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• Ingrid Karol Conislla Huaman

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METABOLISMO MICROBIANO CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS GRUPOS MICROBIANOS Las bacterias se encuentran en casi todos los ambientes e intervienen en varios procesos biológicos. El crecimiento microbiano requiere la formación de estructuras complejas como proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos y lípidos a partir de elementos preformados en el medio de crecimiento o ser sintetizados por la propia célula, a su vez, este crecimiento necesita de una fuente de energía para ser llevado a efecto, todo este proceso se designa con el nombre de metabolismo, que se define como todas las transformaciones químicas que ocurren en una célula. Todos los seres vivos llevan a cabo el procesamiento de los nutrientes que los mantienen vivos. A este conjunto de procesos, se le conoce como metabolismo y consiste de un gran número de reacciones químicas destinadas a transformar las moléculas nutritivas en elementos que posteriormente serán utilizados para la síntesis de los componentes estructurales; como pueden ser las proteínas. Otra parte importante del metabolismo es la de transformar y conservar la energía que está contenida en una reacción química en algún proceso que requiera de energía como puede ser el trabajo o el movimiento. Es evidente que los nutrientes son transformados cuando entran en un organismo, ya que en ningún caso el alimento contiene todas las moléculas que una célula requiere. Esto se vio con claridad al observar el crecimiento normal de levaduras en un medio de cultivo que sólo contenía glucosa como única fuente de energía. Así pues, se pensó que la síntesis de todos los componentes celulares se llevaba acabo en el interior de las levaduras. Hoy se conoce que las transformaciones que sufre la glucosa no ocurren en un solo paso, sino que, por el contrario, se forman varios productos intermedios que en muchas ocasiones no tienen una función específica a no ser la de formar parte delo que se conoce como vía metabólica. La transformación de los nutrientes en compuestos útiles para la subsistencia de un organismo se lleva a cabo por medio de las reacciones químicas que realizan unas proteínas conocidas como enzimas. El término metabolismo se refiere al conjunto de reacciones químicas que tiene lugar en la célula, y tiene tres funciones específicas a saber: - Obtener energía química del entorno, almacenarla, para utilizar luego en diferentes funciones celulares, - Convertir los nutrientes exógenos en unidades precursoras de los componentes macromoleculares de la célula bacteriana, - Formar y degradar moléculas necesarias para funciones celulares específicas, como por ejemplo, movilidad y captación de nutrientes.

La energía liberada en las reacciones catabólicas se usa para fosforilar ADP,generando ATP. La energía almacenada en el ATP se utiliza en la mayoría de los trabajos celulares. Por lo tanto, el ATP acopla los procesos productores de energía de la célula a los consumidores de energía. Figura Nº 1.2. Todos los procesos que ocurren en la célula o bacteria requieren de energía. Esta energía está almacenada como moléculas de ATP, que se forma a partir de ADP y fosfato inorgánico.

El metabolismo tiene lugar a través de secuencias de reacciones catalizadas enzimáticamente, y se divide en anabolismo y catabolismo. El proceso por el cual la célula bacteriana sintetiza sus propios componentes se conoce como anabolismo, y como resulta en la producción de nuevo material celular, también se denomina biosíntesis. La biosíntesis es un proceso que requiere energía, por lo tanto las bacterias deben ser capaces de obtenerla de su entorno para crecer y, eventualmente, multiplicarse. El conjunto de reacciones de gradativas de los nutrientes para obtener energía o para convertirlos en unidades. Figura N° 1.3.

TIPOS DE METABOLISMO MICROBIANO Los distintos tipos de metabolismo microbiano se pueden clasificar según tres criterios distintos: 1. La forma la que el organismo obtiene el carbono para la construcción de la masa celular: 

Autótrofo. El carbono se obtiene del dióxido de carbono (CO2).



Heterótrofo. El carbono se obtiene de compuestos orgánicos (glucosa, por ejemplo).



Mixótrofo. El carbono se obtiene tanto de compuestos orgánicos como fijando el dióxido de carbono.

2. La forma en la que el organismo obtiene los equivalentes reductores para la conservación de la energía o en las reacciones biosintéticas: 

Litotrofo. Los equivalentes reductores se obtienen de compuestos inorgánicos.



Organotrofo. Los equivalentes reductores se obtienen de compuestos orgánicos.

3. La forma en la que el organismo obtiene la energía para vivir y crecer: 

Quimiotrofo. La energía se obtiene de compuestos químicos externos.



Fototrofo. La energía se obtiene de la luz.

En la práctica, estos términos se combinan casi libremente. Los ejemplos típicos son como sigue: 

Los quimiolitoautótrofos obtienen energía de la oxidación de compuestos inorgánicos y el carbono de la fijación del dióxido de carbono. Ejemplos: bacterias nitrificantes, bacterias oxidantes del azufre, bacterias oxidantes del hierro, bacterias oxidantes del hidrógeno.



