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Determinación de las lactonas sesquiterpénicas de extracto diclorometánico en hojas de Ambrosia arborescens Mill. “Altamisa o Marco”

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

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Determinación de las lactonas sesquiterpenicas en extracto diclorometanico de hojas deAmbrosia arborescens Mill. “altamisa o marco”

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS (Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

TÍTULO:

Determinación de las lactonas sesquiterpénicas de extracto diclorometánico en hojas de Ambrosia arborescens Mill. “Altamisa o Marco”

INTEGRANTES:     

BEJAR CAMAPAZA ESTEFANIA INGA LEVIZACA GINA SMIT MONTOYA OBREGON DIEGO PINTO AQUINO ANGELA MAYRIN VERGARA ORTEGA, ESTEFANNY IVONNE.

ASESOR:  Dr. Fritz Choquesillo Peña.

2017 FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA/ UNMSM 2016 - II

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INDICE

INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................................... 1 ANTECEDENTES ........................................................................................................................................ 2 JUSTIFICACIÓN .......................................................................................................................................... 3 1.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................................................. 4

2.

HIPÓTESIS .......................................................................................................................................... 4

3.

OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 4 3.1 OBJETIVO GENERAL ....................................................................................................................... 4 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................................. 4

4.

MARCO TEÓRICO .............................................................................................................................. 5 4.1

ASPECTO BOTÁNICOS .............................................................................................................. 5

4.2

CARACTERISTICAS TAXONOMICAS ........................................................................................ 7

4.2.1 4.3

CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA ......................................................................................... 8

COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA PLANTA ................................................................................. 8

4.3.1

SESQUITERPENOS .......................................................................................................... 11

4.3.2 SESQUITERPENLACTONAS ................................................................................................... 14 ............................................................................................................................................................... 14 ............................................................................................................................................................... 16 4.4 RELACIÓN ESTRUCTURA ACTIVIDAD DE LACTONAS SESQUITERPÉNICAS ............................ 18 4.4.1 ACTIVIDAD TERAPEUTICA ........................................................................................................ 18 4.4.2 ACTIVIDAD FARMACOLOGICA................................................................................................... 18 4.1.3 ACTIVIDAD CITOSTÁTICA .......................................................................................................... 19 4.1.4 ACTIVIDAD ANTITUMORA (ANTICANCERÍGENA, ANTINEOPLÁSTICA).................................. 19 4.1.5 ACTIVIDAD BACTERICIDA Y FUNGICIDA ................................................................................. 19 4.1.6 ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA .............................................................................................. 20 4.1.7 ACTIVIDAD FITOTÓXICA ............................................................................................................ 20 4.5 PROPIEDADES MEDICINALES AMBROSIA ARBORESCENS ........................................................ 21 5

METODOLOGÍA ................................................................................................................................ 21 5.1 MATERIALES .................................................................................................................................. 21 5.2 MATERIAL VEGETAL ...................................................................................................................... 22 5.3 REACTIVOS .................................................................................................................................... 22 5.4 EQUIPOS ......................................................................................................................................... 23 5.5 MÉTODOS ...................................................................................................................................... 23 5.5.1 LOCALIZACIÓN DEL DESARROLLO DEL PROYECTO ........................................................ 23

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5.5.2 RECOLECCIÓN DE LA ESPECIE VEGETAL .......................................................................... 23 5.5.3 CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA .............................................................................................. 24 5.5.4 ANALISIS FITOQUÍMICO ......................................................................................................... 25 5.5.5 AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE LACTONAS ............................................................... 26 5.5.6 ESQUEMA METODOLOGICO EXTRACCION DE LACTONAS .............................................. 27 6. PARTE EXPERIMENTAL ...................................................................................................................... 28 6.1 PRIMER PROCESO PARA RECONOCIMIENTO DE LACTONAS, MARCHA FITOQUIMICA Y EXTRACCION DE LACTONAS. ............................................................................................................ 28 A) RECOLECCIÓN ............................................................................................................................ 28 B) DESINFECCIÓN DE LA PLANTA ................................................................................................. 28 C) SECADO ....................................................................................................................................... 29 D) CORTE CUCHILLAS ..................................................................................................................... 29 6.2 PROCEDIMIENTO RECONOCIMIENTO DE LACTONAS SESQUITERPENICA............................ 30 A)

MACERACION ....................................................................................................................... 30

C)

SECADO ................................................................................................................................ 31

D)

ELIMINACIÓN DE LA CLOROFILA Y CONCENTRADO ....................................................... 31

E)

PREPARACION DE BALJET ................................................................................................. 32

6.4

7.

PROCEDIMIENTO EXTRACCION DE LACTONAS .................................................................. 33

A)

METODO SOXHLET .............................................................................................................. 33

B)

EXTRACCIÓN DE LA CLOROFILA ....................................................................................... 34

C)

EXTRACCIÓN POR DECANTACIÓN .................................................................................... 35

D)

SELECCIÓN DE ENSAYOS .................................................................................................. 35

E)

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA ...................................................................................... 36

F)

CROMATOGRAFIA EN CAPA PREPARATIVA ..................................................................... 37

G)

PRUEBA DE CROMATOPLACAS.......................................................................................... 38

H)

PROCESO DE FRACCIONAMIENTO ................................................................................... 39

I)

PROCESO DE ADSORCION ..................................................................................................... 39

J)

PROCESO DE FILTRADO ......................................................................................................... 40

K)

PROCESO DE CRISTALIZACION ......................................................................................... 40

L)

REVELADO UV .......................................................................................................................... 41

RESULTADOS: .................................................................................................................................. 42 7.1 REVELADO DE LAS CROMATOPLACA (métodos instrumentales) ................................................ 42

8 .DISCUSIÓN ............................................................................................................................................... 44 9 .CONCLUSIONES ...................................................................................................................................... 46 10 . REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................................ 47 ANEXOS ........................................................................................................................................................ 52

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INTRODUCCIÓN Mediante este proyecto de investigación realizado en el curso de Química Orgánica III de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, nosotros los universitarios, buscamos lograr identificar lactonas sesquiterpenicas en las hojas de Ambrosia arborescens Mill. “Altamisa” o “Marco”, para luego observar su estructura y con eso consolidar nuestros conocimientos teóricos, la “Altamisa” o “Marco”, es un miembro de las Asteraceae, una planta silvestre ampliamente distribuida en la sierra y también en la costa. Prefiere vivir cerca de las acequias o en la ribera de los ríos, en suelos arenosos, es muy común en la región Altiplánica. Se encuentran lactonas en las hojas; en las semillas la damsina que es un sesquiterpeno. (1) Como sabemos la Ambrosia arborescens Mill. “Altamisa” o “Marco, se usan con amplio potencial antibacteriano por lo que la presente investigación está centrada en aprovechar esta característica para una aplicación farmacéutica, implican métodos que inician con una serie de ensayos fitoquimicos que permitan determinar la calidad del material vegetal que será utilizado en la extracción de sus componentes y de lactonas sesquiterpenicas. Los principios activos de la Ambrosia arborescens Mill. “Altamisa” o “Marco son las lactonas Sesquiterpénicas, responsables los principios amargos y astringentes de la droga y el aceite esencial. (2) Por lo que nosotros luego de haber recopilado información necesaria acerca la Ambrosia arborescens Mill. “Altamisa” o “Marco, realizamos la recolección comprando dicha planta en el Mercado hierba santa en “La parada”, EL Agustino, Lima; donde una señora procedente del departamento de Ancash nos proporcionó la planta en estudio los cuales también son usados para los dolores causados por el frio y contra la sinusitis. (3) La planta fue identificada con la ayuda de especialistas botánicos en el Museo de Historia. Para luego ser llevada al laboratorio de Química Orgánica para seguir con el proceso de identificación. Luego de recolectar la Ambrosia arborescens Mill. “Altamisa” o “Marco, se procedió a lavar para luego dejar las hojas secar a temperatura ambiente y posteriormente llevarlos a la estufa, continuamos con el proceso de corte en cuchillas para luego dejarlo macerar por una semana, realizamos dos filtraciones usando tocuyo, papel filtro y filtración al vacío, secamos el extracto en platos y lo colocamos en la estufa, procedimos a eliminar la clorofila para luego proceder a realizar los diferentes análisis de identificación de lactonas sesquiterpenicas. (4)

