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UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE FACULTAD TECNOLÓGICA DEPTO DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS II LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS II

Recuento de Mohos y Levaduras. Informe: Laboratorio N°8

Nombre: Nicole Díaz Rojas Profesor Cátedra: Mg. Sc. Laura Almendrares Calderón Profesor Laboratorio: Liliana Godoy Encargada de Laboratorio: Sra. Carmen Castillo Fecha de entrega: 16 de Diciembre del 2013

Índice

Introducción…………………………………………………………………………………2

Objetivos…………...………………………………………………………………………..2 Revisión Bibliográfica………………………………………………………………………3 Materiales……………………………………………………………………………………7

Diagramas de flujos -

Recuento de mohos y levaduras………………………………………….………..8 Tinción de mohos……………………………………………………….…………9 Micro-cultivos…….………………………….……………………….……...…….9 Recuento de mohos en Cámara de Howard………………..……………………...9

Resultados -

Recuento de mohos y levaduras…………………….………………………….….10 Tinción de mohos………………………………………….………………………11 Micro-cultivos………………………………………………….……….…………11 Recuento de mohos en Cámara de Howard…………………………………..…...12

Discusión……………………………………………………………………….………….13 Conclusión……………………………………………………………………….………..15

Bibliografía……………….………………………………………..…………….………...16

Anexo....………………..…………………………………………………………………..17

1

Introducción Los hongos son organismos eucariontes, por lo que poseen núcleos verdaderos, así como todas las estructuras internas características de estas células. Poseen, además una pared gruesa, semejante en grosor y composición química a la pared de las células vegetales. Sin embargo, no son fotosintéticos, no poseen hojas, tallos ni raíces. (García, 2004). Debido a sus características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas y ecológicas, en la actualidad, los hongos se ubican en su propio reino llamado reino funji, el cual está compuesto por organismos heterótrofos quimiorganotrofos, es decir que requieren compuestos orgánicos para su nutrición. (Montoya, 2008). Como organismos heterótrofos pueden obtener su alimento de materia orgánica (saprófitos), o a partir de otro ser vivo (organismo patógeno). Pueden reproducirse por medio de procesos asexuales – mediante división binaria o formando esporas asexuales- o a través de esporas sexuales. Los hongos pueden ser unicelulares o pluricelulares. Los primeros están formados por células aisladas redondas u ovaladas, denominadas levaduras. Los pluricelulares están constituidos por células alargadas que crecen por extensión de sus extremos, tabicándose de un modo más o menos completo, formando largos filamentos denominados hifas que con frecuencia se ramifican. Estos hongos, denominados mohos, al crecer forman matas de filamentos entrelazados. (Prats, 2005). De la amplia dispersión de los hongos en todos los estratos bióticos e inertes se desprende su fácil y frecuente aparición como contaminantes en productos alimentarios, ya que éstos, constituyen excelentes medios para la sustentación y reproducción de gran números de especies fúngicas. Además, diversos factores (pH, potencial rédox, actividad de agua, humedad relativa, temperatura, elementos nutritivos, etc.) influyen en la proliferación fúngica sobre los alimentos. (Pascual, 2000). El significado de la contaminación fúngica de los alimentos, especialmente por mohos, no viene sólo del potencial de los hongos para deteriorarlos, (actuando como bioconvesores que afectan tanto el aspecto, como también generan modificaciones químicas que alteran el valor nutricional, las características organolépticas y dificulta la conservación éstos), sino también del potencial de muchos de ellos para producir enfermedades en humanos y animales, como cuadros alérgicos, por la inhalación de esporas (rinitis, asma, alveolitis, neumonitis), intoxicaciones por la producción de diversas sustancia nocivas, o infecciones dada la capacidad que tienen algunas especies fúngicas de colonizar, invadir y multiplicarse en diferentes órganos causando micosis, ya sea en un huésped previamente sano (hongos patógenos primarios), o en el huésped con diferentes grados de disminución de los mecanismos de defensa (hongos oportunistas). Pese a los peligros que representan los hongos, también se obtienen numerosos beneficios, por ejemplo, en la industria de alimentos se utilizan para la maduración del queso roquefort y el queso azul, en las bebidas cola se utiliza la especie Aspergillus para la fabricación de ácido cítrico, y las levaduras para producir vino y para que leude el pan. (Campbell y Col, 2005).

