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• Jorge Ddc

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Objetivos

 Manipula e identifica los microorganismos en función a su comportamiento bioquímico

Marco teórico El término metabolismo se refiere al conjunto dereacciones químicas que tiene lugar en la célula, y tiene tres funciones específicas: 1. obtener energía química del entorno, almacenarla, para utilizar luego en diferentes funciones celulares. 2. convertir los nutrientes exógenos en unidadesprecursoras de los componentes macromoleculares de la célula bacteriana. 3. formar y degradar moléculas necesarias para funcionescelulares específicas, como por ejemplo, movilidad ycaptación de nutrientes. El metabolismo tiene lugar a través de secuencias dereacciones catalizadas enzimáticamente, y se divide enanabolismo y catabolismo. El proceso por el cual lacélula bacteriana sintetiza sus propios componentes se conoce como anabolismo, y como resulta en laproducción de nuevo material celular, también se denomina biosíntesis. La biosíntesis es un proceso que requiere energía, por lotanto las bacterias deben ser capaces de obtenerla de suentorno para crecer y, eventualmente, multiplicarse. Elconjunto de reacciones degradativas de los nutrientes para obtener energía o para convertirlos en unidadesprecursoras de la biosíntesis, se conoce como catabolismo. La diversidad metabólica que presentan las bacterias permite ayudar con su identificación a nivel de género y especie, gracias a que los sustratos que utilizan, ya que son específicos de ciertas enzimas genéticamente determinadas. De esta manera surgen los medios de cultivo bacteriano selectivos en el laboratorio como lo son: Medios generales: Permiten el crecimiento de la mayoría de las bacterias presentes en la muestra. (Agar sangre, agar chocolate, agar nutritivo, caldo tioglicolato, caldo cerebro corazón)... Medios selectivos: Permiten el crecimiento de sólo determinado tipo de bacteria presente en la muestra, impidiendo el desarrollo de otras debido a que contienen sustancias (antibióticos, colorantes,

sales,…) que inhiben el desarrollo de ciertas bacterias. (Agar manitol salado (alta concentración de NaCl), Agar Thayer-Martin (presencia de antibióticos), agar EMB (contiene eosina y azul de metileno que inhiben a las bacterias gram positivas)… Medios diferenciales: Poseen sustancias que permiten diferenciar entre grupos bacterianos según determinadas características biológicas (hemólisis, fermentación de azúcares, precipitación de sales,…) y permiten realizar una identificación presuntiva inicial de las bacterias presentes en la muestra. (agar sangre (hemólisis), agar EMB (fermentación de lactosa),…).

PARTE EXPERIMENTAL

Materiales         

Placas con agar nutritivo con 1% de almidón Tubos con: gelatina, caldo peptonado, caldo MR – VP (Rojo de Metilo – Voges Proskauer), caldo lactosado con indicador de Andrade. Tubos con medio de: Citrato de Simmons en plano inclinado, Urea, TSI en plano inclinado y . . con TSA. Cultivos de: E. coli, B. subtilis,Ps. aeruginosa, Enterobacter, Proteus vulgaris, Staphylococcus. aureus, Streptococcus viridans. Lugol. Reactivos de: kovac´s, rojo de metilo, Voges – Praoskauer: alfa-naftol al 5%, en alcohol amílico, KOH – creatina al 40% Tiras de papel de filtro impregnadas con solución saturada de acetato de plomo. Peróxido de hidrógeno al 3%. Campanas de Durham y pipetas Pasteur.

Procedimiento 1. Acción sobre los hidratos de carbono Fermentación de hidratos de carbono: Primer día

- Inocula cada tubo de caldo lactosado con E.coli, S.aureus, P.vulgaris. - Toma un cuarto tubo sin sembrar como control. - Rotula los tubos e incuba todos los tubos a 37ºC por 24 horas. Segundo día

- Después del período de incubación, compara cada uno de los tubos inoculados, con el tubo control. - Cuando la bacteria ha degradado el hidrato de carbono (lactosa), se detecta por la inclusión del indicador de Andrade. - Si el microorganismo tiene la capacidad de desdoblar un subproducto metabólico a CO2 e H+ se observará la presencia de gas, en forma de burbujas.