Los fotolitoautótrofos obtienen energía de la luz y el carbono de la fijación del dióxido de carbono, usando compuestos inorgánicos como equivalentes reductores.

Ejemplos: Cyanobacteria (agua

como

equivalente

reductor), Chlorobiaceae,Chromaticaceae (sulfuro

de

hidrógeno), Chloroflexus (hidrógeno). 

Los quimiolitoheterótrofos obtienen energía de la oxidación de compuestos inorgánicos, pero no pueden fijar el dióxido de carbono. Ejemplos: algunos Nitrobacter spp., Wolinella (con

hidrógeno

como

equivalente

reductor), algunas bacterias oxidantes del hidrógeno. 

Los quimioorganoheterótrofos obtienen energía, carbono y equivalentes reductores para las reacciones biosintéticas de compuestos orgánicos. Ejemplos: La mayoría de las bacterias, como Escherichiacoli, Bacillus spp., Actinobacteria.



Los fotoorganotrofos obtienen energía de la luz y el carbono y los equivalentes reductores para las reacciones biosintéticas de compuestos orgánicos.

COMPETENCIAS  Manipula e identifica los microorganismos en función a su comportamiento bioquímico.

MATERIALES Y EQUIPOS  Placas con agar nutritivo con 1% de almidón  Tubos con: gelatina, caldo peptonado, caldo MR – VP (Rojo de Metilo – VogesProskauer), caldo lactosado con indicador de Andrade.  Tubos con medio de: Citrato de Simmons en plano inclinado, Urea, TSI en plano inclinado y con TSA.  Cultivos

de:

E.

coli,B.

subtilis,Ps.

aeruginosa,

Enterobacter,Proteusvulgaris,Staphylococcus. aureus,Streptococcusviridans.  Lugol.  Reactivos de: kovac´s, rojo de metilo, Voges – Praoskauer: alfa-naftol al 5%, en alcohol amílico, KOH – creatina al 40%  Tiras de papel de filtro impregnadas con solución saturada de acetato de plomo.  Peróxido de hidrógeno al 3%.  Campanas de Durham y pipetas Pasteur.

PROCEDIMIENTO 1. UTILIZACION DE CARBOHIDRATOS A.) CALDO LACTOSADO

Inocule en el tubo de caldo lactosado con Shigella. Incubar a 37 ºC por 24 horas.

B.) TSA CON ALMIDON 5%

Siembre en la placa petri que contiene TSA con almidón al 5 % el m.o Shigella, incube a 37 ºC por 24 horas.

C.) TSI: TRIPLE SUGAR IRON

Con el asa de siembra, inocule una porción pequeña de la colonia en el centro del tubo y estríe la superficie del pico de flauta. Rotular e incubar a 37ºC por 24 horas.

D.) PRODUCCION DE ACIDOS Y ACETIL-METIL-CARBINOL (ACEOTINA)

1. PRUEBA DE VOGES PROSKAUER Por la técnica de inoculación sembrar el m.o Shigella, incubar a 37ºC por 24 horas.

2. PRUEBA DE ROJO DE METILO Por la técnica de inoculación sembrar el m.o Shigella, incubar a 37ºC por 48-72horas.

2. PROTEINAS A.) HIDRÓLISIS DE LA GELATINA Inocule el m.o Shigella en el tubo que contiene gelatina haciendo uso de un asa en punto introduciendo de manera vertical hasta el fondo del tubo.

B.) PRODUCCION DEL INDOL

Inocule el m.o Shigella en el tubo que contiene caldo peptonado haciendo uso de un asa en punto por el método de inoculación. Inocule a 37 ºC por 24 horas. Al segundo dia agregue 4 gotas del reactivo de Kovac dejando resbalar por la pared interna

que presenta el desarrollo bacteriano,

luego agite suavemente.

C.) PRODUCCION DE SULFURO DE HIDROGENO Por una técnica de puntura y estria, sembrar el m.o en el medio de TSA. Luego coloque una tira de papel de filtro impregnada con acetao de plomo, finalmente incube a 37ºC por 24 horas.

E.) SIM

Sembrar el m.o Shigella en el medio de cultivo SIM, incubar a 37ºC por 48-72horas

3. PRUEBAS BIOQUIMICAS DIFERENCIALES A.) UTILIZACION DEL CITRATO

Sembrar por la técnica de estria con la sepa de Shigella. Incubar a 37ºC por 24 horas.

B.) HIDRÓLISIS DE LA UREA Por la técnica de estría sembrar en el medio de urea el m.o Shigella Incubar a 37ºC por 24 horas.

C.) PRUEBA DE LA CATALASA Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento de uno de los tubo con el cultivo de Shigella y transferir el inoculo a un portaobjeto limpio. Añadir 2 gotas de H2O2 3% Observar si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el reactivo.