Objetivos  Objetivo general: - Determinar la presencia de Mohos y Levaduras en alimentos.  Objetivos Específicos: - Observar las características morfológicas de los mohos a través de micro-cultivos y de una tinción. - Determinar la calidad de un producto mediante la Cámara de Howard. 2

Revisión Bibliográfica Las características morfológicas de las colonias de levadura son similares a las de las bacterias, es decir, cremosas, opacas, con un diámetro de 3 a 7mm, y en general de crecimiento relativamente rápido (24-72 horas). Los mohos en cambio, dan lugar a colonias de mayor tamaño (10-30mm), que crecen radialmente de modo progresivo, de aspecto inconfundible, vellosas, algodonosas o pulverulentas, de vistosos y variados colores, que deben ser observadas en el anverso y reverso, donde puede verse si el pigmento difunde al medio. Suelen ser de crecimiento lento (3-20 días), pero pueden llegar a invadir toda la superficie del medio de cultivo. El color, la forma y el tamaño pueden variar según el medio de cultivo. (Prats, 2005). Mohos: La categoría de los mohos comprende un grupo bastante heterogéneo de hongos multicelulares y con forma fibras (hifas). Superficialmente, se parecen mucho los unos a los otros, pero en realidad hay grupos muy diferentes. Los hongos tienen una estructura muy ramificada llamada micelio, que puede ser pequeño o lo suficientemente grande para ser observado a simple vista. (Bylund, 2003). Se consideran organismos que pueden alterar los alimentos, la alteración se pone de manifiesto con su crecimiento característico, aunque a veces los degradan antes de crecer en forma visible, algunos elaboran micotoxinas, que son sustancias tóxicas perjudiciales para la salud sobre todo en aquellos alimentos de pH bajo, frutas, jugos, yogurt, etc. O los de presión atmosférica elevada, harinas, copos de avena, miel, leche concentrada y productos salados. En ocasiones son útiles para la elaboración de ciertos alimentos: por ej. Quesos, otros se usan como fuente de vitaminas y proteínas. Por ser los mohos agentes contaminantes de productos ácidos y de baja actividad de agua, productores a veces de micotoxinas, su presencia en los alimentos deben alentar sobre la posibilidad de presencia de micotoxinas en los mismos. (Ministerio de agricultura y ganadería, Paraguay, 2001). Levaduras: Son organismos celulares de forma esférica, elíptica o cilíndrica. El tamaño de las células de levadura varía considerablemente (2µm-100µm de diámetro). Se puede reproducir de manera asexual por gemación, como de manera sexual formando esporas, ascosporas y basidiosporas. Dentro de los factores de crecimiento de las levaduras están: nutrientes, humedad (pueden crecer en medios con muy baja humedad, tales como la miel y la mermelada, puede soportar una presión osmótica relativamente alta), acidez (pH entre 3-7,5; con un óptimo de 4,5-5,0), temperatura (temperatura óptima 20°-30°C), oxígeno (anaerobias facultativas, puede crecer en presencia o ausencia de oxígeno). (Bylund, G). La identificación de levaduras se sustenta inicialmente en la observación de una serie de características morfológicas esenciales, sin embargo, la identificación especifica de una cepa precisa del concurso de pruebas fisiológicas y bioquímicas. (Pascual, 2000). 3

Metodología I.

