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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE NICARAGUA UNAN-MANAGUA MINISTERIO DE SALUD MINSA

Aislamiento Viral – Dengue – Influenza. Autores:

Br. Rivas Solano, Abigail Jocabed Br. Pichardo Luna, Ruth del Socorro Br. Campos Baca, Kathy Francella Br. Garcia Jimenez, Maria Ernestina Br. Quezada Gutierrez, Darlin Maria Br. Barrios Villanueva, Erick Francisco Br. Amador, Renaldy José Carrera: Bioanálisis Clínico V año Managua, Octubre 2012

Objetivos 1. Destacar Generalidades del aislamiento celular, tipos de celulas y su lineaje. 2. Mencionar aspectos generales de los agentes causales del Dengue e Influenza 3. Mencionar los métodos tradicionales y actuales de aislamiento viral.

4. Describir los procedimientos tradicionales y actuales de aislamiento e identificación del virus del dengue e influenza.

Introducción Los virus, a diferencia de los que sucede con la mayoría de las bacterias, hongos y protozoos, sólo pueden multiplicarse en el interior de células vivas, no pudiendo hacerlo en un medio nutritivo carente de células. Los sistemas celulares utilizados para propagar los virus en el laboratorio son: 1. Animales de experimentación 2. Embriones animales 3. Cultivos celulares artificiales

Un aislamiento viral es una técnica de alta sensibilidad y especificidad que utiliza cultivos celulares como biosustratos. Estas líneas celulares son obtenidos de a partir de explantes de órganos o células embrionarias.

Tipos de cultivos celulares Cultivos primarios: Se obtienen mediante la dispersión de tejidos tomados directamente del organismo soportan hasta 3 pases (ej. Células de Riñón embrionario)

Líneas celulares diploides: Células que toleran un número mayor de pases (aproximadamente 50) pero presentan un crecimiento normal ya que conservan hasta 75% de su cariotipo original.(ej. Fibroblastos de pulmón) Líneas celulares continuas: son capaces de crecer indefinidamente, presentan un número alterado de cromosomas ya que son de origen maligno o canceroso. Soportan subcultivos mayores a 75 pases. Algunas de estas son:

HEP-2

LLC-MK2

MDCK

MRC5

Cuando se requiere un aislamiento viral? -Ocurren nuevas epidemias -Las pruebas serológicas se traslapan -Confirmación de un diagnostico presuntivo realizado al microscopio electrónico -Una misma enfermedad causada por diferentes agentes Se obtiene un aislamiento viral cuando: -Se produce el efecto citopático -Aparece una proteína codificada por el virus -Hemadsorción -Interferencia -Transformación -Alteración específica o muerte del animal -Aparición de placas en el huevo embrionario

Dengue El dengue es una enfermedad viral aguda, producida por el virus del dengue, transmitida por el mosquito Aedes aegypti que se crían en el agua acumulada en recipientes y objetos en desuso. El dengue es causado por cuatro serotipos del virus del dengue: DEN-1, DEN-2, DEN-3 ó DEN-4. Son miembros de la familia flaviviridae, genero flavivirus y presentan una estructura genómica común cada uno con antígenos comunes y específicos propios de cada serotipo. Es un ARN de cadena simple de aproximadamente 11kb y polaridad positiva codifica para 3 proteínas estructurales (Envoltura cápside y membrana) y 7 no estructurales.

Influenza

Influenza es una enfermedad infecciosa que se propaga por aerosoles y que infecta las vías respiratorias por un tipo devirus de ARNde la familia de los Orthomyxoviridae. Su tiempo de incubación va entre 1-4 dias. Entre los tipos de virus de la influenza comprenden: •Influenza A: Que a su vez se divide en 10 serotipos (H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7) •Influenza B •Influenza C

Técnicas de aislamiento viral Las técnicas de aislamiento viral se han venido desarrollando a los largo del tiempo desde su uso. Aún si existen técnicas, relativamente nuevas, siempre se remontan a técnicas tradicionales en casos en que las actuales existan un diferimiento o dificultad para su debida detección. Las técnicas directas para demostración viral se basan en la visualización de la partícula viral o su efecto celular especifico como tinciones de microscopia de luz, electrónica y cultivo o aislamiento viral. Existen técnicas tradicionales tradicionales tenemos:

y

actuales

entre

las

Técnicas tradicionales de aislamiento viral

Inoculación en animales La inoculación de animales de laboratorio con material infeccioso puede constituir el primer paso en la identificación viral. El animal mas utilizado es el ratón blanco que dependiendo del virus a estudiar se utilizan adultos o recién nacidos. La inoculación es usualmente intracerebral con un inóculo de 0.03 ml o intraperitoneales donde se pueden administrar dosis mayores.

