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Tiempo de maduración y perfil microbiológico del queso de poro artesanal

Edwin Estiben Perilla Salgado

Ficha: 1905913 Junio de 2020

Centro nacional de hotelería, turismo y alimentos (Sena) Tecnólogo procesamiento de alimentos Microbiología

SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE CENTRO NACIONAL DE HOTELERIA, TURISMO Y ALIMENTOS TECNÓLOGO EN PROCESAMIENTO DE ALIMENTOS TALLER PARA TECNOLOGIA EN PROCESAMIENTO DE ALIMENTOS FICHA 190513

Camila Andrea Ubaque Beltrán Microbióloga Industrial Instructora de Microbiología

Según el documento adjunto al correo electrónico “Tiempo de maduración y perfil microbiológico del queso de poro artesanal” resuelva los siguientes enunciados de manera grupal de acuerdo a los grupos de laboratorio que se conformaron al inicio de trimestre en el ambiente de formación.

1. ¿Qué tipo microorganismos indicadores de calidad podrían encontrarse en este tipo de queso según el documento, defina que es un microrganismo indicador? 

Definición: -

Los microorganismos indicadores en cuya presencia en los alimentos permiten determinar la existencia de un patógeno, se usa mayoritariamente en la determinación de contaminación de un alimento.

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Estos microorganismos advierten oportunamente de un manejo inadecuado o contaminación que incrementan el riesgo de presencia de microorganismos patógenos en los alimentos. Su detección en el laboratorio es sencilla, rápida y económica.

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Estos microorganismos indicadores permiten un enfoque de prevención de riesgos, puesto que advierten manejo inadecuado y o contaminado.



Tipo de microorganismos indicadores de calidad que podrían encontrarse en este tipo de queso: -

Coliformes totales Hongos y levaduras Staphylococcus aureus Bacterias lácticas totales

2. ¿Qué papel desempeñan los microrganismos en la fabricación y maduración del

queso y que incidencia podrían tener los microorganismos patagones encontrados en el queso y en el consumidor?



El papel que desempeñan los microorganismos en la fabricación y maduración del queso: -

Desempeñan papeles esenciales en la fabricación y maduración del queso, contribuyendo al desarrollo de las propiedades organolépticas de su metabolismo y variadas actividades enzimáticas, a la seguridad microbiológica a través de efectos de barrera de microflora compleja y la producción de varios compuestos antimicrobianos de bajo peso molecular.

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Este grupo bacteriano, además de contribuir en la biopreservación de los alimentos, mejoran las características sensoriales como el sabor, textura y aumentan su calidad nutritiva. Además, la mayoría de los probióticos pertenecen a las bacterias ácidos lácticos y son usadas en la industria alimentaria de productos fermentados y como complementos alimenticios con la finalidad de promover la salud.

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Algunos microorganismos presentes en este tipo de queso que desempeñan un papel esencial y contribuye al desarrollo de sus propiedades son:

Lactococcus spp: Se encuentra con frecuencia en la leche cruda y en el queso fresco como parte de la microbiota natural. Este microorganismo se caracteriza por producir ácidos y diacetilo, tener actividad proteolítica, ser resistente a los antibióticos y tolerar altas concentraciones de sal,  además posee actividad antimicrobiana contra ciertas especies patógenas incluyendo a S. aureus, productor de enterotoxina, y a Listeria innocua. Leuconostoc spp: Son bacterias relacionadas con las actividades metabólicas que contribuyen al desarrollo de las propiedades organolépticas (actividad acidificante, producción de diacetilo y compuestos antibacterianos), así como a la textura del queso fresco. Enterococcus spp: se caracteriza por contribuir también al desarrollo de las propiedades organolépticas durante la fabricación del queso fresco; por su naturaleza acido-láctica este microorganismo inhibe el crecimiento de Listeria spp. Y de L. monocytogenes. Otro microorganismo beneficioso importante es Hafnia alvei del género Hafnia, enterobacteria gramnegativo que se encuentra frecuentemente en la leche cruda y en los quesos frescos. Esta bacteria tiene la propiedad de mejorar el sabor del queso mediante la producción de compuestos aromáticos azufrados. -

las bacterias ácido lácticas son un grupo de microorganismos representados por varios géneros con características morfológicas, fisiológicas y metabólicas en común. Son cocos o bacilos Gram positivos, no esporulados, no móviles, anaeróbicos, microaerofílicos o aerotolerantes. Son oxidasa, catalasa y benzidina negativas, carecen de citocromos, no reducen el nitrato a nitrito y producen ácido láctico como el único o principal producto de la fermentación de carbohidratos.

