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El uso de la electroforesis bidimensional para identificar biomarcadores séricos de pacientes con dengue hemorrágico Resumen La infección por dengue es un importante problema de salud pública que afecta a millones de personas que viven en países tropicales. Sin vacunas adecuadas y medicamentos antivirales específicos, el tratamiento para el dengue suele ser sintomático y de apoyo. Por lo tanto, el diagnóstico temprano y el reconocimiento de la enfermedad grave es crucial para un mejor manejo del paciente. La electroforesis bidimensional se utilizó para identificar proteínas asociadas a la enfermedad que se pueden utilizar para el diagnóstico y como objetivos farmacológicos para el tratamiento. Se encontró que dos marcadores, identificados por análisis de espectrometría de masas como 􏰀1-antitripsina y proteínas NS1, estaban regulados por aumento en pacientes con fiebre del dengue (DF; n = 10) y fiebre hemorrágica del dengue (DHF; n = 10) en comparación con individuos sanos (n = 8) Ambas proteínas 􏰀1-antitripsina y NS1 se sobreexpresaron dos veces en pacientes con DHF en comparación con pacientes con DF. Nuestro estudio sugiere que la 􏰀1-antitripsina y la proteína NS1 podrían usarse como biomarcadores como indicadores tempranos de riesgo de FHD entre pacientes con sospecha de infección por dengue. Introducción El dengue es una enfermedad viral endémica que afecta a países tropicales y subtropicales, predominantemente en áreas urbanas y suburbanas. Fiebre del dengue (DF) y sus formas más graves, conocida como dengue hermorrágico (DHF) y síndrome de dengue shok (DSS), son importantes problemas de salud pública que han tenido un gran impacto en los sistemas de salud en algunos países como resultado del aumento mortalidad y morbilidad.2 El virus del dengue es un virus de ARN encapsulado de cadena positiva y está compuesto por tres genes de proteínas estructurales, que codifican la proteína central (C), una proteína asociada a la membrana (M) y una proteína de envoltura (E), y siete proteínas no estructurales ( NS) genes proteicos.3 Existen cuatro tipos de virus, conocidos como DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4, y la infección con cualquier tipo no proporciona protección cruzada contra los otros tipos. El tratamiento suele ser de apoyo en función de los síntomas presentados. Sin una vacuna o profilaxis y un tratamiento antiviral específico, el diagnóstico precoz del dengue, especialmente la DHF, es crucial para un mejor manejo de los pacientes. La electroforesis en gel de dos dimensiones (2-DE) ofrece un enfoque poderoso para identificar proteínas asociadas a enfermedades que pueden usarse como biomarcadores para el diagnóstico y también para objetivos de fármacos o diseño de vacunas. La técnica tiene la capacidad de mostrar, cuantificar e identificar miles de proteínas en un solo gel y, posteriormente, puede usarse para detectar diferencias en los estados celulares entre el estado sano y el estado infectado o enfermo.4 El método introducido por O'Farrell5 implica la separación de proteínas en componentes individuales en función de su carga de proteínas y peso molecular; así, el perfil de proteína resultante ofrece la identificación de una sola proteína, como en un punto. Esta técnica se puede utilizar para identificar, investigar y atacar proteínas que se expresan diferencialmente en individuos sanos y enfermos y, por lo tanto,