Medios de cultivos:  Agar Papa Dextrosa (PDA): Para el cultivo y recuento de hongos y levaduras en productos lácteos, bebidas embotelladas y alimentos. Como medio preparado para la cuenta de hongos y levaduras en líquidos. La infusión de papa como fuente de almidones y dextrosa son la base para el crecimiento de hongos y levaduras. El bajo pH (3,5) evita el crecimiento de las bacterias.  Agar Sabouraud Dextrosa: Es utilizado para el cultivo de mohos y levaduras patógenas y no patógenas. pH final 5,6 ± 0,2. El bajo pH del medio resulta favorable para el crecimiento de los hongos y ligeramente inhibitorio para las bacterias. En caso de requerirse un incremento en la inhibición del crecimiento de bacterias, se recomienda añadir agentes antimicrobianos como la gentamicina que inhibe el crecimiento de los microorganismos Gram negativos o el cloramfenicol que tiene un amplio espectro de acción.  Agar de Harina de Maíz: Se utiliza en el cultivo y diferenciación de las especies de Candida basándose en las características miceliales. El Tween 80 se incorpora para demostrar la formación de clamidoconidias. Si se le añaden 10 gr. de glucosa puede utilizarse en la diferenciación de T. rubrum y T. mentagrophytes basándose en la producción de pigmento.

II.

Recuento de mohos y levaduras

Se entiende por recuento total de mohos y levaduras revivificables, el número de colonias que se desarrollan a partir de 1 gramo o milímetro de alimento, sobre el medio de Sabouraud dextrosa, durante 5 días a 22-25°C. (Ministerio de agricultura y ganadería, Paraguay, 2001). Los recuentos de mohos y levaduras sirven como criterio de re-contaminación en alimentos que han sufrido un tratamiento higienizante y que han sido sometidos a condiciones de conservación. (Moreno, 2000). Calculo El número de Mohos y Levaduras por gramo o mL de alimento se determina según la siguiente fórmula: ∑ [(

) (

)]

Ec. N°1

donde: N = número de colonias por ml o g de producto ∑ = suma de todas las colonias contadas en todas las placas = número de placas contadas de la menor dilución = número de placas contadas de la dilución consecutiva. d = dilución de la cuál fue obtenido el primer recuento.

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Para todas las placas de diluciones que no presentan crecimiento o desarrollo, informar como menor de uno por el valor recíproco de la dilución menor por g o mL. Ec. N°2 donde

, es menor dilución.

Ec. N°1 y N°2 obtenidas Norma ISO 7954, PRT- 712.02-031. III.

Tinción de Mohos

Este método permite realizar la descripción del hongo mediante la observación de las estructuras sin que pierda su disposición natural y sin perturbar mucho su morfología. Es utilizado para el cultivo de hongos filamentosos. Composición Azul Algodón Fenol Ácido láctico Glicerina Azul de anilina Agua destilada

Cantidad 0,1 gr 8 ml 20 ml 0,5 gr 1 ml

Dentro de la composición, el fenol destruye la flora acompañante y organismos; el ácido láctico conserva las estructuras fúngicas y el azul algodón tiñe la quitina de las paredes fúngicas. IV.

Micro-cultivos

Esta técnica permite realizar preparaciones de alta calidad en las que se conservan a la perfección las estructuras y las disposiciones de las esporas. Y consiste en la siguiente: 1. Colocar un trozo redondo de papel filtro o de gasa en el fondo de una placa de Petri estéril. Colocar un par de varillas de vidrio delgadas o palillos de un aplicador cortados a la longitud necesaria para poner encima del papel filtro y que sirva como apoyo del portaobjeto. (Imagen 1-A). 2. Colocar un bloque o tampón de agar de harina de maíz o agar dextrosa patata (Imagen 1-B) en la superficie del portaobjetos. (Imagen 1-C). 3. Inocular los márgenes del tapón de agar en tres o cuatro lugares con una porción pequeña de la colonia por estudiar, usando un alambre de inoculación recto o la punta de una aguja de disección. (Imagen 1- D y E). 4. Calentar en forma suave un cubreobjetos pasándolo con rapidez a través de la llama de un mechero Bunsen y colocarlo de inmediato directamente en la superficie del bloque del agar inoculado. Al calentar el cubreobjetos se produce un sellado firme entre su fondo y la superficie de agar que se funde brevemente por el vidrio caliente. 5. Pipetear una cantidad pequeña de agua en el fondo de la placa de Petri para saturar el papel del filtro o la gasa. Colocar la tapa de la placa de Petri e incubar a temperatura ambiente (o 30°C) durante 3 a 5 días. 5