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Que incidencia podrían tener los microorganismos patagones encontrados en el queso y en el consumidor: -

La presencia de Coliformes en alimentos es un indicador de contaminación fecal directa o indirecta y refleja falta de higiene durante la elaboración o manipulación del producto. Además, este grupo bacteriano advierte la posible presencia de otros patógenos. Durante el salado, se presenta un proceso de deshidratación natural de los quesos, donde la pérdida de humedad es más lenta, favoreciendo la sobrevivencia de estas bacterias por más tiempo.

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Una carga microbiana elevada puede afectar a la calidad del producto, ya que la presencia de estos microorganismos se asocia con el deterioro precoz de los quesos o con fermentaciones anormales. Además, debe tenerse en cuenta que entre las bacterias aerobias mesófilos pueden encontrarse muchas especies patógena.

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Las enfermedades trasmitidas por alimentos son causadas por la ingestión de alimentos o bebidas contaminadas con microorganismos patógenos que afectan la salud del consumidor y causan diarreas y vómitos, aunque también se pueden observar choque séptico, hepatitis, cefaleas, fiebre y visión doble.

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Los principales microorganismos patógenos asociados:

Staphylococcus aureus: Este microorganismo vive con frecuencia en la membrana de la mucosa nasal y en la ubre de las vacas. El pH ácido, la elevada actividad del agua y la concentración de cloruro de sodio (NaCl) favorecen el crecimiento de este organismo en el queso fresco. También produce enterotoxina B estafilocócica (SEB), la cual es responsable de la intoxicación alimentaria en los humanos. Escherichia coli: Es un microorganismo que se encuentra comúnmente en la flora intestinal del hombre y de los animales, y su presencia en los alimentos indica contaminación fecal. Listeria monocytogenes: La listeriosis puede causar síntomas como los siguientes: fiebre, dolores musculares, vómitos o diarrea, rigidez de cuello, confusión y debilidad. La contaminación por Listeria monocytogenes en la leche cruda y en el queso fresco pueden ocurrir de dos maneras; en primer lugar, por las heces del ganado y en segundo lugar por la contaminación inmediata de animales con enfermedades como listeriosis y mastitis. Salmonella entérica: Es uno de los principales patógenos transmitidos por los alimentos. Se ha reportado que la prevalencia de Salmonella spp. En la leche y sus derivados no pasteurizados se debe a factores como la contaminación de las manos del ordeñador, las heces de los animales, la contaminación del equipo de ordeño y las aguas contaminadas. Una infección por salmonella causa típicamente, los siguientes síntomas: náuseas y vómitos, retorcijones abdominales, diarrea (a veces sanguinolenta), fiebre y dolor de cabeza. Clostridium perfringens: Es un patógeno anaerobio que suele aislarse del suelo, del polvo, del agua y de los alimentos y se encuentra en el tracto gastrointestinal de los humanos y los animales. Dentro de la microbiota del queso fresco se encuentran microorganismos beneficiosos como las bacterias acido-lácticas y también agentes perjudiciales causante de enfermedades que pueden provenir de la materia prima o de la contaminación durante la manufactura.

3. ¿Que indica la fase exponencial del crecimiento microbiano? -

La fase exponencial del crecimiento microbiano indica el aumento regular de la población que se duplica a intervalos regulares de tiempo.

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La fase exponencial del crecimiento microbiano es un período caracterizado por la duplicación celular. El número de nuevas bacterias que aparecen por unidad de tiempo es proporcional a la población actual. Si el crecimiento no se limita, la duplicación continuará a un ritmo constante, por lo tanto el número de células de la población se duplica con cada período de tiempo consecutivo. Para este tipo de crecimiento exponencial, la representación gráfica del logaritmo del número de células frente al tiempo genera una línea recta.