potencialmente puede conducir al desarrollo de mejores diagnósticos y pruebas de pronóstico y permitir una terapia individualizada por el paciente. En este estudio, se recogieron muestras de suero de pacientes con DF y DHF e individuos sanos y se sometieron a 2-DE. Los niveles de expresión de proteínas se compararon para los tres grupos. Se eligió el análisis de imagen 2-DE para comparar el perfil de expresión diferencial para los tres grupos, ya que tiene la capacidad de medir directamente las proteínas presentes en las células sin más manipulaciones.4 En nuestro estudio, ya que estábamos usando muestras de suero de pacientes infectados con dengue quienes difieren en la gravedad de la enfermedad, en teoría se deben ver las diferencias en los niveles de expresión de proteínas. Esperábamos identificar algunas proteínas en pacientes con DHF que se expresan de manera diferencial en comparación con pacientes con DF o individuos sanos y que también se presentan lo suficientemente temprano en estos pacientes. Esperamos que estas proteínas puedan utilizarse como biomarcadores predictores de DHF. 2. Materiales y métodos 2.1. Pacientes y controles Se obtuvo sangre simple (3 ml cada una) de pacientes ingresados en el Centro Médico de la Universidad de Malaya (UMMC), Kuala Lumpur, Malasia, con consentimiento por escrito. Se clasificaron como DF o DHF utilizando el esquema de clasificación de dengue de la OMS y la definición de casos.7 Hubo un total de 10 pacientes con DF (seis hombres, cuatro mujeres) y 10 pacientes con DHF (todos con enfermedad de Grado 1 o Grado 2; seis hombres, cuatro hembras). Todas las muestras se obtuvieron del día 5 al día 7 después del inicio de la fiebre. Los pacientes tenían edades comprendidas entre 18 y 40 años. Además, también se obtuvo sangre de ocho individuos sanos como controles negativos (cuatro hombres, cuatro mujeres). Estos controles también se combinaron con los pacientes por edad, sexo y raza. 2.2. Determinación del estado del dengue. Las muestras de suero de todos los pacientes del estudio DF y DHF fueron sometidas a una batería de pruebas para determinar el estado del dengue. Estas pruebas incluyen el ELISA de captura de IgM interno para anticuerpos IgM, 8 PCR en tiempo real (RT) interno para ARN viral, 9 aislamiento viral para virus dengue10 e inhibición de la hemaglutinación (HI) para anticuerpos IgG totales.11 2.3. Procesamiento de muestras Las muestras de sangre se dejaron coagular a temperatura ambiente en tubos simples durante aproximadamente una hora. Los tubos se centrifugaron a 1500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. El suero se separó e inmediatamente se sometió a tratamiento con tampón de lisis de muestra. 2.4. Tratamiento del suero con tampón de lisis Para cada muestra, se mezclaron 30 l de suero con 18,0 l de SDS al 10% y DTT al 2,3% en un tubo estéril de 200 l. La mezcla se calentó a 90 ° C durante 10 minutos antes de agregar 250 l de tampón de lisis de muestra, que consiste en urea (9 mol / l), Chaps (4% p / v), DTT (0.8% p / v) y Pharmalyte (0,8% p / v), y vórtice. La mezcla se centrifugó a 14 000 rpm durante 10 minutos y el

sobrenadante resultante se dividió en alícuotas y se mantuvo a -80 ° C antes de un análisis posterior. 2.5. Cuantificación de proteínas y limpieza en 2-D La proteína total se cuantificó usando el kit 2-D QUANT (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia). Para los experimentos con 2-DE, se usó un total de 300 ug de muestra si las manchas de proteína debían teñirse con azul de Coomassie, un colorante compatible con el análisis de espectrometría de masas más abajo. Las muestras seleccionadas para el análisis proteómico se sometieron a una limpieza usando el kit de limpieza 2-D (Amersham) antes de proceder con las separaciones 1-D. Brevemente, se añadió precipitante (provisto en el kit de limpieza 2-D) a las muestras y se agitó vorticialmente antes de dejarlo en hielo durante 15 minutos. Luego se añadió un coprecipitante a la mezcla seguido de una etapa de centrifugación a 12 000 g durante 10 minutos. El sedimento se lavó nuevamente con coprecipitante y luego se resuspendió en agua Milli-Q estéril. Luego se añadieron 1 ml de tampón de lavado y 5 ul de aditivo de lavado a la suspensión antes de incubar la suspensión a -20 ° C durante 30 minutos. La suspensión se centrifugó luego durante 10 minutos a 12 000 g antes de resuspender el sedimento en una solución de rehidratación de muestra. 2.6. Separaciones unidimensionales La separación unidimensional se realizó utilizando el sistema de enfoque Ettan IPGphor (Amersham). Brevemente, las tiras de IPG (pH 3-10, 13 cm) se rehidrataron en muestras usando una bandeja de secado DryStrip (Amersham) durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, las tiras rehidratadas se transfirieron a un soporte de tiras Ettan IPGphor y se superpusieron con fluido de cubierta Drystrip. La separación 1-D se realizó a tres ciclos con las siguientes voltios-hora: ciclo 1, 500 voltios-hora; Ciclo 2, 1000 voltios-hora; y Ciclo 3, 14 500 voltios-hora, para dar un total de 16 500 voltios-hora. Una vez completadas las separaciones 1D, las tiras se mantuvieron inmediatamente en un tubo de vidrio limpio y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. 2.7. Electroforesis bidimensional La electroforesis bidimensional se llevó a cabo en un sistema de electroforesis en gel vertical (Amersham) de acuerdo con un protocolo descrito previamente.12 Después de esto, los geles se tiñeron con azul de Coomassie caliente. Luego, se adquirió y analizó la imagen proteómica para todos los controles DF, DHF y sanos utilizando un software ImageScanner e ImageMaster 2D Elite (GE Healthcare, San Francisco, CA, EE. UU.). La diferencia de volumen normalizada se calculó estadísticamente para todos los casos. Se seleccionaron puntos que fueron consistentemente y significativamente diferentes y se enviaron al Centro de Investigación Biomolecular, Universidad de Newcastle, Sydney, Australia para su posterior análisis por espectrometría de masas con desorción láser / tiempo de vuelo de ionización asistida por matriz (MALDI TOF). Los espectros de masas de péptidos obtenidos se buscaron para la identificación de proteínas en la base de datos de proteínas NCBInr utilizando el software MASCOT (http://www.matrixscience.com).