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Para la extracción de lactonas, nuestra muestra ya cortada en cuchillas la colocamos en una bolsa de tocuyo, lo colocamos en el equipo soxhlet entre 100°c y 120°c con solvente diclorometanico; para así luego de 10 ciclos proceder a eliminar la clorofila, se usó la técnica de extracción en la pera de bromo con diclorometano para así realizar la cromatografía en capa fina usando como solventes acetona y diclorometano, para luego ser observados usando espectroscopia UV y espectroscopia IR. (5) También realizamos la prueba de Baljet, Legal y de Hidroxamato férrico, donde se observó cambio de coloración de la muestra y con ello constatar la existencia de lactonas sesquiterpénicas en el extracto de “Altamisa”. (6) Con la finalidad de poder comparar resultados procedimos a realizar también el método de extracción alcohólica en baño María usando los mismos pasos comenzando por la extracción de clorofila. (7) De esta manera logramos identificar las lactonas sesquiterpénicas en Ambrosia arborescens Mill y observar sus estructuras.

ANTECEDENTES Los cronistas españoles hacen referencia a este recurso señalando que los aborígenes siempre la llevaban consigo dándole muchas aplicaciones para la cura de sus males. La utilizaban para embalsamar cadáveres. (8) Usaban las hojas soasadas en cocimiento o ungüento graso como antiinflamatorio y antirreumático, en el tratamiento de calambres y aire, el jugo de las ramas para el tratamiento de las hemorroides, para dolores de estómago, para desinflamar los pies para el arrebato y como antiséptico. En los pueblos y caseríos aledaños a la sierra del Perú toda la planta es utilizada (hojas, tallos, raíces, semillas y flores), para el alivio de numerosas enfermedades. Se le utiliza como antitusígeno, antidiarreico y carminativo, para curar la tos bronquitis y asma; además, para preparar insecticidas, fumigaciones o sahumerios. Sus hojas secas y molidas se dejan macerar en agua para usarlas como insecticida. (8) En la región Arequipa y en otras regiones del Perú se ha encontrado otras especies del género Ambrosia, cuyos estudios etnobotánicos las reportan como medicinales: Ambrosia fruticosa Philippi, Ambrosia sp., Ambrosia peruviana Willd. (8) FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA/ UNMSM 2016 - II

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En esta la región Arequipa, encontramos una gran diversidad de especies vegetales nativas silvestres, ricas en metabolitos secundarios de gran potencial económico dado que dichos recursos podrían aplicarse en la industria alimentaria y farmacéutica. (8) La mayoría de estas especies son plantas aromáticas y medicinales poco estudiadas en nuestro medio, son consideradas como hierbas malas y por lo tanto, el cultivo de la mayoría de ellas, no se ha sistematizado (9)

JUSTIFICACIÓN En la actualidad una de las principales causas de muerte en el Perú y en el mundo es el cáncer que se registra en un incremento a nivel mundial de las tasas de incidencia, mortalidad y morbilidad, siendo de mayor incidencia en países con ingresos medios y bajos, debido a este incremento buscamos disminuirla significativamente, por lo cual se tiene la gran necesidad de buscar e incorporar nueva moléculas anticancerígenas, siendo una de ellas las lactonas sesquiterpénicas, las cuales mediante un mecanismo podrían llegar a destruir células tumorales y proteger a las otras células, ya que otros tratamientos resultan fallidos por la resistencia que presentan las células cancerígenas, los casos de mayor incidencia son: cáncer de estómago, pulmón, próstata y de cuello uterino. Existe una gran variedad de plantas en el mundo y algunas de estas especies pueden presentar lactonas sesquiterpénicas, por lo que resulta muy importante su extracción, reconocimiento y aislamiento. Un tratamiento quimioterapéutico que es el más usado en la actualidad causa efectos colaterales por el desgaste del paciente y además por su alto costo justificamos este trabajo con el fin de aumentar el conocimiento de las personas y quizá más adelante esta información pueda servir de base para los siguientes estudios acerca de esta actividad y así poder generar fármacos anticancerígenos.

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1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ¿Existirán lactonas sesquiterpenicas en las hojas de Ambrosia arborescens Mill?

2. HIPÓTESIS Altamisa (Ambrosia arborescens.) presenta lactonas sesquiterpenicas.

3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GENERAL 

Determinación de lactonas sesquiterpenicas en las hojas de altamisa (Ambrosia arborescens Mill). 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 

Identificar la presencia de lactonas sesquiterpenicas en hojas de Ambrosia arborescens Mill realizando análisis fotoquímico.



Extraer lactonas sesquiterpenicas mediante el método de soxhlet.



Aislar lactonas sesquiterpenicas de la altamisa (Ambrosia arborescens Mill.) por técnica cromatografía en capa fina.



Reconocer el tipo de lactonas presente en la hoja de Ambrosia arborescens Mill. “altamisa”

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4. MARCO TEÓRICO 4.1 ASPECTO BOTÁNICOS a) Es un arbusto de 1.5 - 2.5 m de altura, perenne, tallo cilíndrico erguido, ramoso, color verde cenizo, poco lignificado y glabro (sin pelos). b) Hojas: Simples, alternas, irregularmente divididas y pubescentes (vellosos) en ambas caras; color verde cenizo; ovaladas a redondo-ovales en su contorno total; profundamente bipinnatisectas, provistas de estípulas foliáceo sectadas de hasta 4 cm de longitud y de 2 - 4 mm de diámetro; pubescentes. c) Flores: Capítulos en racimos terminales numerosos, homógamos; los capítulos de flores masculinas dispuestas en las zonas apicales del racimo y con involucro de brácteas soldadas de unos 2 - 3 mm de longitud y las anteras levemente vigorosas, los capítulos de las flores femeninas en la parte basal de 0.5 cm de longitud, con brácteas irregulares libres de 2-3 mm de longitud. d) Frutos: Son aquenios, glabros, de 0.5- 1 cm de longitud, con estilos persistentes de color pardo. (10) e) Hábitat: Esta especie vegetal se encuentra distribuida en Colombia, Ecuador, Perú y Bolivia. En Perú se encuentra ampliamente distribuida en la sierra y también en la costa, desde los 1 500 a 3 500 m.s.n.m. es una especie que vive cerca de acequias o en la ribera de ríos, en suelos arenosos . (10) Ambrosia aparece a lo largo de las regiones templadas del hemisferio norte y en el norte de Sudamérica. Prefieren los suelos arenosos, poco fértiles, ligeramente alcalinos, y son fuertemente fotófilas. Se dan espontáneamente a la vera de los caminos, en rurales y a la orilla de ríos de llanura. (11)

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Fig. 1 A la derecha se observa la inflorescencia y a la izquierda la hoja de Ambrosia arborescens Miller

f)

Distribución (11)