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Los factores ambientales que afectan el crecimiento microbiano están:

Temperatura: Es de los factores ambientales que más influye en el crecimiento de los microorganismos. Al aumentar la temperatura aumenta la velocidad de las reacciones enzimáticas hasta una cierta temperatura a la cual las proteínas, DNA y otras macromoléculas son sensibles y se desnaturalizan. Cada microorganismo tiene una temperatura mínima, óptima y máxima de crecimiento. La temperatura óptima siempre está más cerca de la temperatura máxima que de la mínima. Psicrófilos: temperatura óptima baja (Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes) Mesófilos: temperatura óptima normal (la mayor parte de los organismos) Termófilos: temperatura óptima alta (microorganismos aislados de áreas volcánicas) Termófilos extremos: temperatura óptima muy alta (Thermococcus celer 103° C)

PH: Debido a que los microorganismos cambian el PH del medio cuando crecen se debe añadir un tampón en el medio para obtener el PH constante. Estos tampones funcionan en un rango de PH por lo que se deben utilizar diferentes tampones dependiendo del PH que se quiera en el medio. Para PH neutros se utiliza el tampón fosfato. Los ambientes naturales tienen un rango de PH que oscila entre 5 y 9. Los microorganismos que crecen a PH inferiores a 5 se denominan Acidofilos. Los microorganismos que crecen a PH superiores a 9 se denominan Alcalinofilos.

Agua: Todos los organismos requieren H2O para vivir. Las sustancias absorben en mayor o menor medida moléculas de H2O que nos están disponibles para los organismos, esta disponibilidad del H2O es lo que se llama potencial de agua (aw) cuyos valores van de 0 a 1. El aw del agua pura es 1. Halófilos: microorganismos que viven en altas concentraciones de sales. Osmófilos: microorganismos que viven en altas concentraciones de azúcares. Xerófilos: microorganismos que viven en ambientes secos.

Oxígeno: Aerobios: o Obligados Requieren O2 para crecer (21 %)

o

Facultativos No requieren pero crecen mejor en presencia de O2

Micraerófilos: Requieren pero a niveles más bajos que los atmosféricos (1 - 15 %) Anaerobios: o Aerotolerantes No requieren y crecen peor cuando el O2 está presente. o Obligados La presencia de O2 es letal. -

Para determinar el crecimiento microbiano se puede llevar a cabo mediante el recuento celular (microscopia, número de colonias), masa celular (peso seco, medida de nitrógeno celular, turbidimetria) o actividad celular (grado de actividad bioquímica en relación a tamaño de la

población). Todos estos métodos se clasifican en dos apartados: métodos directos y métodos indirectos. Métodos directos: o o o o

Recuento del número de células en una cámara Thoma. Peso seco celular. Determinación de nitrógeno o de proteínas totales. Determinación de DNA.

Métodos indirectos: o o o o o o o o

Recuento de colonias en placa. Recuento sobre filtro de membrana. Consumo de oxígeno. Liberación de dióxido de carbono. Concentración de un enzima constitutivo. Decoloración de un colorante. Incorporación de precursores radiactivos. Medida de la turbidez.

4. Desarrolle un diagrama d flujo de cómo se realizó la cuantificación microbiana para: Coliformes totales. E. coli, Recuento de mohos y levaduras. Recuento de S. aureus coagulasa, Detección de Salmonella, Detección de Listeria monocytogenes explíquelos de manera individual consulte la normatividad vigente.

Coliformes totales. E. coli 

METODOLOGIA: -

Se disponen los materiales, y la muestra.

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Se desinfectaron previamente todos los materiales que vamos a utilizar previamente en el AUTOCLAVE: Proceso de esterilización por calor húmedo, por 1 hora envuelta en papel y con la cinta indicadora que, si se esterilizo, junto a eso una ampolla (que contiene una solución de nutrientes, junto a un indicador de PH, para verificar si el AUTOCLAVE sirve o no.

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La zona de trabajo y las manos se aplica alcohol.

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se procede a encender el mechero, y se dispusieron todos los materiales a utilizar cerca de le, ya que este previene la contaminación de las muestras con microorganismos provenientes del aire.

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Luego, y cuidando de mantener siempre todos los materiales cerca del mechero, se procedió a colocar el asa sobre el fuego del mechero hasta que esté al rojo vivo, de modo tal quedar esterilizada.

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Preparación de las disoluciones por medio de cultivo y diluyente.

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Medio selectivo sólido: Agar- Lactosa –Bilis-Rojo Neutro Cristal Violeta, VRBL para Coliformes

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Medio selectivo sólido: Agar- Lactosa –Bilis-Rojo Neutro Cristal Violeta, + Mug- para Coliformes y E. Coli.

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Medio selectivo sólido: Agar con Triptonam Bilis X Glucorònido.

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Utilizar dos cajas de Petri estériles. Usando una pipeta estéril, se transfiere a cada caja 1 ml de la suspensión inicial en el caso de los otros productos.

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Tomar dos cajas de Petri estériles. Usando una pipeta estéril, se transfiere a cada caja 1 ml de la primera dilución decimal (10-1) de la muestra del ensayo.