6. Cuando el crecimiento parece estar maduro a simple vista (Imagen 1-F), el cubreobjetos pueden levantarse con suavidad de la superficie del agar con un par de pinzas. Debe tenerse cuidado para no romper el micelio que se adhiere al fondo del cubreobjetos más de lo necesario. (Imagen 1-G). 7. Colocar el cubreobjetos en una gota pequeña del colorante azul de Lactofenol aplicada a la superficie de un segundo portaobjeto. (Imagen 1-H). La preparación puede conservarse para el estudio sellando los bordes extremos del cubreobjetos con líquido de montar o esmalte de uñas claro. Esta actividad debe realizarse bajo una capucha de seguridad biológica. 8. Después de retirar el cubreobjetos del bloque (o bloques) de agar, éste puede sacarse del portaobjeto mediante el palillo de un aplicador. Esto se realiza sobre un recipiente que contenga líquido de desinfección con fenol al 5% donde se dejan caer los bloques de agar. El micelio que queda adherido a la superficie del portaobjeto original después de haber retirado el bloque también puede teñirse con azul de Lactofenol y cubrirlo con un cubreobjetos, lo cual sirve como segunda preparación en fresco. Imagen N°1: Serie de fotografías que describen la preparación de un micro-cultivo.

Fuente: Koneman, Diagnostico microbiológico, 2006. V.

Recuento de mohos en Cámara de Howard

El recuento de mohos de Howard-Stephenson se para determinar si un producto apertizado tiene un alto número de hifas de mohos por campo microscópico. Si hay una cantidad excesiva de mohos, indica pobre selección del producto crudo. (Carrillo, 2007). Por esto, es un buen indicador de la calidad de productos terminados. El contenido de moho se obtiene con la siguiente expresión:

( )

Ec. N°3

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Materiales Tabla N°1: Materiales utilizados en el práctico.

Material Asa Bisturí Cámara de Howard Espátulas Gradilla Matraz Erlenmeyer Pinza Metálica Pipetas Graduadas Placa de Petri Portaobjeto Scotch Vasos Precipitados

Materiales Reactivos y medio de cultivo Ácido Tartárico al 10% Agar Papa Dextrosa (PDA) Agua Peptonada al 0,1% Azul de Algodón con Lactofenol

Equipos Baño de agua a 45° ± 1 °C Contador de Colonias Estufa de incubación 25°±1°C Microscopio Refractómetro Vortex

Fuente: Elaboración propia, 2013.

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Diagramas de Flujos  Recuento de mohos y levaduras. Preparar diluciones decimales de la muestra en Agua Peptonada al 0,1%

Rotular placas

Fundir y temperar Agar de Papa Dextrosa a 45° ± 1°C Mezclar

Depositar 1ml. de cada dilución por duplicado en placas

Homogeneizar y distribuir en placas

Calcular la cantidad de ácido tartárico al 10% Mezclar suavemente el inoculo con el agar. (Evitar mojar bordes de placa)

Incubar a 25° ± 1°C por 5 días

Esperar que solidifique

Sin invertir placa

Seleccionar las placas que contengan entre 10 a 150 colonias. Informar el recuento de mohos y levaduras por separado (gr o ml).

Contar y registrar mohos y levaduras por separado y el factor de dilución propio.

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 Tinción de Mohos

Colocar una gota de Azul de Algodón con Lactofenol en un portaobjeto.

Tomar una muestra con Scotch de moho del alimento.

Poner en contacto la muestra con el portaobjeto.

Observar al microscopio con objetivos 10x y 40x.

Dibujar e identificar el moho.

 Micro-cultivos

Extraer desde el interior de la placa el micro-cultivo de un moho.

Observar al microscopio con objetivos 10x y 40x.

Dibujar e identificar el moho.

 Recuento de mohos en Cámara de Howard Diluir un concentrado de tomate a 8,3 ± 0,2% S.S.