Producción de ácidos y acetil-metil-carbinol (acetoína):

Prueba de Voges Proskauer (VP) Primer día Rotula los tubos con el nombre del microorganismo. Por la técnica de inoculación, siembra cada cepa (E. coli y Enterobacter) en su tubo correspondiente. Incuba a 37ºC por 24 horas. Segundo día A cada tubo agrega 10 a 12 gotas de la solución de alfa-naftol y 4 gotas de la solución de KOH – creatina. Agita después de agregar las soluciones por 1 minuto. Deja en reposo durante 15 minutos. La reacción es positiva, si aparece una coloración rosada localizada en la mitad superior o en todo el tubo dentro de los primeros 15 minutos, lo que nos indica la presencia de acetil-metil-carbinol. Si la lectura se realiza después de 1 hora, los cultivos pueden presentar una coloración cobriza, siendo esta una respuesta falsa positiva. La reacción es negativa, si el color inicial del medio de cultivo no cambia.  Prueba de rojo de metilo: Primer día - Rotula los tubos con el nombre del microorganismo. - Por la técnica de inoculación, siembra cada cepa (E. coli y Enterobacter) en su tubo correspondiente. - Incuba a 37ºC por 48 a 72 horas. Segundo día

-

Agrega 4 ó 5 gotas del indicador rojo de metilo a cada tubo, cuyo rango de viraje esta entre pH 4.4 (rojo) y 6.0 (amarillo). La prueba es negativa si da una coloración amarillo – naranja. La prueba es positiva si se mantiene un color rojo estable.

Principios bioquímicos de las reacciones en TSI: Primer día

-

Con el asa de siembra, inocula una porción pequeña de la colonia en el centro del tubo y estría la superficie del pico de flauta. - Rotula e incuba a 37ºC por 24 horas. Segundo día

-

-

Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubación indicada. Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo. Fermentación de la glucosa únicamente (rojo/amarillo): esto se debe a que la glucosa (que se encuentra en baja concentración con respecto a los otros azucares) ha sido utilizada y la cantidad de ácido producido no es suficiente para neutralizar los productos alcalinos generados por la utilización de las peptonas. Estos procesos que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que en el fondo, por no estar en contacto con el oxígeno, solo hay fermentación y el medio permanece ácido. Fermentación doble o triple de carbohidratos (amarillo/amarillo): la fermentación de la glucosa y alguno (o ambos) de los otros dos azúcares produce gran cantidad de ácido, por lo que el tubo permanece amarillo. No fermentación de carbohidratos (rojo/anaranjado): se presenta únicamente utilización oxidativa de peptonas, por lo que solo la superficie del tubo se alcaliniza. Producción de gas: formación de burbujas, grietas o desplazamiento del medio.

2. Acción sobre las proteínas

Producción de indol: Primer día - Rotula sus tubos con el nombre del microorganismo: E. coli y B. subtilis. - Inocula cada cepa en su tubo correspondiente. - Incuba a 37ºC por 24 horas Segundo día - Agrega 4 gotas del reactivo de Kovac´s, dejando resbalar por la pared interna de cada tubo que presenta desarrollo bacteriano, luego agite suavemente. - La reacción es positiva, si se forma un anillo de color rojo fucsia brillante en la zona superior del tubo, pocos segundos después de haber agregado el reactivo. - Las bacterias que a pesar de desarrollar en el medio no producen indol, permanecerán sin cambio alguno (reacción negativa). Producción de sulfuro de hidrógeno: Primer día

- Por la técnica de puntura y estría, siembra separadamente en el medio TSA las cepas de E. coli y P. vulgaris.

- Coloca una tira de papel de filtro impregnada con acetato de plomo. - Incuba a 37ºC por 24 horas Segundo día

- Observa el ennegrecimiento del papel de filtro, por la producción del sulfuro de hidrógeno (reacción positiva).

3. Pruebas bioquímicas diferenciales Utilización del citrato: Primer día

- Siembra por la técnica de estría en cada tubo con las cepas de E.coli y Enterobacter aerogenes.

- Incuba a 37ºC por 24 horas Segundo día

- La prueba es positiva si observa crecimiento bacteriano y un color azul intenso del agar en -

24 a 48 horas. Es negativa si no hay crecimiento ni cambio de color.

Hidrólisis de la úrea: Primer día - Por la técnica de estría, siembra los tubos con medio de urea con E.coli y P.vulgaris. No inocular el fondo. - Rotula e incuba a 37ºC por 24 horas. Segundo día

- La prueba es positiva si el medio presenta un color rosado en la superficie o en todo el tubo. - La prueba es negativa, si el medio permanece del color original.

Prueba de la catalasa: - Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento de uno de los tubos con el cultivo de Staphylococcus aureus o Streptococcus viridans, y transferir el inóculo a un portaobjetos limpio. - Añade de 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%. - Observa si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el reactivo. - Descarta la lámina en un recipiente con desinfectante. Reacción de la citocromo oxidasa:

- Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento de uno de los tubos con el cultivo de E.coli o Ps. aeruginosa, y transferir el inóculo a una tira del reactivo de oxidasa. Considera la prueba positiva cuando los cultivos dan una coloración azul violáceo intensa en la tira, en un máximo de 5 segundos.