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En cada caja Petri debe se vierte aproximadamente 10ml a 156 ml del medio a 45°C ± 2°C menos de 20 min.

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Luego se mezcla cuidadosamente las cajas de Petri sobre una superficie horizontal fría.

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Al tener una completa solidificación se vierte aproximadamente 4ml de medio de cultivo que cubra la superficie 45°C ± 2°C sobre la superficie de medio inoculado, se pretende dejar doble capa para visualizar mejor las colonias.

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Se invierte las cajas preparadas y se incuban a 35°C ± 1°C durante 24h h ± 2 h.

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Luego incubar a 30°C ± 1°C las primeras 4 horas y después incubar a 44°C ± 1°C por 18h a 20h.

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Llegamos al recuento de colonias después del periodo de incubación se cuentan las colonias Coliformes características en cada caja que contenga no más de 150 colonias.

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Utilizando una lámpara fluorescencia de 360mm hacer la lectura de las bacterias E. coli fluorescencia positiva.

Mohos y levaduras

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METODOLOGIA: -

Preparar las muestras y las diluciones de los homogenizados

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Transferir a cajas Petri estériles; alícuotas de 1 mL a partir de cada dilución preparada, cambiar las pipetas entre diluciones.

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Identificar las cajas con la fecha, dilución y código de la muestra.

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Agregar en cada caja Petri de 15 a 18 mL de Agar YGC (Antes de transcurrir 15 minutos.)

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Mezclar el inóculo con el medio de cultivo, de la siguiente manera: rotar las cajas 5 veces de arriba hacia abajo y de izquierda a derecha, 5 veces en el sentido de las agujas del reloj y 5 veces en sentido contrario. Dejar solidificar.

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Luego que el medio haya solidificado completamente; agregar aproximadamente 4 mL del Agar YGC y dejar solidificar nuevamente.

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Realizar los controles de calidad.

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Invertir e incubar las cajas a 22 ± 2 ºC durante 5 a 7 días.

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Luego de transcurrir el tiempo de incubación, retirar las cajas de la incubadora y realizar la lectura de las colonias.

Staphylococcus aureus coagulasa 

METODOLOGIA: -

Se transfiere por medio de una pipeta estéril, 0.1 ml de la muestra de ensayo si es líquida, o 0.1 ml de la suspensión (dilución 10-1) en el caso de otros productos a cada una de las dos

cajas. Se repite el procedimiento para la dilución 10-2 y para las demás diluciones decimales si es necesario. -

Si para ciertos productos, se espera contar bajo número de estafilococos coagulasa positiva, el límite de detección se puede incrementar por un factor de 10 inoculando 1,0 ml de la muestra de ensayo si es líquida o 0,1 ml de la suspensión para otros productos, tanto en la superficie de cajas de agar grandes (140 mm) o en la superficie de tres cajas de agar pequeñas (90 mm). En ambos casos, se preparan duplicados usando 2 cajas grandes o seis pequeñas.

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Cuidadosamente se esparce el inóculo tan rápido como sea posible sobre la superficie del agar tratando de no tocar los lados de las cajas, usando la varilla. Se permite que las cajas se sequen con sus tapas por 1 min aproximadamente a la temperatura del laboratorio.

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Se invierten las cajas preparadas y se incuban por 24 h a 48 h ± 2 h a 35°C ±2°C. 1. SELECCIÓN DE LAS CAJAS E INTERPRETACIÓN

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Después de la incubación por 24 h ± 2 h, se marca en la caja las posiciones de cualquier colonia típica presente.

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Se re incuban todas las cajas a 35°C±2 °C por 24 h ± 2 h adicionales, y se marca cualquier nueva colonia típica. También se marca cualquier colonia atípica presente.

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Si se inoculó 1.0 ml sobre tres cajas, considerarlas como una sola en todos los recuentos subsecuentes y procedimientos de confirmación.

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Para el recuento se toman solo aquellas cajas que contengan entre 20 y 200 colonias típicas, atípicas, o ambas, en dos diluciones sucesivas. Para confirmación, se selecciona un número dado A (en general de 3 colonias a 5 colonias típicas, si solo hay colonas típicas, o de 3 a 5 colonias atípicas, si solo hay colonas atípicas, o de 3 a 5 colonias típicas y de 3 a 5 colonias atípicas si están presentes ambas, de cada caja).