Depositar muestra en el centro de la Cámara de Howard.

Colocar el cubre objeto eliminando todas las burbujas de aire.

Verificar con Refractómetro.

Colocar en el microscopio y examinar cada uno de los 25 campos.

Expresar el resultado como porcentaje de campos positivos*.

*Considerando 1 campo positivo cuando la longitud sumada hasta 3 filamentos es mayor o igual a un sexto del diámetro del campo.

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Resultados:  Recuento de mohos y levaduras Tabla N°2: Número de colonias presentes en los alimentos, en las diferentes diluciones. Tipo de Hongo Mohos Levaduras Dilución 10-2 10-3 10-4 10-2 10-3 10-4 Muestra Número de Colonias Té 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Chuchoca 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Salvado de Trigo 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Harina 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Harina integral 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Fruta Confitada 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Fuente: Elaboración propia, 2013.

Tabla N°3: Imágenes de las colonias de mohos en los distintos alimentos, dilución 10 -2

Té

Cultivos de mohos Chuchoca Salvado de Trigo

Harina Integral

Fuente: Elaboración propia, 2013.

Tabla N°4: Imágenes de morfología de los mohos en los distintos alimentos, dilución 10 -2.

Té

Cultivos de mohos Chuchoca Salvado de Trigo

Fuente: Elaboración propia, 2013. 10

Harina Integral

Recuento de Mohos Té [

]

[

]

[

]

[

]

Chuchoca

Salvado de Trigo

Harina integral

 Tinción de mohos Tabla N°5: Imágenes de estructura filamentosa de los hongos en los distintos alimentos. Estructuras Filamentosas Cereza Frutilla Limón Betarraga

Fuente: Elaboración propia, 2013.

 Micro-cultivos Tabla N°6: Imágenes de estructura filamentosa de los mohos.

Asperguillus

Fusarium

Fuente: Elaboración propia, 2013. 11

 Recuento de mohos en Cámara de Howard

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Discusión  Recuento de mohos y levaduras Como se visualiza en la tabla N°2, sólo hubo crecimiento de colonias de moho en dilución 10-2, en el té, chuchoca, salvado de trigo y harina integral. En el té se desarrollaron tres grandes colonias de mohos contiguas de morfología algodonada, donde el centro es de un color oscuro más intenso que los bordes, siendo estos difusos y las colonias abarcan más de la mitad de la placa. Aplicando la Ec. N°2 se obtuvo 150 ufc por gramo de té. En el caso de la chuchoca, se obtuvo solo una colonia pequeña de apariencia algodonada, de color azul y con borde blanco bien delimitado, dando 50 ufc por gramo de chuchoca. Para el salvado de trigo, se ve una colonia pequeña algodonada, de centro oscuro, tonos anaranjados, borde bien definido de color amarillo y posee pequeños pliegues, con 50 ufc por gramo de salvado de trigo. Y finalmente para la harina integral, se detectó una colonia algodonada, de centro oscuro y bordes difusos de color blanquecino, con 50 ufc por gramo de harina integral. (Tablas N°3 y N°4). En el reglamento sanitario se indica solo la cantidad máxima de colonias de moho para harinas y almidones, donde de un muestreo de 5 unidades, 2 de estas pueden contener una concentración de 103 ufc por gramo de alimento, ninguna puede superar 104 ufc por gramo de alimento, de no ser así se debe rechazar el lote, según esta regla nuestro alimento estaría dentro del rango aceptable. Para cada alimento se tomaron muestras por duplicado para tener mayor certeza al calificar el alimento como inocuo o como un posible riesgo a la salud, no obstante, según la norma chilena de muestreo (NCH 43.Of 61) esta debe ser representativa de todo el lote, y en el RSA se indica que deben ser obtenidas de 5 muestras del mismo tipo de producto (con algún tipo de método de muestreo). En todos los casos anteriormente mencionados, solo una de las placas presento crecimiento. En el caso de las levaduras, no hubo desarrollo ni crecimiento de este tipo de hongo. Esto se puede atribuir a 3 causas: -

Mala manipulación de la muestra, que se hayan eliminado por un mal procedimiento. Que las diluciones no fueron las indicadas. O que las muestras realmente no estuvieran contaminadas.