2.8. Western blotting Para la detección de la proteína NS1 del dengue, se usaron anticuerpos monoclonales anti-NS1 contra los cuatro tipos del virus del dengue. Las muestras se procesaron en geles 2-D usando las mismas condiciones usadas para 2 DE. Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando una transferencia occidental semiseca (Nova Blot; Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Una vez completada la transferencia, la membrana se bloqueó en TTBS (solución salina tamponada con Tris, Tween 20 al 0,1%) y leche desnatada al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente con suave balanceo. La membrana se lavó cuatro veces con TTBS y se incubó con anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C con balanceo suave. Al día siguiente, la membrana se lavó cuatro veces con TTBS y se incubó con un anticuerpo secundario, que comprende anticuerpo de cabra anti-conejo durante 2 ha temperatura ambiente con suave balanceo. Posteriormente, la membrana se lavó cuatro veces con TTBS y se añadió complejo de estreptavidina-fosfatasa alcalina biotinilada y se incubó durante 1 hora más a temperatura ambiente con agitación suave. Nuevamente, la membrana se lavó seis veces con TTBS y finalmente se añadió una solución de desarrollo de color a la membrana para desarrollar las manchas, que aparecieron con un tinte violáceo. La reacción se detuvo cuando no se vieron más manchas reemplazando la solución de desarrollo de color con agua Milli-Q.

2.9. ELISA para 1-antitripsina Brevemente, la antitripsina humana anti-conejo 1 (22 mg / ml) se revistió sobre una placa ELISA (diluciones 1: 400) y se dejó durante la noche a 4 ° C. Al día siguiente, la placa se lavó seis veces con PBS-Tween (PBS-T) y se añadieron 100 ul de suero diluido (1: 100) de cada muestra y control a los pocillos y luego se incubaron a 37 ° C durante 1 h. La placa se lavó seis veces con PBS-T y posteriormente se añadió anti-1-antitripsina de cabra (humana) en los pocillos y se incubó durante 1 h más. La placa se lavó nuevamente seis veces con PBS-T y luego se añadieron 100 l de conjugado IgG anti-cabra con peroxidasa de rábano picante (dilución 1:50 000) en los pocillos y se incubó a 37 ° C durante 1 h. Posteriormente, la placa se lavó nuevamente con PBST y se añadieron 100 l de fenilendiamina a los pocillos. La placa se incubó a temperatura ambiente antes de detener la reacción con la adición de ácido sulfúrico 4N. La placa se leyó a 490 nm. 2.10. ELISA para la proteína NS1 del dengue El ELISA para la proteína NS1 del dengue se llevó a cabo utilizando un kit comercialmente disponible, Platelia Dengue NS1 Ag (Biorad, Hercules, CA, EE. UU.) De acuerdo con las instrucciones del fabricante. 3. Resultados 3.1. Dengue RT-PCR aislamiento viral, IgM ELISA y pruebas de HI Los 10 pacientes con DF mostraron la presencia de anticuerpos IgM contra el dengue y nueve de ellos también demostraron la presencia de ARN viral del serotipo 1 del dengue, del cual el