Fig. 2 Bolivia, Ecuador, Perú

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4.2 CARACTERISTICAS TAXONOMICAS Ambrosia arborescens Miller. es una planta aromática medicinal que se encuentra en América del Sur mayormente en los Andes del Perú; se le conoce con los nombres de “marco”, “marko”, “markhu”, “marcju”, “marcu” “marcco”, “maleo”, “ajenjo”, “altamisa”, “artemisia”, “amargo”, “qantin”, “jatin”. A) Familia Las asteráceas (Asteraceae), también denominadas compuestas, reúnen más de 23.000 especies por lo que son la familia de Angiospermas con mayor riqueza y diversidad biológica. La familia está caracterizada por presentar las flores dispuestas en una inflorescencia compuesta denominada capítulo, la cual se halla rodeada de una o más filas de brácteas. El nombre de “Asteraceae” deriva del género tipo de la familia Aster, término que a su vez proviene del griego que significa “estrella” y hace alusión a la forma de la inflorescencia. Por otro lado, el nombre “compuestas, más antiguo pero válido, hace referencia al tipo particular de inflorescencia compuesta que caracteriza a la familia y que solo se halla en muy pocas familias de Angiospermas. Las compuestas presentan una considerable importancia ecológica y económica. Los miembros de esta familia se distribuyen desde las regiones polares hasta los trópicos, conquistando todos los hábitats disponibles, desde los desiertos secos hasta los pantanos, y desde las selvas hasta los picos montañosos. En muchas regiones del mundo las compuestas llegan a integrar hasta el 10% de la flora vernácula. La familia contiene algunos géneros con una gran cantidad de especies. (12) B) Género Las Ambrosías son un género de plantas herbáceas o arbustivas pertenecientes a la familia de las asteráceas nativas de Norte y Sudamérica, desde donde se han difundido por Europa. Comprende una treintena de especies de plantas anuales o perennes, que crecen en especial en regiones llanas, poco húmedas y arenosas. Varias de las especies de Ambrosia producen grandes cantidades de polen, que por su difusión anemocórica es uno de los principales causantes de fiebre del heno. Las especies de Ambrosia son hierbas o arbustos poco altos, aunque en alguna especie alcanzan los 4 m. Tienen tallos erectos e híspidos, que se presentan en matas densas de hasta medio metro de diámetro con ramificaciones basales. La FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA/ UNMSM 2016 - II

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raíz tiende a ser cónica y profunda dificultando la erradicación; algunas son rizomáticas, las hojas son bipinnatífidas, lobuladas, con peciolos alados verde grisáceo a plateadas por haz y envez, opuestas en la base y alternas en las ramas altas. (12) 4.2.1 CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA Phylum: Spermatophyta Subdivisión: Angiospermae Clase: Magnoliopsida(Dicotiledoneas) Subclase: Asteridae Superorden: Asteranae Orden: Asterales Familia: Asteraceae Subfamilia: Asteroideae Tribu: Heliantheae Género: Ambrosia Especie: A. arborescens Nombre botánico: Ambrosia arborescens Mill. Nombre común: Altamisa, Marco

4.3 COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA PLANTA Investigaciones anteriores han demostrado la presencia de cuatro lactonas sesquiterpénicas en las hojas: La damsina, la coronofilina, la psilostaquina, y la psilostaquina C. El aceite esencial es rico en monoterpenos y sesquiterpenos oxigenados y algunos hidrocarburos sesquiterpenicos. Los componentes más abundantes son el isoborneol, el curcumeno, el cadimeno, el corotol y fameseno. (12) En el 2007, en el Laboratorio del Departamento de Química Bioorgánica y Biofarmacia de la Universidad de Pisa se realizó un estudio para determinar la composición del aceite esencial de Ambrosia arborescens y sus propiedades (12)

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El aceite fue obtenido a partir de un proceso de hidrodestilación y se encontró una composición rica en monoterpenos en pequeñas concentraciones, destacándose una concentración muy importante de la crisantenona, y en porcentajes representativos de sesquiterpenos como: γ-curcumeno y germacreno D. (11) La presencia de sesquiterpenos como componentes fundamentales de la especie de Ambrosia arborescens demuestra que su ruta biosintética debe favorecer a la producción de otros sesquiterpenos de interés, lo cual en parte incentivó a realizar el estudio fitoquímico de esta planta. (11)

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Tabla 1 Constituyentes del aceite esencial de las partes aéreas de Ambrosia arborescens (10)

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4.3.1 SESQUITERPENOS Los sesquiterpenos o terpenoides son compuestos constituido por quince carbonos representado por un anillo lactónico, sus diferentes estructuras encontrados en plantas vasculares que pertenece a la familia Asteráceae. Que en la actualidad se han registrado 155 especies agrupadas en 66 géneros en el distrito de Laraos (Yauyos, Lima, Perú) demostrando una mayor diversidad.

(13)

Como consecuencia de esta gran variedad se puede apreciar los tipos de sesquiterpenos en aceites esenciales presentes frecuentemente en hojas y tallos de plantas pertenecientes a la familia Asteráceae. Según la disposición estructural de sus átomos de carbonos les confiere ciertas características las cuales han sido estudiadas hasta el punto de conocer que son compuestos bioactivos, es decir que tiene ciertas funciones en el organismo del ser humano que pueden promover una buena salud. Biosíntesis de sesquiterpenoides La pérdida de un grupo difosfato (OPP) de la estructura farnesil difosfato (FDP) resulta un catión E, E-farnesilo. Este catión sufre una

adición electrofílica

para convertirse en catión germacrilo o catión germacradienilo que es a partir de este catión que se genera estructuras de base como eudesmano, guayano y germacrano. Cuando el

germacrilo pierde un protón se convierte en

germacrano A, luego se hidroliza solo el C-13 , después con la acción de NAD+ ( dinucleotido de adenina nicotinamidasa ) resultará el ácido germacránico, que pasará por una hidroxilación regioselectiva al reaccionar con NADPH (dinucleotido de adenina nicotinamida reductasa) influenciado por el O 2

y

como ultima reacción es la esterificación intramolecular para la obtención de (+) custunólido o germacranolidas que dará

estructuras distintas de lactonas

sesquiterpénicas. (14) (15) Mediante reacciones química realizadas a FDP con lleva a obtener diversos sesquiterpenos.

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Fig 3. Reacciones química realizadas a OPP con lleva a obtener diversos sesquiterpenos

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Tabla 2. Relación de lactonas sesquiterpenos y su actividad Lactonas sesquiterpenos

especies

Tanacetum parthenum

germacranolidas

Anticancerígeno

Carpesium triste var. manshuricum Elephantopus scaber Citotóxica desoxigoyazensolida

Vernonia colorata

antibacteriana

Jatropha curcas

citotóxica

eudesmanolidas

Inula hupehensis Laserterpium

citotóxica

Ludartina

inhibe la enzima aromatasa.

Tanacetum parthenium

antimicrobiano

Thapsia garganica

estimulador del sistema inmune

guayanolida

cadinanolidas

pseudoguayanolidas

Artemesia annua

antiplasmódica y antitumoral

Inula hupehensis

antiinflamatorios

Athroisma proteiforme

antiplasmódica

Inula hookeri

citotóxica

actividad Inhibe el NF-KB (factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras Kappa de las células B activadas. Limita la proliferación de las células cancerosas inhibe la producción de NO y la expresión de la óxido nítrico sintasa actividad citotóxica contra celulares de cáncer de mama actividad citotóxica contra a células de cáncer de colon actividad antibacteriana primaria contra las especies Staphylococcu aureus y Bacillus subtilis (Grampositiva) una selectividad citotóxica contra diferentes líneas celulares mayor capacidad para inhibir la producción de NO actividad citotóxica contra el cáncer de mama Enzima que participa en la biosíntesis estrógenos, hormona que está involucrada en la patogenia de cáncer de mama actividad antiprotozooárica un potente estimulador de liberación de histamina con respuestas alérgicas y procesos inflamatorios usada para el tratamiento de la fiebre y la malaria La artemisinina es potenciales anticancerígeno porque controlar la poca entrada de hierro en células cancerosas de esta forma eliminándola. actividad antiinflamatoria para estos compuestos en macrófagos Actividad contra el parásito Plasmodium falciparum actividad citotóxica contra células tumorales de próstata