Esto dado, que se dieron las condiciones óptimas para el crecimiento de este tipo de microorganismos. En general se puede decir, que el crecimiento fue pobre, lo que indica que los alimentos no estaban muy contaminados, y los que presentaban mohos, era en muy bajas concentraciones, ya que en las diluciones 10-3 y 10-4 no se desarrollaron.

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 Tinción de mohos Se analizaron 4 muestras, cereza, frutilla, limón y betarraga. La cereza presentaba crecimiento de moho blanquecino algodonado. Con la tinción se logra observar filamentos no septados y presencia de esporas. Como se observa en la Imagen N°2 del anexo, la estructura del moho encontrado en el fruto es muy similar al de rhizopus stolonifer. En la frutilla se observan filamentos septados y presencia de esporas. Por su forma y el deterioro superficial que presentaba el alimento (moho pulverulento) se atribuye a botrytis. En el anexo Imagen N°3 se observa una comparación entre una parte de la imagen de la tabla N°5 para la frutilla y la morfología de botrytis. En el limón, dado el tipo de podredumbre sufrido por el fruto (similar a imagen N°4, en Anexo) y la acidez del mismo, se puede decir que el moho presente es Penicillium digitatum, sin embrago, no es posible apreciar su morfología completa con esta técnica, ya que, en la imagen de la tabla N°5, solo se visualizan las esporas, estructura superior del hongo y no así sus micelios o algún tipo de filamento en comparación con la imgen N°5 del Anexo. En la betarraga se observó un crecimiento cremoso, del color característico del vegetal. Al microscopio, solo se observan estructuras circulares, las que pueden ser calificadas como esporas o levaduras, sin embargo al ser de un color tan intenso, la tinción no es representativa por lo que, no se puede identificar como un microorganismo o tipo de hongo específico.  Micro-cultivos Se observó la estructura de dos mohos, Aspergillus y Fusarium. En el primero es posible apreciar su estructura micelar, compuesta por hifas septadas, pero no su estructura característica (cabeza asperguillar), tampoco se reconoce presencia de esporas. En el caso de Fusarium se observan su estructura micelar desordenada y conjunta, no se identifica presencia o ausencia de septos y no se distinguen esporas.  Recuento de mohos en Cámara de Howard Según el artículo 946 del código alimentario argentino, la dilución en agua del concentrado de tomate en forma de tener un extracto seco libre de cloruro de sodio de 8,37 a 9,37%, no deben presentar más que el 60% de campos positivos de mohos (método de Howard- Stephenson). En el reglamento sanitario de alimentos, solo se menciona la cantidad de mohos permitida en la elaboración de salsas de tomate pasteurizado y/o preservado, en la cual se señala que una concentración menor a 102 de mohos no representan un riesgo a la salud. Y según la norma chilena (NCH. 729-197), donde se mencionan los requisitos del concentrado de tomate, se indica el máximo de campos positivos dependiendo de la calidad del fruto antes de ser procesado dando 3 categorías: - Grado 1 o extra: donde el máximo permitido es de 40% de campos positivos. - Grado 2 o escogido: donde el máximo permitido es de 50% de campos positivos. - Grado 3 o corriente: donde el máximo permitido es de 60% de campos positivos.

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Considerando que las salsas no se realizan con los tomates de primera selección, y se obtuvo un 44% de campos positivos, se informa que la salsa de tomate analizada cumple con las legislaciones anteriormente mencionadas.