virus del dengue también se aisló con éxito (Tabla 1). Los títulos de HI indican que cinco de los 10 pacientes tenían títulos ≥2560, lo que sugiere una probable infección reciente. Los 10 pacientes con DHF también demostraron la presencia de anticuerpos IgM contra el dengue. Sin embargo, solo siete de ellos mostraron la presencia de ARN viral del dengue, y posteriormente solo cinco de ellos tenían aislado el virus del dengue. Todos los pacientes con DHF tenían títulos de HI ≥ 2560, con tres alcanzando el máximo> 10 240, lo que indica una probable infección secundaria por dengue. 3.2. Electroforesis bidimensional La Figura 1 muestra los perfiles 2-DE para pacientes con DF, pacientes con DH y personas sanas. Estos perfiles son representativos para cada grupo de estudio después de extensos experimentos de gel 2-D. Los resultados indican la presencia de manchas de proteínas que están reguladas en pacientes con DF y DHF en comparación con los controles sanos. Identificamos algunas proteínas que están reguladas al alza en pacientes con DF y DHF en comparación con los controles negativos. Los pesos moleculares y los valores del punto isoeléctrico (pI) de estas proteínas son 50.0 kDa, pI 5.4 (Spot 1), 44.2 kDa, pI 6.5 (Spot 2), 79 kDa, pI 4.0 (Spot 3) y 14 kDa, pl 5.4 (Punto 4). 3.3. Identificación y comparación de volúmenes puntuales de las dos proteínas con regulación positiva en pacientes con DF y DHF en comparación con individuos sanos Encontramos dos puntos que estaban regulados al alza en pacientes con DF y DHF en comparación con individuos sanos. Además, también se observó que se encontró que ambos puntos estaban regulados por aumento en pacientes con DHF en comparación con pacientes con DF. La espectrometría de masas MALDI-TOF identificó las proteínas como 1-antitripsina y dengue NS1 (Tabla 2). Tabla 1 Aislamiento viral de dengue en tiempo real (RT) -CRP, ELISA IgM e inhibición de la hemaglutinación (HI) para pacientes con fiebre del dengue (DF) y fiebre hemorrágica del dengue (DHF)

Tabla 2 Resultados de la desorción láser asistida por matriz / tiempo de ionización de espectrometría de masas de vuelo y búsqueda de bases de datos para identificación de proteínas

3.4. Western blotting Se realizó una transferencia Western para confirmar la presencia de la proteína NS1, y pudimos detectar las manchas y así confirmar la presencia de la proteína (Figura 2). 3.5. ELISA para proteínas 1-antitripsina y NS1 Como se esperaba, se detectaron 1-antitripsina y proteínas NS1 en todos los pacientes con DF y DHF. Sin embargo, estas pruebas no pudieron cuantificar el título de cada proteína. 4. Discusión Las técnicas de electroforesis en dos dimensiones revelaron la presencia de numerosas manchas de proteínas que se expresaron diferencialmente entre pacientes con DF y DHF y personas sanas (Figura 1). La 1-antitripsina se incrementó en dos veces en pacientes con DHF en comparación con pacientes con DF en nuestro estudio. Esta proteína es un inhibidor de la serina proteasa de 50 kDA. Protege el tejido de las enzimas de las células inflamatorias, especialmente la elastasa, que es una proteasa. Las proteasas están involucradas en una amplia variedad de procesos biológicos, que incluyen inflamación y daño tisular. La actividad de las

proteasas de las células moribundas, como los macrófagos y los neutrófilos, está controlada por las acciones inhibitorias de las antiproteasas, como la 1-antitripsina13.

Figura 1 Perfil de electroforesis bidimensional del suero (tinción con azul de Coomassie) en individuos sanos (A), pacientes con fiebre del dengue (DF) (B) y pacientes con fiebre hemorrágica del dengue (FHD) (C). La carga proteica total fue de 300 g por gel. Las flechas indican la presencia de proteínas que están reguladas al alza en pacientes con DF y DHF en comparación con individuos sanos. Las proteínas son 1- antitripsina (S1), dengue NS1 (S2), dengue NS3 (S3) y transtiretina (S4).

Figura 2 Análisis de transferencia Western de la proteína NS1 de dengue en suero. La figura muestra múltiples puntos de proteínas, que son diferentes isómeros de la proteína NS1, a aproximadamente 50 kDa. Además, también se observan algunas manchas a aproximadamente 100 kDa que probablemente son complejos de dengue Ig-NS1. Por lo tanto, la actividad adecuada de este inhibidor es crucial para el mantenimiento de la proteasa: la homeostasis anti-proteasa y la prevención contra el daño del tejido proteolítico.14 En los pacientes con DHF, hay una participación activa de la respuesta inmune del huésped debido al aumento de la carga viral, lo que da lugar a un aumento de la actividad proteasa; Por lo tanto, existe una regulación positiva de la proteína. La proteína NS1 del dengue también se incrementó en dos veces en pacientes con DHF en comparación con pacientes con DF. Un estudio anterior demostró que los niveles plasmáticos de la proteína NS1 están relacionados con la gravedad de la enfermedad.15 La proteína se expresa en la superficie de las células infectadas y es un objetivo de las respuestas de anticuerpos humanos a la infección por el virus del dengue.16 Aunque el papel exacto de la proteína NS1 en la replicación y la morfogénesis no están claras, se sugirió que los anticuerpos anti-NS1 están asociados con DHF, ya que se han detectado con frecuencia en sueros de pacientes con DHF.17 Durante la infección celular, se encuentra que la proteína NS1 está asociada con orgánulos intracelulares18 o alternativamente transportado a través de la vía secretora a la superficie celular.19 Además, Avirutnan et al.15 descubrieron que niveles más altos de proteína NS1 median en la activación del complemento, lo que conduce a la generación local y sistémica de anafilotoxinas y SC5b-9, que pueden contribuir a la vascularización. fuga, una característica clave de DHF y DSS. También realizamos un análisis de Western blot de la