RESULTADOS: A) CARBOHIDRATOS 1.- CALDO LACTOSADO

La prueba resulto positiva porque se observo el desprendimiento de gases, es decir burbujas (CO2) en el tubo de Dunhan.

2.- TSI

El tubo de ensayo que contenía TSI cambio de coloración (rojo-amarillo), siendo esto un resultado positivo y significando que la bacteria Shigella fermentò 3 azucares (glucosa, lactosa y sacarosa).No hubo producción de gas.

4.- PRODUCCION DE ACIDOS Y ACETIL METIL CARBINOL 

ROJO DE METILO

El rojo de metilo es un indicador de pH, que

se

utiliza

para

visualizar

la

producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable, esto indica que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta, pero en este caso con

la

bacteria

Shigella

NEGATIVO.  VOGES PROSKAWER

nos

dio

El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. El desarrollo de un color rojo-fucsia luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína y por lo tanto una prueba VP positiva, pero en este caso con Shigella nos dio un resultado NEGATIVO.

PROTEINAS 1.- CALDO PEPTONADO

Se realizo para determinar la presencia de INDOL que es uno de los productos de degradación metabólica del triptófano, y da positivo para las bacterias que poseen triptofanasa porque estas son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol, acido piruvico y amoniaco. Esta prueba está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del pdimetilaminobenzaldehido, en este caso para Shigella nos dio un resultado NEGATIVO porque no existe la formación del anillo rojo.

2.- SIM

Nos dio un resultado negativo, el cual indica que Shigella no presenta movilidad ya que solo creció en el área de la puntura.

3.- PRODUCCION DE SULFURO DE HIDROGENO TSA

Los bacilos productores de este gas hacen que el medio tome un color enengrecido casí siempre en la profundidad. Como producto final metabólico se obtiene sulfuro del hidrógeno (H2S). El hidrógeno producido durante la fermentación es realmente quién conduce la respiración durante la reducción del sulfato. Eventualmente, los electrones pasan de la enzima hidrogenasa a la APS reductasa, que junto con la sulfito reductasa termina la reducción del sulfato a sulfuro del hidrógeno, pero en este caso obtuvimos un resultado NEGATIVO.

4.- GELATINA

Se usa para valorar la licuefacción o licuación de la gelatina por acción de las gelatinasas bacterianas producidas por algunas Enterobacterias. La reacción positiva hace que el medio permanezca líquido después de la incubación aún después de dejarse en refrigeración durante media hora. La reacción negativa permite nuevamente la solidificación.

 USO DEL CITRATO

Mide la capacidad de un organismo para utilizar el citrao como única fuente de carbono, las bacterias al usar citrato extraen nitrógeno de la sal de amonio con producción de amoniaco (alcalinización del medio) que hace que vire el indicador de verde a azul, en este caso nos dio un resultado POSITIVO porque la muestra final viro a color azul.

 REACCION DE CITOCROMO OXIDASA

Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e-. Este se detecta utilizando el tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a púrpura, en este caso nos dio un resultado NEGATIVO, lo cual indica que la bacteria no presenta la citrocromo oxidasa.

 PRUEBA DE CATALASA

Esta prueba detecta la presencia de citocromooxidasas. La producción inmediata y abúndante de burbujas indica la conversión del H2O2 en agua y oxigeno gaseoso, pero en este caso nos dio un resultado POSITIVO.

4.- HIDRÓLISIS DE LA UREA

Se utiliza para la valoración de la producción de ureasa por algunas enterobacterias. Este medio contiene glucosa, peptona, urea y rojo de fenol. Las bacterias que producen ureasa a partir de la urea dan lugar al carbonato de amonio y el indicador se vuelve rojo púrpura, en este caso se observo una ligera formación rojiza en la base del tubo.

CONCLUSIONES Todos los organismos tienen una temperatura optima de crecimiento, crecimiento pero algunos tienen la capacidad para resistir cambios moderados de temperatura. Estos realizan pequeñas alteraciones en su metabolismo para poder tolerar el cambio y así poder sobrevivir. sobrevivir Ej. E. coli en la síntesis de ácidos grasos saturados e insaturados

BIBLIOGRAFIA http://www.unac.edu.pe/documentos/organizacion/vri/cdcitra/Informes_Finales_Investigacio n/Octubre_2011/IF_DECHECO%20EGUSQUIZA_FIPA/CAPITULO%20N%BA%201.pd http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practicoIII.pdf https://cv2.sim.ucm.es/moodle/file.php/21298/Practicas/PracMicro07-08.pdf http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practicoIII.pdf

Fuentes de informacion  Madigan, M. T.; Martinko, J. M.; Parker, J.: Brook Biología de los Microorganismos. 10 ed, Madrid Prentice Hall Iberia., 1999.  Prescott L/ Harley J ,/ Klein D 576/P 85 2000 Madrid