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Si hay menos de 20 colonias típicas, atípicas, o ambas, presentes en las cajas inoculadas con el producto líquido no diluido o con la dilución menor de otros productos, es posible hacer un recuento estimado como el descrito en los numerales 9.4.1.3 y 10.2. 2. CONFIRMACIÓN (PRUEBA DE LA COAGULASA)

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De la superficie de cada colonia seleccionada, se remueve un inóculo con un asa estéril y se transfiere a un tubo o frasco con caldo infusión cerebro-corazón.

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Se incuba a 35°C±2 °C por 24h ±2 h.

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Se adiciona asépticamente 0.1 ml de cada cultivo a 0.3 ml del plasma de conejo (a menos que se especifiquen otras cantidades por el fabricante) en tubos de hemólisis o frascos estériles, y se incuba a 35 °C±2 °C se inclina el tubo, se examina el coágulo del plasma después de 4 h a 6 h de incubación y, la prueba es negativa, se re-examinan a las 24 h de incubación, o se examina a los tiempos de incubación especificados por el fabricante. Se considerará la prueba de coagulase positiva, si el volumen de coágulo ocupa desde un cuarto del volumen original del líquido.

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Como control negativo, para cada lote de plasma, se adicionan 0.1 ml de caldo infusión cerebro-corazón a la cantidad recomendada de plasma de conejo y se incuba sin inoculación. Para validar la prueba, la pasma de control no debe mostrar ningún signo de

coagulación.

Salmonella 

METODOLOGIA:

ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO: - Se transfieren 0,1 ml del medio de cultivo obtenido, a un tubo que contenga 10 ml del medio; se transfieren 1 ml del medio de cultivo obtenido a un recipiente que contenga 10 ml del medio tetrationate Mueller Kauffmann. -

Rapport Vassiliadis Incubar 41,5°C ± 0,5°C 24 h ± 3 h

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Caldo de Muller-Kauffman tetratronato novobiocina (MKTTn) 37°C ± 1°C 24 h ± 3 h

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Se disuelven los componentes básicos deshidratados o el medio completo deshidratado en el agua mediante ebullición durante 5 min Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que sea de 8,2 ± 0,2 a 25 °C. Se mezcla el medio completamente. La media base puede ser almacenada durante 4 semanas a 3 °C ± 0,2 °C.

SIEMBRA EN MEDIOS SELECTIVOS - Tras incubar durante 24 h ± 3 h, utilizando el cultivo obtenido en el caldo RVS, se siembra mediante un asa la superficie de una placa de Petri que contenga el primer medio en placa selectivo (agar XLD), de tal forma que se obtengan colonias aisladas. -

Se procede de la misma manera con el segundo medio selectivo empleando un asa estéril y cajas de Petri.

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Se invierten las placas dándoles la vuelta y se colocan en la incubadora a 35 °C ± 2 o C para el primer medio.

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Para el segundo medio en placa, deben seguirse las instrucciones del fabricante.

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Después del período de incubación durante 24 h ± 3 h, se examinan las cajas para la presencia de colonias típicas de Salmonella y de colonias atípicas que pueden ser Salmonella Se marca su posición en la parte inferior de la placa.

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XLD: Las colonias típicas de Salmonella que crecen en el agar XLD tienen un centro negro y una zona ligeramente transparente de color rojizo debido al cambio del indicador. Las Salmonella lactosa positivas que crecen en agar XLD son amarillas con o sin ennegrecimiento.

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Listeria monocytogenes 

METODOLOGIA:

Preparación muestra: -

Se añade una porción de 25 gr de la muestra en 225 ml del medio de enriquecimiento selectivo primario y se homogeniza la muestra.

Enriquecimiento selectivo primario: -

En este caso se puede utilizar tres caldos diferentes para pre-enriquecer el microorganismo objeto: Caldo Fraser, Caldo Leb-1 y Caldo Palcam. El Caldo Fraser está compuesto por una base de peptona de carne (5 g), triptona digerido (5 g), extracto de carne (5 g), extracto de levadura (5 g), cloruro sódico (20 g), fosfato monoácido de sodio dihidrato (12 g), fosfato

diácido de potasio (1,35 g), esculina (1 g) en 1000 ml de agua, se esteriliza en el autoclave por 15 minutos a 121°C; si se cuenta con el medio base completo ya deshidratado se calienta y luego se esteriliza con los mismos requerimientos. La base del medio se complementa con una solución de cloruro de litio (3 g en 10 ml de agua), sal sódica de ácido nalidíxico (0,1 g en 10 ml de agua), clorhidrato de acriflavina (0,25 g en 100 ml de agua) y citrato amónico de hierro III (5 g en 100 ml), estos complementos se esterilizan por filtración y son añadidos al momento de utilizar el medio en las siguientes proporciones: base (100 ml), solución de cloruro de litio (1 ml), sal sódica del ácido nalidíxico (0,1 ml), clorhidrato de acriflavina (0,5 ml) y citrato amónico de hierra III (1 ml). -