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4.3.2 SESQUITERPENLACTONAS Son metabolitos secundarios que se encuentran en numerosas especies o familias de plantas. Estas moléculas han llamado la atención de los científicos por el amplio espectro de actividades biológicas que presentan como antiinflamatoria, antitumoral, citotóxica, antibacterial, antimalaria y actividad neurotóxica y alérgica. Actualmente se realizan ensayos clínicos contra el cáncer con tres lactonas sesquiterpénicas: la artemisina, el partenolido y la tapsigargina. Los estudios de relación estructura-actividad realizados a estas moléculas muestran características específicas en su estructura, que son las responsables de sus efectos antitumorales y citotóxicos. Teniendo en cuenta estos antecedentes, este trabajo tiene tuvo objetivo analizar las diferentes actividades biológicas de germacranolidas, eudesmanolidas, guayanolidas, cadinanolidas y pseudoguayanolidas, así como la relación estructura-actividad de las lactonas sesquiterpénicas. (16) Las sesquiterpenlactonas, derivadas biogenéticamente de los sesquiterpenos, son una clase de productos naturales distribuidos menos ampliamente que estos últimos y de ocurrencia predominante en la familia Asteraceae (notablemente en géneros Artemisia Y Ambrosia), de allí que su distribución permite ser aplicada a problemas taxonómicos especialmente en los géneros nombrados y en otras taxas . (17) Las lactonas sesquiterpénicas presentan estructuras que parecen tener un origen común, habiéndose formado en procesos biogenéticos estrechamente relacionados y que permiten proporcionar caracteres químicos útiles dentro de la tribu. Así podemos clasificarlas en tres grandes grupos: lactonas tipo germacranolida, lactonas tipo eudesmanolida y lactonas tipo guayanolida. (18)

Fig. 4 Clasificación de las lactonas sesquiterpenicas

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En 1968 se reportó, a partir de dos colecciones de especies del Perú de Ambrosia arborescens, el aislamiento de damsin (VIII), coronopilin (I), psilostachyin (VI), psilostachyin C (IX), y una pequeña cantidad de lo que parecía ser 11- epidihydropsilostachyina. (11)

Fig. 5 lactonas sesquiterpenicas encontradas en ambrosia arborescens

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Fig. 6 Algunas lactonas sesquiterpenicas encontradas en genero ambrosia

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Fig. 7 Algunas lactonas sesquiterpenicas encontradas en genero ambrosia

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4.4 RELACIÓN ESTRUCTURA ACTIVIDAD DE LACTONAS SESQUITERPÉNICAS 4.4.1 ACTIVIDAD TERAPEUTICA Estudios de la relación estructura-actividad (SAR) dirigidos a evaluar el efecto de varias lactonas sesquiterpénicas (SL) como estimulantes de la germinación de tres especies de Orobanche spp. (O. cumana, O. crenata y O. ramosa) se han logrado. Se ha observado una alta especificidad en la actividad de germinación de SL en el parásito de girasol O. cumana, y se postula una relación entre dicha actividad y el alto contenido de girasol SL. Las propiedades moleculares de los estimulantes de germinación natural y sintética (GR-24, GR7 y Nijmegen-1) y SL se han estudiado utilizando cálculos MMX y PM3. En consecuencia, se han realizado estudios comparativos entre todos ellos y sus actividades. SL probó similitudes presentes en propiedades moleculares tales como el volumen de la molécula y la disposición espacial de la cadena principal de carbono al estimulante de la germinación natural orobanchol. Estas propiedades podrían estar relacionadas con su actividad biológica. (19) Lactonas Sesquiterpénicas (STL) son productos naturales que tienen potente actividad antitrypanosomal in vitro y, en el caso de cynaropicrin, también reduce la parasitemia en el modelo murino de tripanosomiasis. Para explorar su estructura-antitrypanosomal relaciones de actividad, un conjunto de 34 STLs y amino-STLs naturales y semisintéticos probado in vitro contra T. b. rhodesiense (que causa la enfermedad del sueño del este de África) y células de cáncer de mamífero (células L6 de mioblastos de hueso de rata). Se encontró que el αmetileno-γ- La fracción de lactona es necesaria para los efectos antitrypanosomal y la citotoxicidad. Antitrypanosomal (20) 4.4.2 ACTIVIDAD FARMACOLOGICA La altamisa presenta acción bactericida frente a Staphylococus aureus ATCC 25923 y sobre Candida albicans a 1000 g/ml De los componentes de altamisa, el shiramool y la coronopilina exhiben una potente actividad antialimentaria contra plagas que infestan cereales. Por otro lado, la psylostachina es activa frente a afidos y ácaros mientras que la damsina muestra actividad antitumoral y moluscicida. Damsina y psylostachina exhiben efecto estimulante sobre la germinación de semillas a 0.14 g/mm2 e inhibidor a 0.07 g/mm2 (21) FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA/ UNMSM 2016 - II

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4.1.3 ACTIVIDAD CITOSTÁTICA Se ha estudiado el comportamiento citotóxico de numerosas lactonas Sesquiterpénicas, con especial incidencia en el efecto de estos compuestos en la síntesis de macromoléculas. Los primeros resultados sobre su mecanismo de acción indican la necesidad de la presencia de una agrupación -CH = C-C = 0, como parte de un éster, bien como parte de una cetona o lactona, como principal requisito para su actividad anti-tumoral y citostática . Se piensa que el mecanismo de la citotoxicidad es del tipo adición de Michael, entre la parte activa de la lactona y los grupos sulfhidrilo de las enzimas lisosomales. La inhibición de estas enzimas conduce a su vez a la inhibición de la síntesis de ADN y, por lo tanto, a la disminución del crecimiento anárquico de las células neoplásicas. Sin embargo, una hipótesis alternativa para la actividad de las lactonas de los sesquiterpénicos sugiere una alquilación directa del ADN por parte de aquellos compuestos. (22)

4.1.4 ACTIVIDAD ANTITUMORA (ANTICANCERÍGENA, ANTINEOPLÁSTICA)

Está relacionada a la capacidad de formar ductos Michael y se la mide en función de la velocidad de reacción con cisteína. Así, por ejemplo, elefantopina, un germacranólido, reacciona con la misma velocidad (a pesar de poseer dos sistemas “olidos”) que eupatundina , un guayanólido; ello se interpreta con el resultado de la baja capacidad de la lactona endocíclica para interactuar con el nucleófilo. Ambos son cinco veces menos activos que el elemanolido vernolepina, aislada de Vernonia hymenolepsis, el cual también actúa como fitotoxina. La presencia de grupo polares como epóxidos, carboxilatos , hidroxilos, acetoxilos, carbonilos α,β-insaturados, aumenta la efectividad de estas moléculas. (23)

4.1.5 ACTIVIDAD BACTERICIDA Y FUNGICIDA Las lactonas sesquiterpénicas también se probaron como agentes bactericidas y fungicidas. Como anti-bacteriales muestran ser particularmente activas contra las bacterias Gram positivas, aunque también tengan alguna actividad contra bacterias gramnegativos. Los estudios realizados con el propósito de relacionar la estructura química con la actividad bactericida, revelaron que esta última no puede explicarse únicamente por la presencia o ausencia del característico grupo exometilénico. Al igual que para las bacterias, parece que la actividad fungicida de las lactonas no puede explicarse sobre la base de un único aspecto estructural. Puede ser necesaria la presencia de uno o más centros activos para la FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA/ UNMSM 2016 - II

