La paz (Ispi)

citrato como fuente de

Muestra4

carbono La bacteria consume el

positivo

La paz (Ispi)

citrato como fuente de

Muestra4

carbono La bacteria consume el

positivo

La paz(carachi)

citrato como fuente de

Muestra5

carbono La bacteria consume el

positivo

La paz(carachi)

citrato como fuente de

Muestra5

carbono La bacteria consume el

positivo

Aguas calientes(trucha)

citrato como fuente de

Muestra 15

carbono La bacteria consume el

positivo

Mercado ( pejerrey)

citrato como fuente de carbono

Muestra 2 Mercado pejerrey)

positivo

La bacteria consume el citrato como fuente de carbono

Resultados de la prueba bioquímica agar SIM:

Procedencia de la muestra de pescado.

Numero de muestras positivas

Resultados

Interpretación de resultados

Criadero del sector aguas calientes

Muestra Nº 5 (TRUCHA)

Positivo (+)

Cambio de color negruzco debido a la liberación de sulfuros

Expendio público Llallagua

Muestra Nº 2 (PEJERREY)

Positivo (+)

Presencia del cambio de color ennegrecimiento del medio debido a la liberación de sulfuros.

Expendio público Llallagua

Muestra Nº 3 (PEJERREY)

Positivo (+)

Presencia del cambio de color ennegrecimiento del medio debido a la liberación de sulfuros.

Expendio público de La Paz

Muestra Nº 5 (QARACHI)

Positivo (+)

Presencia del cambio de color ennegrecimiento del medio en el pico del tubo color fuccia por la formacion de de un complejo entre el indol y el pdimetilaminobenzaldehido.

Expendio público de La Paz

Muestra Nº 2 (ISPI)

Positivo (+)

Presencia del cambio de color ennegrecimiento del medio debido a la liberación de sulfuros.

Expendio público de La Paz

Muestra Nº 3 (ISPI)

Positivo (+)

Presencia del cambio de color ennegrecimiento del medio debido a la liberación de sulfuros.

Expendio público de La Paz

Muestra Nº 1 (MAURI)

Negativo (-)

No se observó ningún cambio de color en la muestra como en todo el tubo de ensayo

RESULTADOS DE LA PUEBA BIOQUIMICA AGAR TSI PROCEDENCI A DE LA MUESTRA DE PESCADO. CRIADERO DEL SECTOR AGUAS CALIENTES

NUMERO DE MUESTRAS Muestra Nº 5 (TRUCHA)

Muestra Nº 2 (PEJERREY) EXPENDIO PÚBLICO LLALLAGUA

Muestra Nº 3 (PEJERREY) EXPENDIO PÚBLICO LLALLAGUA

Muestra Nº 5 (QARACHI) EXPENDIO PÚBLICO DE LA PAZ

EXPENDIO PÚBLICO DE LA PAZ EXPENDIO PÚBLICO DE LA PAZ Expendio público de La Paz

RESULTADOS Positivo

(+)

Se produjo el cambio de color negro, debido a la liberación de sulfuros.

Positivo

(+)

Se produjo el cambio de color a color negro, debido a la liberación de sulfuros.

Positivo

(+)

Se produjo el cambio de color negro.

Positivo

(+)

Hubo cambio de color a color negruzco.

Muestra Nº 2 (ISPI)

Positivo

Muestra Nº 3 (ISPI)

Positivo

Muestra Nº 1 (MAURI)

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

(+) (+) Negativo (-)

Presencia del cambio de color a color negro del medio debido a la liberación de sulfuros. cambio de color a color negruzco, debido a la liberación de sulfuros. No hubo ningún cambio de color, por tal razón dio un resultado negativo.

ESTADÍSTICA DE RESULTADOS:

MEDIO DE CULTIVO AGAR SS:

PRUEBAS BIOQUÍMICAS.

RESULTADOS DE AGAR LIA: Nº de muestras: 45 pescados Procedencia de la muestra

Nº de

Muestras positivas de

muestra Salmonella spp. en Agar Expendio público de La Paz Expendio público de Llallagua Criadero del Sector Aguas Calientes Número total

LIA 5 2 1 8

15 15 15 45

Interpretación de resultados:  Del expendio público de La Paz

de las 15 muestras de pescado (especies

qarachi, ispi) 5 muestras dieron un resultado positivo y 1 muestra de pescado (especie mauri) dio un resultado negativo en Salmonella spp.  Del Expendio público de Llallagua de las 15 muestras de pescado (pejerrey), 2 muestras dieron un resultado positivo en Salmonella spp.  Del Criadero del Sector Aguas Calientes de las 15 muestras (trucha) de pescado,1 muestras dio un resultado positivo en Salmonella spp.

RESULTADOS DE AGAR CITRATO SIMMONS:

Nº de muestras: 45 pescados Procedencia de la muestra

Nº de

Muestras positivas de

muestra Salmonella spp. en Agar Expendio público de La Paz Expendio público de Llallagua Criadero del Sector Aguas Calientes Número total

15 15 15 45

Citrato Simmons 5 2 1 8

Interpretación de resultados:  Del expendio público de La Paz

de las 15 muestras de pescado (especies

qarachi, ispi) 5 muestras dieron un resultado positivo y 1 muestra de pescado (especie mauri) dio un resultado negativo en Salmonella spp.  Del Expendio público de Llallagua de las 15 muestras de pescado (pejerrey), 2 muestras dieron un resultado positivo en Salmonella spp.  Del Criadero del Sector Aguas Calientes de las 15 muestras de pescado (trucha),1 muestras dio un resultado positivo en Salmonella spp.

AGAR SIM: N° de muestras: 45 pescados

Procedencia de la muestra

N° de muestra

Muestras positivas de salmonella spp. en Agar LIA

Expendio público de La Paz

15

4

Expendio público de Llallagua

15

2

Criadero del sector aguas Calientes

15

1

Número total

45

7

I nterpretación de resultados:  Del expendio público de La Paz

de las 15 muestras de pescado (especies

qarachi, ispi) 5 muestras dieron un resultado positivo y 1 muestra de pescado (especie mauri) dio un resultado negativo en Salmonella spp.  Del Expendio público de Llallagua de las 15 muestras de pescado (pejerrey), 2 muestras dieron un resultado positivo en Salmonella spp.

 Del Criadero del Sector Aguas Calientes de las 15 muestras de pescado (trucha),1 muestras dio un resultado positivo en Salmonella spp.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS. RESULTADOS DE AGAR TSI: Nº de muestras: 45 pescados Procedencia de la muestra Expendio público de La Paz Expendio público de Llallagua Criadero del Sector Aguas Calientes Número total

Nº de

Muestras positivas de Salmonella spp. en Agar Citrato muestra Simmons 15 4 15 2 15 1 45 7

Interpretación de resultados:  Del expendio público de La Paz

de las 15 muestras de pescado (especies

qarachi, ispi) 5 muestras dieron un resultado positivo y 1 muestra de pescado (especie mauri) dio un resultado negativo en Salmonella spp.  Del Expendio público de Llallagua de las 15 muestras de pescado (pejerrey), 2 muestras dieron un resultado positivo en Salmonella spp.  Del Criadero del Sector Aguas Calientes de las 15 muestras de pescado (trucha),1 muestras dio un resultado positivo en Salmonella spp.