El Caldo Leb-1 cuenta con una composición de proteasa peptona (5 g), triptona (5 g), extracto de carne purificada (5 g), extracto de levadura (5 g), cloruro de sodio (20 g), fosfato de potasio (1,3 g), fosfato disódico (12 g), ácido nalidíxico al 2% en NaOH 0,1 N (1,0 ml) en 1000 ml de agua; todos los componentes se disuelven en 1000 ml de agua y se lleva a esterilizar en el autoclave por 15 minutos a 121ºC y en el momento de utilizar se adiciona 0,225 ml de solución acuosa al 1% de acriflavina.

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El Caldo Palcam tiene una composición base de peptona (23 g), extracto de levadura (5 g), cloruro de litio (10 g), esculina (0,8 g), citrato de amonio y hierro III (0,5 g), D (-) manitol (5 g), rojo de fenol (0,08 g), lecitina de soja (2 g), tween 80 disuelto en 1000 ml de agua, se esteriliza en el autoclave por 15 minutos a 121ºC; si se cuenta con el medio base completo ya deshidratado se calienta y luego se esteriliza con los mismos requerimientos. 500 ml de la base del medio se complementa con sulfato de polimixina (5 mg), ceftacidina (10 mg) y acriflavina (2,5 mg). La muestra para el ensayo se homogenizan en los medios y se incuba a 30 ºC durante 24 horas.

Enriquecimiento selectivo secundario: -

El enriquecimiento secundario se puede realizar mediante dos medios de cultivo líquidos: Caldo Fraser o Caldo Leb-2, donde ambos medios cumplen con las mismas características descritas en el enriquecimiento selectivo primario respectivamente, las muestras se incuban a 30oC por 24 a 48 horas.

Aislamiento e identificación: -

Partiendo del cultivo de enriquecimiento primario y secundario, se toma por medio de un asa una porción del cultivo y se siembra por agotamiento en los medios de siembra selectivos: agar Oxford o agar Palcam.

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La base del agar Oxford está compuesta por agar columbia (39 g), esculina (1 g), citrato amónico de hierro III (0,5 g), cloruro de litio (15 g) para 1000 ml de agua, se disuelven todos los componentes en el agua por ebullición y se esteriliza durante 15 minutos en el autoclave a 121oC. El suplemento del medio cumple con la siguiente composición: cicloheximida (400 mg), sulfato de colistina (20 mg), clorhidrato de aciflavina (5 mg), cefoletan (2 mg), fosfomicina (10 mg), etanol (5 ml) y agua (5 ml), todo se esteriliza por filtración y se añade al medio para luego dispensarse en las cajas de Petri completamente estériles, se deja solidificar y se almacenan protegiéndolos de la luz.

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El agar Palcam cuenta con una base compuesta por peptona (23 g), almidón (1 g), cloruro de sodio (5 g), extracto de levadura (3 g), agar (9 a 18 g), D-glucosa (0,5 g), D-manitol (10 g), esculina (0,8 g), citrato amónico de hierro III (0,5 g), rojo de fenol (0,08 g), cloruro de litio (15 g), todos los componentes se disuelven en 960 ml de agua por ebullición y se esteriliza a 121oC durante 15 minutos. La base del medio se complementa con una solución de sulfato de polimixina B (0,1 g en 100 ml de agua), solución de clorhidrato de acriflavina (0,05 g en

100 ml de agua), solución de ceftazidima sódica pentahidrato (0,116 g en 100 ml de agua), estos complementos se esterilizan por filtración y son añadidos al momento de utilizar el medio en las siguientes proporciones: base (960 ml), solución de sulfato de poliximina (10 ml), solución de clorhidrato de acriflavina (10 ml) y solución de ceftazidima sódica pentahidrato (20 ml), se añade agitando suavemente entre cada adición, se sirven en las cajas de Petri y se almacena en un lugar protegido de la luz. Después de inocular las colonias se incuban a 35oC y se examina después de 24 horas y si es necesario después de 48 h, para comprobar la presencia de colonias características, presumiblemente de Listeria spp. Confirmación de Listeria spp.