Conclusión Mediante este práctico fue posible realizar el recuento de mohos y levaduras en diferentes alimentos, donde solo hubo desarrollo de colonias en cuatro de ellos, que fueron el té, la chuchoca, la harina integral y el salvado de trigo, en la mayor dilución (10-2), siendo el primero el que presento mayor contaminación. Sin embargo, la contaminación de los alimentos era bastante pobre, debido a que no hubo crecimiento en las diluciones menores 10 -3 y 10-4 y solo creció en una placa y no en ambas (cultivos por duplicado). También se observó las diferentes estructuras macroscópicas desarrolladas en cada cultivo. En el caso de la tinción se presume el tipo de moho presente dado sus características morfológicas observadas por microscopio y la forma de pudrición que presentaba el alimento, al momento de tomar la muestra y además se realiza una pequeña comparación con imágenes expuestas en el anexo. En los micro-cultivos solo se logra visualizar morfología micelar, e hifas. No se distinguen esporas ni características específicas de los mohos analizados. Finalmente, en el caso de recuento de mohos en Cámara de Howard a la salsa de tomate, se encontró 44% de los campos positivos, lo que indica que el alimento estaba en condiciones de ser consumido, debido a que cumplía con todas las legislaciones anteriormente mencionadas.

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Bibliografía  Bylund, Gösta. Manual de Industrias Lácteas. Mundi-Prensa. 1a Edición.2003. Pág. 36-37.  Campbell, Neil y Col. Biología. Editorial Médica Panamericana. 7 a Edición. 2005. España. Pág. 608-624.  Carrillo, Leonor. Manual de Microbiología de los Alimentos. Editorial Jujuy. 1 a Edición. 2007. Argentina. Pág. 80-81.  Código Alimentario Argentino. ANMAT. Última actualización Junio 2013. Capítulo XI Alimentos Vegetales. Artículo 946. Pág. 63.  García, Vera. Introducción a la Microbiología. Editorial Universidad Estatal a Distancia. 2a Edición. 2004. Pág. 85-118.  Instituto de salud pública, Gobierno de Chile. Procedimiento recuento de mohos y levaduras en alimentos. Sección microbiología alimentos. NORMA ISO 7954. PRT712.02-031. 2008.Pág. 4-5.  Jiménez, Liliana. Tesis. Incremento del valor nutritivo de la pasta base para la elaboración de pizza, mediante la incorporación de chocho. Universidad tecnológica equinoccial. Quito. 2008. Pág. 73-74.  Koneman, Elmer; et al. Diagnóstico Microbiológico. Texto y atlas en color. 6 a Edición. Editorial Médica Panamericana.2006. España. Pág. 1113-1115.  Ministerio de Agricultura y Ganadería. Manual de Procedimientos para el control microbiológico. 2001. Paraguay. Pág. 34-36.  Montoya, Hugo. Microbiología básica para el área de la salud y afines. Editorial Universidad de Antioquia. 2a Edición. 2008. Pág. 159-178.  Moreno, F. Métodos generales de análisis microbiológico de los alimentos, Análisis de los microorganismos totales. México. 2000. Pág. 2-4.  Pascual, Ma del Rosario; et al. Microbiología Alimentaria. Metodología analítica para alimentos y bebidas. Editorial Díaz Santos. 2 a Edición. 2000. España. Pág. 141-149.  Prats, Guillem. Microbiología Clínica. Editorial Médica Panamericana. 1 a Edición. España. 2005. Pág. 83-107.  Reglamento Sanitario de los Alimentos. Ministerio de Salud. Gobierno de Chile. Última actualización Octubre 2011. Párrafo XI. Pág. 87.

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Anexo: Imagen N°2: Estructura de Rhizopus Stolonifer.

Fuente: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S018533092009000200001

Imagen N°3: Estructura de Botrytis.

A

B

Fuente:A)http://www.biodiversidadvirtual.org/micro/Botrytis.-img832.html, B) Segmento de la imagen tabla N°5.

Imagen N°4: Podredumbre del limón.

Fuente: http://es.123rf.com/photo_9372320_limon-enmohecido-aislado-enblanco.html 17

Imagen N°5: Estructura de Penicillium digitatum.

A

B

Fuente: A) http://www.safeinfusiontherapy.com/cps/rde/xchg/hc-safeinfusionen-int/hs.xsl/7249.html, B) http://www.micologia.net/gallery2/main.php?g2_itemId=60546

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