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actividad fungicida de algunas lactonas, o pueden reforzar la actividad de otros grupos funcionales. También la actividad contra los hongos puede determinarse por diferencias de fisiología de las especies individuales. (22) En este grupo se encuentran los germacranólidos: mikanólido aislado de Mikania monagensis y tayunina (de Inula viscosa) y el pseudoguayanólido aislado de especies de Helenium, helenalina (23) 4.1.6 ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA La actividad antiinflamatoria de las lactonas sesquiterpénicas es conocida desde hace mucho, ya que las plantas que contienen metabolitos secundarios se han utilizado como medicamentos antipolíticos y antiinflamatorios. Estudios recientes demostraron que muchas drogas anti--inflamatorias conocidas, como la azotioprina y la D penicilamina, utilizadas en el tratamiento de la artritis reumatismal, actúan del mismo modo que las lactonas sesquiterpénicas, es decir a través de los grupos sulfhidrilo de las enzimas, aunque no se conoce la exacta etiología de muchos de los procesos inflamatorios que atacan al hombre, se piensa que existe una implicación de los grupos sulfhidrilo de las enzimas celulares. Así, las drogas que se unen a estos los grupos, bloqueándolos, revierte el proceso inflamatorio. (22)

4.1.7 ACTIVIDAD FITOTÓXICA El crecimiento de ciertos vegetales es detenido por principios fitotóxicos como por ejemplo la heliangina, un germacranólido aislado de Heliantus tuberosus que en concentraciones del orden de 10-3 mmol/ml inhibe el crecimiento de las plantas jóvenes de arroz. Por su parte, la alatolactona, eudesmanólido (de Inula sp.) es un retardador potente de la germinación de las semillas y del crecimiento de los retoños. Se supone que su actividad es consecuencia de la inhibición que ejerce sobre la amilasa y la proteasa. Existen varios compuestos que exhiben fitotoxicidad como los indicados y ésta se anula por acción de la cisteína. (23)

Fig. 8 Estructura general de las lactonas sesquiterpenicas

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4.5 PROPIEDADES ARBORESCENS

MEDICINALES

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AMBROSIA

La actividad antibacteriana de diferentes extractos y partes de la planta ha sido extensamente evaluada habiéndose obtenido resultados positivos solamente frente al Staphylococcus aureus con los extractos etanólicos y acuoso preparado con la planta entera. El aceite esencial de las hojas es activo contra S. aureus, Pseudomonas aeruginosa y Klebsiellapneumoniae. Un extracto etanólico (95%) preparado a partir de las partes aéreas de la planta presenta una débil actividad frente a Plasmodium falciparum responsable de la malaria. Y el extracto acuoso del fruto, presenta una actividad espasmogénica. La planta presenta una actividad bloqueadora neuro-muscular; y un extracto etanólico. La resina de la planta presenta una actividad antioxidante en la materia. Presenta las actividades analgésica, anticonvulsiva, antiespasmódica, hipoglicémica y diurética de un extracto etanólico-acuoso de la planta, al igual que la actividad hipotensora de un extracto acuoso del fruto, y antitumoral de un extracto etanólico. (12)

5 METODOLOGÍA 5.1 MATERIALES



Beakers 100 mL,250 mlL



Bagueta

 Capilares de vidrio  Cuba cromatográfica de vidrio  Embudos de vidrio 

Espátula de metal



Gradilla



Lavatorio

 Matraz 150 mL,250 mL  Papel Craft 

Papel Filtro rápido

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

Papel toalla



Parrilla porta placas cromatográficas



Pera de bromo PIREX 125 mL



Pipeta Pasteur 3 mL



Pipetas de 5mL, 10 mL



Placa de vidrio para cromatografía d 20x20 cm2;5x10 cm2

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 Platos de loza 

Probeta 100 mL



Propipeta

 Soporte universal  Tazón 

Tocuyo



Tubos de ensayo 5mL y 10mL



Vacuette

 Viales 5.2 MATERIAL VEGETAL Hojas de Ambrosia arborescens Mill (Altamisa o marco)

5.3 REACTIVOS 

Diclorometano



Alcohol 70°



Alcohol 96°



Reactivo de Legal



Reactivo Baljet



Silicagel 60G/Merck

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5.4 EQUIPOS 

Balanza digital 0.1mg sensibilidad marca: RADWAG; modelo: AS 220.R2



Balanza marca: OHAUS; modelo: PA214



Cocinilla marca MERCK modelo



Espectrofotómetro Genesys 10S UV-Vis marca : Thermo SCIENTIFIC



Estufa memmert Nenntemp 300°C



Equipo filtradora al vacío Marca: DIVAC 0.6 L



Refrigeradora LIEBHERR modelo LKexv 3600 Index 20C/001



UVP Chromato – Vue® C-70G UV Viewing System

SP13132033

5.5 MÉTODOS 5.5.1 LOCALIZACIÓN DEL DESARROLLO DEL PROYECTO Laboratorio de Química Orgánica de la facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

5.5.2 RECOLECCIÓN DE LA ESPECIE VEGETAL Las hojas en buen estado de Ambrosia arborescens “altamisa” se recolectarán en el distrito de Huaraz, departamento de Áncash, el material vegetal será traído a Lima por vía terrestre. Lugar la Parada- Lima. Mercado hierba santa.

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5.5.3 CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA Las hojas fueron identificadas taxonómicamente en el Museo de Historia Nacional de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos por el Biólogo Hamilton Beltran Santiago, quien certifica que según el sistema de Arthur Cronquist 1981 la especie vegetal es Ambrosia arborescens Mill.

Fig. 9 Ficha taxonómica Ambrosia arborescens Mill.

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5.5.4 ANALISIS FITOQUÍMICO Preparación del extracto Se realizará una doble maceración usado 30 g de hojas de altamisa seco y molido en 5oo ml de etanol de 70% en cada maceración, que luego se filtrará en frio por medio de filtración desechable (tocuyo) y filtración al vacío. (24) (4) Después de la filtración los extractos se depositarán en un recipiente de vidrio o porcelana no cerrados, los cuales serán llevados al desecador al vacío para un secado efectivo y cuidadoso. (25)

Extracción del filtrado seco Se retirará los platos de porcelana de la estufa, una vez que el solvente se haya evaporado y se encuentre seco el filtrado, para realizar la técnica de raspado que será llevado a cabo mediante una espátula. (26) Eliminación de la clorofila El extracto etanólico seco 1.2 g será tratado con solución de acetato de plomo 10 % y con gotas ácido acético para la precipitación de clorofila. Esta mezcla se llevará a filtrar usando papel filtro, posteriormente se procederá a decantar la mezcla con solución diclorometano, produciéndose dos fases reforzándolo con cloruro de sodio. La fase acuosa se llevará a baño maría para la evaporación del solvente que dará una solución amarillenta representada la muestra libre de clorofila. (27) (28) (29) (30) Identificación de lactonas sesquiterpénicas Se usará un tubo pequeño que contenga VIII gotas del extracto libre de clorofila, donde se añadirá 2ml de la mezcla de Baljet A Y Baljet B, que dará como resultado una reacción positiva rojo oscuro. (31) (32)