Selección de colonias para su confirmación: -

Para la confirmación se toman de cada caja de cada medio selectivo Oxford o Palcam, cinco colonias sospechosas de ser Listeria spp. Se extienden las colonias seleccionadas en la superficie de las cajas secadas previamente, de agar triptona soja extracto de levadura (TSYEA) permitiendo que las colonias se desarrollen bien separadas. El agar triptona soja extracto de levadura se compone de 30 g de caldo triptona soja (preparado con triptona (17 g), peptona de soja (3 g), cloruro sódico (5 g), fosfato de hidrogeno dipotásico (2,5 g) y 2,5 g de glucosa), extracto de levadura (6 g), agar (9-18 g), todos los componentes disueltos en 1000 ml de agua por ebullición, se esteriliza durante 15 minutos en el autoclave a 121oC, se dispensa el medio en cajas Petri estériles, en cantidades adecuadas para el análisis. Se espera a su solidificación. Las cajas inoculadas con las colonias se incuban a 35oC durante 18 o 24 h o hasta que el crecimiento sea satisfactorio. Las colonias sospechosas tienen de 1 mm a 2 mm de diámetro, son convexas, incoloras y opacas, con borde definido. Si las colonias no están bien aisladas, se replica una colonia típica de Listeria spp en otra caja de TSYEA. Las siguientes pruebas deben efectuarse a partir de cultivos puros en TSYEA.

Reacción de la catalasa: -

Se toma una colonia separada con un asa y se suspende en una gota de solución de peróxido de hidrógeno al 3% (m/m) en una lámina. La formación inmediata de burbujas de gas indica una reacción positiva.

Tinción de Gram: -

Se efectúa la tinción a partir de una colonia aislada. Listeria spp se observa como bacilos cortos y estrechos Gram positivos.

Prueba de motilidad: -

Se inocula con asa recta por punción central en tubos con agar motilidad y se incuban a 25oC de dos a cinco días. El agar motilidad tiene entre sus componentes la peptona de caseína (20 g), peptona de carne (6,1 g) y agar (3,5 g) disueltos por ebullición en 1000 ml de agua, se dispensa 5 ml del medio en tubos y se esteriliza en el autoclave a 121oC durante 15 minutos.

Confirmación de L. monocytogenes.

Ensayo de hemólisis: -

Si las características morfológicas y la reacción de la catalasa son sospechosas de Listeria spp., se realiza la prueba de hemólisis. Se deja secar convenientemente la superficie del agar base con sangre de cordero antes de su uso. Se toma una colonia aislada, se siembra para cada cultivo utilizando un asa. Simultáneamente, se siembran controles positivos (L. monocytogenes) y negativos (L. innocua). El agar base con sangre de cordero cuenta con una base que se compone de peptona de carne (15 g), digestato enzimático de hígado (2,5 g), extracto de levadura (5 g), cloruro sódico (5 g) y agar (9-18 g) disueltos en 1000 ml de agua por ebullición, se esterilizan en el autoclave a 121oC durante 15 minutos. Para la base completa se utilizan 100 ml de la base anteriormente descrita y de 5 a 7 ml de sangre de cordero desfibrinada enfriada a 47oC, se dispensa el medio en cajas Petri estériles, en cantidades adecuadas para el análisis, se deja solidificar. Después de incubar a 35oC durante 24 horas, se examinan las cepas control y las muestras. L. monocytogenes presenta zonas aclaradas y estrechas (β-hemólisis) L. innocua no muestra zonas claras alrededor de la siembra. L. seeligeri muestra zonas de hemólisis débiles. L. ivanovii habitualmente muestra zonas anchas claramente delineadas de β-hemólisis. Se examinan las cajas bajo una luz brillante para comparar los cultivos bajo ensayo con los controles.

Utilización de carbohidratos: -

Se inocula cada uno de los caldos de carbohidratos (ramnosa, xilosa y manitol) con un cultivo en TSYEB utilizando un asa. Se incuba a 35oC hasta 5 días. El caldo base de carbohidratos se compone de una base que cuenta con proteasa peptona (10 g), extracto de carne (1 g), cloruro sódico (5 g) y púrpura de bromocresol disueltos en 1000 ml de agua, se esteriliza en autoclave a 121oC durante 15 minutos. Para el medio completo se utilizan los tres carbohidratos: L-ramnosa, D-xilosa y manitol, 5 g en 100 ml de agua por separado y se esterilizan por filtración. A 9 ml del medio base se le añaden 1 ml de cada carbohidrato. Una coloración amarilla indica una reacción positiva (formación de ácido) y tiene lugar generalmente entre 24 y 48 horas.