Resultados

METABOLISMO BACTERIANO

Familia Enterobacteria ceae

3. Pseudomona aeuruginosa 6. Shigella sp

Kliger

H2 S

Fon do K

Inclina do K

-

+

CITRA SIM TO DE SIMON S IND OL + -

A

K

-

+

-

V: variable dudosa K: alcalino

GA S (O2 )

-

AGAR BLANDO MOTILID AD +

CALD O UREA UREA SA v

V

v

A: ácido

Discusión de resultados  La prueba de Kliger dio como resultado (k, k) ya que el medio se tornó más rojizo (alcalino), lo que indica que nuestra bacteria es no puede realizar fermentación anaeróbica de la glucosa o la lactosa, porque si así fuera se visualizaría amarilla al adquirir un carácter acido.  Para la prueba citrato de Simons nuestra bacteria dio positivo ya que el medio cambio su color inicial a uno azul rey, por ende la bacteria número tres posee la enzima citrato permeasa que le permite desdoblar el citrato y alcalinizar el medio.

 En la prueba de hidrolisis de la urea dio V ya que el medio parecía conservar su color inicial, sin embargo puede que la bacteria si posea la enzima ureasa y como su sustrato se encontraba presente en el medio en muy bajas concentraciones el cambio de color no sea perceptible.  Prueba con peróxido al agregar (H2O2) a la bacteria se generó un burbujeo (O2) moderado lo que indica que esta posee la enzima peroxidasa  En la prueba de amilasa al agregar lugol al cultivo el borde que rodeaba la bacteria se tornó oscuro por ende esta no posee esta enzima. Esta misma se le realizo a las bacterias de la boca dando como resultado positivo lo que indica que estas presentan la enzima amilasa  En la prueba de SIM 1. En donde se comprobaba si la bacteria podía generar ácido sulfhídrico a partir de aminoácidos azufrados resulto negativa ya que no se observó un precipitado negro por que no se produjo sulfato ferroso, 2. prueba de INDOL al adicionar el reactivo de Kovacs no se produjo el anillo rojo violeta por consiguiente se puede deducir que la bacteria no posee la triptofanasa para degradar el triptófano. 3. En la prueba de motilidad nuestra bacteria dio positivo ya que se pudo observar un patrón de crecimiento segregado a partir de la siembra.

 La prueba de Kliger dio como resultado (A, k) ya que el medio se tornó un poco más rojizo (alcalino k) y en el extremo inferior solo un tanto amarilloso (ácido A), lo que indica que nuestra bacteria es Gram negativa debido a la fermentación anaeróbica de la glucosa, pues dicho tono se puede observar gracias a la formación de productos terminales ácidos estables y por lo tanto pH ácido.  Para la prueba citrato de Simons la bacteria seis dio negativo ya que el medio no cambio su color inicial, por ende la bacteria no es capaz de utilizar el citrato como fuente de carbono.  En la prueba de hidrolisis de la urea dio V ya que el medio parecía conservar su color inicial, sin embargo puede que la bacteria si posea la enzima ureasa y como su sustrato se encontraba presente en el medio en muy bajas concentraciones el cambio de color no sea perceptible.  Prueba con peróxido al agregar (H2O2) a la bacteria se generó un burbujeo (O 2) moderado lo que indica que esta posee la enzima peroxidasa

 En la prueba de amilasa al agregar lugol al cultivo el borde que rodeaba la bacteria se tornó oscuro por ende esta no degrada el almidón. En la prueba de SIM 1. En donde se comprobaba si la bacteria podía generar ácido sulfhídrico a partir de aminoácidos azufrados resulto negativa ya que no se observó un precipitado negro por que no se produjo sulfato ferroso. 2. prueba de INDOL al adicionar el reactivo de Kovacs no se produjo el anillo rojo violeta por consiguiente se puede deducir que la bacteria no posee la triptofanasa para degradar el triptófano. 3. En la prueba de motilidad nuestra bacteria dio V ya que no se hizo bien la siembra debido al mal pulso del estudiante.

 Prueba de fermentación de carbohidratos Se sembró E. coli y Staphylococcus aureus, dando como resultado un cambio de color de naranja a amarillo brillante en el tubo que contenía la muestra de S. aureus y un amarillo opaco para E. coli, ya que no obtuvimos producción de gases en ninguna de las dos y no podemos contrastar con un control, deducimos que para E. coli la muestra resulta positiva pues se produjo un precipitado blanco. A estas dos bacterias también se les realizo la prueba del peróxido, obteniendo una mayor producción de O2 en S. aureus. Conclusión  A partir de estos resultados se pudo llegar a la conclusión que la bacteria problema número seis es Shigella sp.  A partir de estos resultados se pudo llegar a la conclusión que la bacteria problema número tres es Pseudomona aeuruginosa.  El hecho de saber un poco a cerca de la diversidad metabólica presente en bacterias ha permitido durante muchos años su cultivo, aislamiento y explotación en diferentes áreas de la industria y la medicina, sin embargo es largo el camino por recorrer la meta a alcanzar es lograr cultivar en el laboratorio muchísimas veces más ese pequeño 1% que hasta el momento sea logrado. Referencias Bibliograficas  Prescott L / Harley J, / Klein D. Microbiología 576/P 85, 2000  Mac faddin, Jean F. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. Madrid. 574.19285/412. 2003