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5.5.5 AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE LACTONAS Método de extracción Se pesará 100 g de hojas seleccionadas secas y molidas previamente estabilizadas, se procederá a una extracción secuencial continua por el método de Soxhlet utilizando como solvente al diclorometano por 6 horas. (33) Luego se procede a concentrar el extracto, el concentrado se redisuelve en etanol caliente y se añadirá una solución acuosa de acetato de plomo al 5%, con lo cual se precipitan sustancias más polares para así eliminar la clorofila,

luego

precipitantes,

el

realizaremos filtrado

el

filtrado

para

separar

se volverá a concentrar

y

las se

sustancias

someterá

a

cromatografía. (5) Aislamiento de lactonas sesquiterpénicas Se realizará pruebas preliminares para determinar el sistema de solventes más adecuado para la separación de las lactonas sesquiterpénicas utilizaremos sílica gel de 0.25 mm y solventes como diclorometano, benceno, acetato de etilo y metanol en distintas proporcione: éter etílico diclorometano (1:3); diclorometano, acetona (6:4), tricloruro de metilo, metanol (9:1); benceno y acetato de etilo (5:5). (34) (35) (36) Se usará agentes reveladores para los análisis por cromatografía en capa fina, pueden utilizarse: Ácido sulfúrico concentrado y calentamiento, vapores de yodo, luz ultravioleta 254 nm o permanganato de potasio al 1% o el p– dimetilamino benzaldehído. En donde el Rf para lactonas sesquiterpénicas oscilará entre 0.65-0.45. (37) IDENTIFICACIÓN DE LACTONAS SESQUITERPÉNICAS Métodos de coloración: a. Preparación de Baljet b. Preparación de Legal c. Preparación de hidroxamato férrico

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5.5.6 ESQUEMA METODOLOGICO EXTRACCION DE LACTONAS

IDENTIFICACION DE LA ESPECIE VEGETAL RECOLECCION DE ALTAMISA

SECADO

DESINFECCIÓN MÉTODO

CORTE CUCHILLAS

METODO

SOXHLET

SECADO DEL EXTRACTO DESTILACION

ELIMINACION DE CLOROFILA EXTRACCIÓN POR DECANTACIÓN

DICLOROMETANO: ACETONA 8:2, 9:1

CONCENTRACIÓN DEL EXTRACTO SELECCIÓN DE ENSAYOS (SOLVENTES) CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

CROMATOFOLIO: 10X5CM

CROMATOGRAFÍA EN CAPA PREPARATIVA (CPP)

CROMATOPLA CA:20X20CM

AISLAMIENTO DE COMPUESTOS CROMATOFOLIO: 20X10

CROMATOGRAFÍA EN CROMATOFOLIO

RECONOCIMIENTO DE LACTONAS SESQUITERPÉNICAS

REACTIVO DE BALJET

REACTIVO DE LEGAL

REACTIVO DE HIDROXAMATO FERRICO

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6. PARTE EXPERIMENTAL 6.1 PRIMER PROCESO PARA RECONOCIMIENTO DE LACTONAS, MARCHA FITOQUIMICA Y EXTRACCION DE LACTONAS. A) RECOLECCIÓN Se colectó Altamisa del mercado mayorista ubicado en Cercado de Lima, la planta se conoce más como Marco en los centros de venta de yerbas nativas. Colectándose 4 Kl de yerba fresca.

Fig.10.Recolección de Altamisa o Marco

B) DESINFECCIÓN DE LA PLANTA

Fig. 11: Lavamos la planta con 2 gotas de lejía para su desinfección, separamos las hojas del tallo y dejamos secar las hojas y tallos a temperatura ambiente.

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C) SECADO

Fig 12. Secado en estufa de Altamisa a 36°C

Las hojas se colocan en bandejas hechas de papel craft, luego se colocaron en estufa a temperatura 36°C, hasta tener un peso constante, el cual ocurrió tras 9 horas de secado D) CORTE CUCHILLAS Tras obtener la muestra seca de Altamisa, se procedió al triturado con cuchillas, para tener mayor cantidad de superficie de contacto con el solvente extractor.

Fig 13: Muestra seca de Altamisa

Fig 14. Muestra seca y triturada

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6.2 PROCEDIMIENTO RECONOCIMIENTO DE LACTONAS SESQUITERPENICA A) MACERACION

Fig 15: se colocó 50 gr de esta muestra seca en el bidón ámbar, donde se agregó 250 mL de diclorometano, dejándose macerar durante 1 semana.

B) FILTRACION

Fig 16 La filtración del extracto, se realizó una filtración por gravedad utilizando papel filtro y tocuyo como material de tamizaje

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C) SECADO

Fig 17. se colocó el extracto filtrado en platos de porcelana, luego se llevó a la estufa a 40 °C hasta sequedad.

D) ELIMINACIÓN DE LA CLOROFILA Y CONCENTRADO Una vez seco el extracto se procedió a rasparlo, para luego pesarlo en un beacker, previamente tarado, teniendo 1,2g de extracto al cual agregamos 20mL de acetato de plomo y 10 gotas de ácido acético y procedimos a disolver el extracto que posteriormente filtramos para colocarlo en una pera de bromo y realizamos una extracción doble con 10 mL de diclorometano cada una, separando la fase acuosa. Esta fase fue llevada a baño María para la evaporación del diclorometano.

Fig 18: Pesada del extracto etanólico de Ambrosia arborescens Mill.

Fig 19: Disolución del extracto con 20mL de acetato de plomo y 10 gotas de ácido acético para su posterior filtración.

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Fig 20: Extracción doble con 10 mL cada una de diclorometano y decantación de la fase acuosa.

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Fig 21: Eliminación del diclorometano por evaporación en baño maría.

E) PREPARACION DE BALJET Se utilizó reactivo de Baljet para identificar las lactonas sesquiterpenicas en donde se agregó primero 1 ml de Baljet A y 1 ml de Baljet B. Preparamos la muestra problema + 5 gotas de reactivo Baljet preparado donde fue positiva la reacción observándose la aparición de un color naranja-rojo.

Fig 22. Baljet a al 1% de etanol y baljet b hidróxido de sodio 10% de agua.

Fig 23. amarillo es Baljet , rojo es el resultado como cambio de color positivo para lactonas Sesquiterpénicas

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6.4 PROCEDIMIENTO EXTRACCION DE LACTONAS A) METODO SOXHLET Se pesó 25.3102g de muestra, se colocó en una bolsita de tocuyo y se cerró, para colocarla en el cuerpo del equipo de Soxhlet. Una vez esto, se procedió a colocar diclorometano hasta llegar a sobrepasar el tope del cartucho insertado, hasta pasar el brazo de sifón, arrastrando de esa manera el diclorometano hasta el balón, una vez esto se procedió a calentar hasta 90°C bajo agitación de 2.5 rpm usando una pastilla y agitación magnética en el plato calefactor. El primer reflujo se contó transcurridos 160 minutos, realiza´ndose en total 10 reflujos. Una vez realizado esto, se procedió al limpiado del equipo y postrior concenrtación en platos de porcelana a 40 °C en estufa.

Fig 30. Pesado de muestra seca triturada

Fig 31. Extracción por Sohxlet

Fig 34. Concentración del extracto

Fig 32. Limpieza de residuos en balón

Fig 33. Residuos tras la extracción por Soxhlet

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B) EXTRACCIÓN DE LA CLOROFILA se procedió a rasparlo los, pesamos el beacker, previamente tarado, 53.02 g de extracto + beacker, al restarlo hallamos la cantidad de muestra que fue 3 g al cual agregamos 50 mL de acetato de plomo y 25 gotas de ácido acético y procedimos a disolver el extracto que posteriormente filtramos para colocarlo en una pera de bromo y realizamos una extracción doble con 20 mL de diclorometano cada una, separando la fase acuosa la cual usamos para sembrar y comenzar a realizar la cromatografía.

Fig 35. Pesada de beacker + muestra 53.02 g, beacker solo 50.08 g, dando resultado 2.94 g de muestra

Fig 36.Agregando 50 mL de acetato de plomo y 25 gotas de ácido acético FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA/ UNMSM 2016 - II

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C) EXTRACCIÓN POR DECANTACIÓN

Fig 37. Al filtrar con papel filtro se obtuvo dos porciones una más oscura y otra más clara, por lo cual estas dos fases las colocamos por separado en peras de decantación a la cual añadimos 20 mL de diclorometano cada una, decantamos en colocándolos en matraces y realizamos la cromatografía con estas dos fases acuosas para confirmar si se extrajo la clorofila y sobre todo cual de ambos extractos es más visible las lactonas.