5. ¿Los microorganismos mencionados en este documento están relacionados con la normatividad vigente colombiana? Consultar NTC o resolución para productos cárnicos. -

Los microorganismos aquí mencionados en el trabajo de microbiología SI están relacionados con las Normas Técnicas colombianas Vigentes; cada una de ellas cuenta con una Norma Técnica Individualmente.

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En la Norma Técnica Colombiana NTC 1325 (Quinta actualización) INDUSTRIAS ALIMENTARIAS. PRODUCTOS CARNICOS PROCESADOS NO ENLATADOS: En el numeral 7 (ENSAYOS) y el numeral 7.9 (ENSAYOS MICROBIOLOGICOS) encontramos las diferentes determinaciones y recuento de microrganismos con su respectiva leyenda de su NTC. De los microorganismos indicadores enunciados en este taller se encuentran los siguientes:

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7.9.1 NTC 4519 Recuento total de Aerobios Mesófilos. 7.9.2 NTC 4458 Recuento en placas Coliformes. 7.9.3 NTC 4779 Recuento de Staphylococcus Aureus coagulasa positiva. 7.9.4 NTC 4834 Recuento de esporas Clostridium Sulfito reductor. 7.9.5 NTC 4574 Detección de Salmonella. 7.9.6 NTC 4666 Detección de Listeria Mnocytogenes. 7.9.7 NTC 4899 Detección de Escherichia Coli. En la NTC 4092 (MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Y PRODUCTOS PARA ALIMENTACIÓN ANIMAL. REQUISITOS GENERALES Y DIRECTRICES PARA ANALISIS MICROBIOLOGICOS) Encontramos en el numeral 10.4 La enumeración de levaduras y mohos (Página 52).

6. ¿Cuál considera usted es la importancia que tiene este tipo de estudios en la industria alimentaria? -

El análisis de los microorganismos indicadores o análisis microbiológico es una buena herramienta que asegura la calidad e inocuidad desde las materias primas, producción y producto terminado en los alimentos.

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En un control microbiológico se destacan la calidad Higiénico sanitaria y una calidad comercial. Además de determinar la vida útil del producto.

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La importancia que tiene el estudio de los microorganismos indicadores en las materias primas y los productos terminados en la industria alimentaria, es indispensable para evitar el riesgo en nuestra salud, hay que tener en cuenta que los análisis microbiológicos van a mejorar la calidad del alimento, sino también van a permitir determinar la carga microbiana y así poder señalar los puntos de riesgo de contaminación y una posible multiplicación microbiana.

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Por eso debemos tener claro que los análisis microbiológicos siempre se van a usar para saber la seguridad higiénica del producto o alimento, determinar las BPM en la producción. Si los resultados son a favor van a generar un valor agregado en el alimento, con la conclusión de ser un producto de excelente calidad.

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Un alimento al no ser pasado por un análisis microbiológico se va convertir en un riesgo para la salud debido a que pueden ocasionar una serie de enfermedades como son las diarreicas que son la primer causante de muertes en niños y la segunda en adultos.

SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE CENTRO NACIONAL DE HOTELERIA, TURISMO Y ALIMENTOS TECNÓLOGO EN PROCESAMIENTO DE ALIMENTOS

TALLER PARA TECNOLOGIA EN PROCESAMIENTO DE ALIMENTOS 1905913

Camila Andrea Ubaque Beltrán Microbióloga Industrial Instructora de Microbiología

1. Realizar los siguientes ejercicios basándose en la siguiente formula teniendo en cuenta que el rango de conteo es para bacterias aerobias mesofilas y esta entre 30-300 UFC

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1) 10-1 = 180 y120 10-2 = 90 y 30 10-3 = 12 y 9 2) 10-1 = 320 y 280 10-2 = 30 y 50 10-3 = 18 y 1

3) 10-1 = 50 y 60 10-2 = 30 y 14 10-3 = 8 y 10

1. Realizar los siguientes ejercicios basándose en la siguiente formula teniendo en cuenta que el rango de conteo es para recuento de S. áureas el cual se encuentra entre 20-200 UFC. Debe aclarar como obtuvo “a” Recuerde tener en cuenta que la siembra se realizó en superficie.

N=

a

Ʃa v ( n1+ ( 0,1∗n 2 ) ) d

b xC a

1) 10-1 = 280 y120 10-2 = 90 y 30 10-3 = 12 y 9 2) 10-1 = 300 y 280 10-2 = 30 y 50 10-3 = 24 y 34

3) 10-1 = >1600 y 360 10-2 = 30 y 45 10-3 = 22 y 10