proteína NS1 en suero y los resultados indicaron la presencia de múltiples puntos de proteína a aproximadamente 44.2 kDa, que son diferentes isómeros de la proteína NS1. Además, también se observaron algunas manchas a aproximadamente 100 kDa, que probablemente son complejos de dengue Ig-NS1. También encontramos otra proteína, el dengue NS3, en algunas de nuestras muestras, especialmente entre los pacientes con DHF. Pero parece estar en forma transitoria, ya que a veces la proteína no se puede detectar o desaparece. Se informó que las proteínas NS1, NS3 y NS5 son las más inmunogénicas para inducir una reacción específica del virus.20,21 Valdés et al.22 mencionaron que las proteínas NS3 y NS5 se producen durante la primera etapa de la replicación viral y que la proteína NS3 se considera una proteasa viral y es un objetivo importante de las células T humanas y, por lo tanto, puede neutralizarse fácilmente mediante anticuerpos. Si bien la 1-antitripsina también se observa en individuos sanos en un nivel inferior, las otras dos proteínas no se detectaron entre los controles, ya que estas proteínas se originan del virus del dengue. Además, también recolectamos muestras de suero de tres pacientes con dengue temprano para determinar si los marcadores vistos en el día 5 en adelante también aparecen temprano. Se recogieron muestras de suero de pacientes con sospecha de infecciones de dengue en los días 2 a 3 de la enfermedad. Las muestras fueron sometidas a análisis de imagen 2-DE. La imagen 2-DE reveló la presencia de proteínas NS1 y 1-antitripsina durante la etapa temprana de la infección, es decir, en los días 2 y 3 de enfermedad (resultados no mostrados). Las proteínas también se detectaron utilizando la técnica ELISA (Tabla 1). Por lo tanto, la proteína NS1 del virus del dengue se encuentra entre las primeras proteínas que circulan en el suero humano después de la exposición a la enfermedad y un buen marcador para indicar una infección temprana por dengue. En conclusión, la aplicación del análisis proteómico en la enfermedad humana se está moviendo rápidamente, y sin duda los hallazgos mejorarán nuestra comprensión de las funciones de las proteínas individuales en el desarrollo de la enfermedad, incluida la identificación y elucidación de la estructura, interrelaciones de funciones que definen la salud y la salud. condiciones de enfermedad En nuestro estudio, los hallazgos indican que hay al menos dos proteínas que están reguladas al alza en pacientes infectados con dengue en comparación con individuos sanos. Más importante aún, ambas proteínas se sobreexpresaron en pacientes con DHF en comparación con pacientes con DF, lo que da peso a la hipótesis de que estas dos proteínas podrían ser biomarcadores de DHF. Nuestros hallazgos también sugieren que estos marcadores podrían ser indicadores tempranos de infección por dengue. Estamos ampliando nuestro estudio para incluir más muestras de dengue temprano para determinar si estos marcadores podrían usarse para predecir una enfermedad grave. Contribuciones de los autores: SD diseñó el protocolo de estudio; TLH, LLCS y CPLT ayudaron en la recopilación de información clínica de pacientes y clasificación de enfermedades y revisaron la parte clínica del manuscrito; RT llevó a cabo los experimentos 2-D; RT, SD, RY y NSK llevaron a cabo el análisis e interpretación de los datos; SD y RT redactó el manuscrito; NSK y RY

contribuyeron a la revisión del manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final. SD y RT son garantes del artículo. Financiación: Este estudio está respaldado en parte por subvenciones del Ministerio de Salud Malasia Research Grant MRG 2005-11 y Academy of Science Malaysia Grant [SAGA 66-02-030041].