D) SELECCIÓN DE ENSAYOS Antes de decidir cuál tipo de extracto usar y cuál método de extracción de clorofila utilizar, se procedió a hacer ensayos previos en TLC. El primer sistema de solventes fue 1:9 (acetona:diclorometano), en donde se revelan la línea azul brillante característica de lactonas sesquiterpénicas. En las dos primeras

Fig. 38. Sistema de solventes 2:8 (acetona:diclorometano)

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Fig. 39 placas de la izquierda fue con 5 siembras y el tercero con 15 siembras.

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Figura 40. Revelado de placas en el sistemas acetona: diclorometano(1:9)

E) CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA Realizamos el sembrado de las fases acuosa y orgánica, notamos que el primer extracto la clorofila aún está presente, pero se está dirigiendo hacia la parte superior y se logra notar con más claridad una mancha azul lo cual es la lactonas

Fig 41. Se preparan las placas para cromatografía usando silicagel y alcohol

Fig 42.Realizamos la siembra de 4 puntos correspondientes a las 2 fases acuosas y 2 fases orgánicas, dimos 10 pasadas en cada punto.

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365 nm

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254 nm

Parte orgánica 1

Parte acuosa 2

Parte acuosa 1

Parte orgánica 2

Fig 43.Llevamos la placa a la cámara UV, notamos que la luz de 365 nm es mejor y se ve la mancha azul representando a la lactona F) CROMATOGRAFIA EN CAPA PREPARATIVA Se prepararon placas con sílica y se le realizó el sembrado de 20 puntos a cada una, con 20 siembras(fig 45.). En la siguiente figura 46 se muestra el sistema solvente de 1:1 aetona: diclorometno el cual dio mejo resultado en los otros ensayos, se utilizó la muestra de extracto de diclorometano por Soxhlet y sin quitar la clorofila. Luego se secó por unos minutos en la estuf y se procedió a revelar en la cámara UV-VIS, con la luz UV.

Fig 44. Sembrado en placa

Fig 45. Sistema solvente 1:1 acetona:diclorometano(20 mL)

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Fig 46. Secado en estufa

Fig47. Corrida de muestra con clorofila G) PRUEBA DE CROMATOPLACAS A

B

C

D

FRACCION 1 FRACCION 2

Fig. 48. Revelado de 4 cromatoplacas (A, B,C,D) a 365 nm., Se visualizan 2 fracciones, las cuales marcamos para posteriormente rasparlas con una espátula

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H) PROCESO DE FRACCIONAMIENTO Raspado línea 1

Raspado línea 2

1 2

Fig 49.Raspamos las placas, obteniendo más muestra en la segunda línea

Fig 50. Las fracciones se colocaron en 3 Vacuette bien secos y los guardamos rotulándolo para después ser separadas de la silicagel con diclorometano, filtramos y de esta manera obtener los metabolitos.

I) PROCESO DE ADSORCION

Fig 51. Trasladamos lo raspado en 2 matraces adicionamos diclorometano y agitamos

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J) PROCESO DE FILTRADO

Fig 52.se adiciona diclorometano hasta dejar el matraz sin silicagel aproximadamente se usó 40 ml x muestras, Filtramos en tubo de desprendimiento, separamos 2 tubos para las 2 muestras.

K) PROCESO DE CRISTALIZACION

Fig 53. El silicagel lo guardamos en sobres, el filtrado lo dejamos beacker y

dejamos que se evapore para obtener

Fig 54. Realizamos baño Maria para que se evapore el diclorometano, se ven los cristales de cada muestra, luego se diluye con metanol.

los cristales.

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L) REVELADO UV Una vez obtenido los cristales se procede a disolverlos en 3 mL de metanol para su posterior lectura en el espectrofotómetro. Se utilizó dos celdas de cuarzo, en la primera se colocará el disolvente (metanol) y se colocó en el espacio del blanco, mientras que en el segundo la muestra en el espacio 1. Se procedió a calibrar el equipo midiendo la línea base y se hace una lectura de barrido de longitud de onda desde 200 nm hasta 400nm, observándose las curvas espectrales y los datos mostrados por el equipo.

FRACCION 1

Fig 55. Gráfica del espectro de cristales disueltos de Altamisa

FRACCION 2

Fig 56. Barrido de fracción dos

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7. RESULTADOS: 7.1 REVELADO DE LAS CROMATOPLACA (métodos instrumentales) ESPECTROSCOPIA UV MUESTRA CRISTALES REDISUELTOS EN METANOL Se realizaró un análisis de espectroscopia UV utilizando un espectrofotómetro UV-Visible de 200 a 400 nm usando como solvente metanol y se obtendrá datos como la longitud de onda optima y su máxima absorbancia. (38) (39) (40) En la figura 56 se muestra la absorbancia obtenida para la primera fracción de revelado en el espectrofotómetro, donde se observó que a una longitud de onda de de 220nm se formó el pico más elevado y perfilado, sin embargo se tienena 280 nm otro pico pero menos visible que el anterior.A una absorbancia de 2650. En la figura 57 , la fracción dos muestra un pico ligeramente distorcionado a una longitud de onda entre 220 y 230 nm. Lo cual nos puede indicar que nuestro mayor contenido de muestra lo podemos encontrar entre este rango de 220 a 230 nm de longitud de onda.

ESPECTROSCOPÍA IR y RMN

El producto purificado obtenido será sometido a un análisis espectroscópicos de Resonancia magnética nuclear protónica (RMN-1H), del carbono-13 (RMN13C) y espectroscopía infrarroja (IR). Para la determinación de la estructura molecular de las lactonas presente en la Ambrosia arborescens. (29) (40) La espectroscopia vibracional fue una de las primeras técnicas espectroscópicas que encontró un uso extendido, en particular la espectroscopia de absorción infrarroja (IR) que recibe su nombre de la región del espectro electromagnético implicada. (41) La espectrometría infrarroja se basa en el hecho de que los enlaces químicos de las sustancias tienen frecuencias de vibración específicas, que corresponden a los niveles de energía de la molécula. Estas frecuencias dependen de la forma de la superficie de energía potencial de la molécula, la geometría molecular, las masas atómicas y, posiblemente, el acoplamiento vibracional. (41)

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Es utilizado para el análisis de compuestos orgánicos, inorgánicos u organometálicos que contengan átomos pesados (masa atómica superior a 19) y proporciona información útil en estudios estructurales. Una de las grandes ventajas de la espectroscopia IR es su versatilidad, ya que permite estudiar prácticamente cualquier muestra con independencia del estado en que se encuentre: líquidos, disoluciones, pastas, polvos, fibras, films, gases o superficies son algunos ejemplos. (42) La interacción de la radiación infrarroja con la materia provoca en ésta alguna alteración. En el caso que nos ocupa, esta alteración guarda relación con cambios en el estado vibracional de las moléculas. El espectro vibracional de una molécula se considera una propiedad física única y por tanto característica de ésta molécula. Así, entre otras aplicaciones, el espectro IR se puede usar como “huella dactilar” en la identificación de muestras desconocidas mediante la comparación con espectros de referencia. (42) Como referencia podemos tomar el estudio de Terrones donde en el espectro infrarrojo (figura ) se observa claramente la presencia de 2 grupos carbonilo de la γ-lactona α-metilénica a 1773 cm-1y a 1718 cm-1, el carbonilo de la espirolactona. (5)