Inoculación en huevos embrionarios Puede ser utilizado para el aislamiento y cultivo del virus como fue demostrado en la década de los treinta por Goodpasteur y Burnet. Inicialmente se utilizo para trabajo con influenza y luego con otros virus como rubeola, herpes simplex. Estos pueden inocularse en diferentes vías dependiendo del agente a estudiar. El aislamiento viral será evidenciado por muerte embrionaria y aislamiento del mismo del liquido alantoideo.

Técnicas tradicionales de aislamiento viral Cultivo celular Estándar de oro para la detección de un virus. Un cultivo celular se deriva del crecimiento de células que emigran de un tejido o por células que se obtienen por dispersión enzimática a partir del tejido.

Otras técnicas semi-tradicionales Se utilizan para descubrir anticuerpo contra determinado agente viral, estos ensayos se clasifican embace a la cuantificación antígeno-anticuerpo Los que dependen de la capacidad del anticuerpo que se una al antígeno para ejercer función no relacionada con el antígeno: fijación del complemento y hemaglutinación. Los que miden la capacidad de los anticuerpo para bloquear la función viral especifica como la inhibición de la hemaglutinación

Técnicas actuales de aislamiento viral Técnicas directas utilizadas actualmente para la demostración viral. Las pruebas para demostrar antígenos vírales que permiten descubrir y caracterizar un virus en cultivo celular cuando todavía no se produce el efecto citopático o aun no se evidencia o en los casos en que el virus se debe reconocer por otras propiedades o características en cultivo, entre estas tenemos: •La hemadsorción, •Inmunofluorescencia directa, •Radioinmunoensayo, •ELISA. Las que evidencia o descubren material genético específico viral conservadas y replicables ya sea en un fluido, célula o tejido entre estos están(Biología Molecula): •Reacción en cadena de la polimerasa(PCR) •Reacción en cadena de la ligasa(LCR) •Hibridación.

Diagnostico Dengue Las técnicas más utilizadas para el aislamiento viral para dengue es el cultivo celular. Procedimiento: En el diagnostico de rutina se recomienda la inoculación de muestras de sueros diluidas 1/30 e inoculadas en volúmenes de 0.1 ml en monocapas de células C6-36/HT sembradas en tubos. El aislamiento es identificado con IF Otras Lineas Existen línea celular de mamíferos que se han usado para el aislamiento de estos virus (LLCMK2; y BHK21). Las células de mosquito que se han utilizados para el aislamiento viral son mas sensibles, fáciles de multiplicar y mantener a temperatura ambiente y pueden estar hasta 14 días sin cambiar de medio de cultivo, se pueden inocular directamente con el suero del paciente. Entre estas líneas celulares del mosquito tenemos: (AP61; C636; Tra284; CLA-1).

Diagnostico Influenza Los procedimientos de diagnostico del virus influenza se pueden clasificar en: 1. Diagnostico virológico basados en detección del agente viral por: aislamiento en cultivos celulares o huevos embrionados (Posterior se realiza extracción del liquido amniótico y alantoideo a prueba de hemaglutinina), detección de antígeno y amplificación parcial del genoma viral por RT-PCR. 2. Diagnostico serológico basados en la detección y medida de niveles de anticuerpos en sueros pareados utilizando las técnicas de inmunodifusión en agar (IDA), ensayo inmunoenzimático (ELISA) o inhibición de la hemaglutinación (IHA).

Cultivo celular en MDCK 200 μl de cada espécimen en un frasco de cultivo de células dejando adsorber por 30 minutos a 37°C y luego incubar a 33°C en incubadora de CO2

Cosechar si ECP 3+ ó 4+ o si no hay ECP en 6-7 y someter a HA e identificar subtipo por IHA o RT-PCR