Fig. 57 espectro infrarrojo, Teresa Cano de Terrones

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8 .DISCUSIÓN Los SL son un grupo importante de productos naturales obtenidos de muchas especies de plantas medicinales. Su diversidad estructural y diversas actividades biológicas potenciales, tales como anticancerígenas, antiinflamatorias, antitumorales, antipalúdicas, antivirales, antibacterianas, antimicóticas, etc., han despertado un mayor interés entre los químicos por la investigación de descubrimiento de fármacos. Aunque el mecanismo exacto de acción de SL no es bien conocido, se ha documentado a través de varios informes publicados que la actividad biológica mostrada por la mayoría de SL se debe a la presencia de α-metileno-γ-lactonas y ciclopentenona α, β-insaturada anillo. (19) En general, se cree que la bioactividad de SL está mediada por la alquilación de nucleófilos a través de sus estructuras de carbonilo α-, β- o α, β, γ-insaturadas, tales como α-metileno-γ-lactonas o ciclopentenonas α, β-insaturadas . Estos elementos de estructura reaccionan con nucleófilos, especialmente los grupos sulfhidrilo de cisteína por adición de tipo Michael. (20) (43)Por lo tanto, es ampliamente aceptado que los grupos tiol tales como los residuos de cisteína en las proteínas, así como el GSH intracelular libre, sirven como los objetivos principales de SL. En esencia, la interacción entre los SL y los grupos proteína tiol o GSH conduce a la reducción de la actividad enzimática o causa la alteración del metabolismo de GSH y el equilibrio redox de células intracelulares de vital importancia. (19) Las lactonas sesquiterpénicas (LS) están usualmente dentro de los tricomas glandulares (44) , así para extraer de mejor manera LS se procedió a secar la muestra y triturar para ener una mayor superficie de contacto con el solvente a elección, se suele usar cloroformo (45), acetona (46), así también diclorometano (44), utilizamos el diclorometano por tener buenos resultados en otras inestigaciones. En general, estos metabolitos , se obtienen a partir de mezclas de complejos de extractos concentrados de plantas, como en nuestro caso, concentrado por Soxhlet y macerado en etanol al 96% y el contenido tanto cualitativo como cuantitativo de los compuestos puede ser muy variable. El número de compuestos obtenidos, sus cantidades y su cantidad relativa depende de cómo se trata el material biológico, qué técnica se usó para evaluar la variabilidad química de la muestra. Ya que hubieron muchas pruebas previas hasta encontrar el extracto y método adecuado de extracción y purificación de lactonas sesquiterpénicas. (45) (47) (48) (49) Tras el ensayo de Baljet se determinó la presencia de LS, con una coloración amarilla naranja, tal y como se puede evidenciar en otros trabajos (32,6,31). Los cuales hacen referencia también a lactonas sesquiterpénicas reveladas tras tornarse color amarillo con el reactivo mencionado. FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA/ UNMSM 2016 - II

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La extracción de las LS realizada en el equipo de Soxhlet empleando como solvente diclorometano (DCM) por 40 horas y cumpliendo 10 ciclos, su producto fue analizado tras desecarse en la estufa a 40°C. Así también hay antecedentes de ser uno de los mejores métodos de extracción usando DCM y equipo de Soxhlet (47) (49), con los cuales continúan tras la extracción, pruebas de identificación por HPLC, IR, UV entre otras. Tras haber realizado extracciones con diclorometano en la muestra de Ambrosia arborescens, se lograron determinar bandas de color azul características de lactonas sesquiterpénicas, las cuales según bibliografía indican que pueden ser observadas en el espectrofotómetro UV luego de ser concentradas tras un raspado de la placa de cromatografía en capa fina; sin embargo los procesos empleados para aislar e identificar metabolitos secundarios determinan fuertemente el resultado final del análisis. Así también hay trabajos que señalan que se observa una mayor absorbancia de lactonas LS a 210 nm (50) El fraccionamiento de las LS se realizó mediante cromatografía de capa fina preparativa (CCF) empleando como fase estacionaria sílicagel HF, y como fase móvil DCMacetona(8:2) y revelador lámpara UV a 254 y 365 nm. Se obtuvieron 4 fracciones (f) eligiéndose las mayoritarias f1 y f2, las cuáles fueron eluídas con DCM. Se determinaron los respectivos espectros UV de las fracciones f1 y f2. Por antecedentes bibliográficos se puede concluir que existen LS α, β insaturadas ya que éstas son visibles en un rango entre 205 a 225 nm. Se encontró que los eudesmanólidos se encuentran entre 214-230 nm y así también la LS Damsina se visualiza a 214 nm; para la f1 en el espectro UV fue a 215nm, lo cual puede sugerir que se trata de una damsina. En tanto, para la f2 se encontró el máximo pico a 230 nm, lo cual puede sugerir que se trata de una isofotoartemisina la cual tiene una λ 238 nm.

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9 .CONCLUSIONES 

Se determinó la presencia de lactonas sesquiterpénicas en hojas de Ambrosia arborescens Mill.



Se logró Identificar la presencia de lactonas sesquiterpenicas en hojas de Ambrosia arborescens Mill realizando análisis fotoquímico por medio de la aprueba de Baljet dando una reacción positiva al dar un color anaranjado o rojo oscuro de la reacción.



Se logró extraer lactonas sesquiterpenicas mediante el método de Soxhlet, usando como solvente diclorometano.



Se aislaron dos lactonas sesquiterpénicas de la altamisa (Ambrosia arborescens Mill.) por cromatografía en capa fina.



Se reconoció el posible tipo de lactonas sesquiterpénicas que son α, β insaturadas presente en las hojas secas de Ambrosia arborescens Mill. “altamisa”, una posible Damsina visualizada a 214 nm; para la f1 en el espectrofotómetro UV y otra posible isofotoartemisina visualizada a una λ 238 nm en el espectrofotómetro UV.

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ANEXOS Ensayo de Baljet Es útil para reconocer la presencia de compuestos con agrupamiento lactonico, en particular cumarinas, aunque otros compuestos lactonicos pueden dar resultado positivo. Si la alícuota de la muestra a probar no está en alcohol, debe evaporarse el solvente en baño en agua y redisolverse en 1ml de alcohol. Seguidamente, se añade 1ml del reactivo. La prueba positiva, cuando aparece una coloración o precipitado de color rojo Se utiliza dos soluciones que se mezclan en iguales volúmenes antes de usarse. Solución a: se coloca 1g de ácido pícrico en 100 ml de etanol. Solución b: se agregan 10 g de NaOH EN 100 ml muestra y 3 a 4 gotas del reactivo, siendo la prueba positiva si adquiere una coloración naranja o rojo oscuro. Prueba de Legal Una pequeña cantidad 2mgde muestra se disuelven en 2 a 3 gotas de piridina; enseguida se añade 1 gota de solución reciente de nitroprusiato de sodio al 0.5% y después se añaden gota a gota 4 gotas de hidróxido de potasio 2N, observándose coloraciones rojo azul, rosa y violeta.22 Siempre que se hace el ensayo del hidroxamato se debe hacer el ensayo de blanco para poder comparar la coloración, ya que ésta no es siempre roja-azulosa, o la sustancia puede formar coloración con el cloruro férrico, caso en el cual se tendría una interferencia y el ensayo no sería Confiable. Es posible que los hidroxiácidos den prueba positiva como si fueran ésteres, ya que los pueden formar consigo mismos. Hidroxamato férrico Se tomó el extracto disuelto en éter de petróleo y se le adicionaron 2 gotas de solución metanólica de clorhidrato de hidroxilamina y 2 gotas de Solución metanólica de hidróxido de potasio. Posteriormente se calentó en baño maría y se le agregó una gota de cloruro férrico y ácido clorhídrico. Esto con el fin de identificar la presencia de sesquiterpenlactonas.

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ESPECTRO UV FRACCION 1

ESPECTRO UV FRACCION 2

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