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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO Facultad de Ingeniería Química

Laboratorio de Microbiología

Integrantes:  Carbajal López, Luis Enrique  Guerrero Fernández Cesar Humberto  Rojas Agapito, Luis Gianpierre

 Santos Hidalgo Miguel Alexander Docente: Herrera Sánchez, Sonia Grupo Horario: 90G

FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

INDICE I.

INTRODUCCION........................................................................................................3

II.

OBJETIVOS ...................................................................................................................4

III. MARCO TEORICO ..........................................................................................................5

IV. MATERIALES Y EQUIPOS ...............................................................................................7

V.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL ............................................................................... 10

VI. CALCULOS Y RESULTADOS........................................................................................... 13

VII. DISCUCION ................................................................................................................. 15

VIII. RECOMENDACIONES .................................................................................................. 19

IX. ANEXOS ..................................................................................................................... 20

X.

BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................ 23

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I.

INTRODUCCION

Los hongos filamentosos o mohos, son organismos ubicuos, resistentes y la mayoría de ellos no son muy exigentes en cuanto a sus necesidades nutritivas. Estos organismos, debido a sus características fisiológicas se desarrollan fácilmente sobre diversos productos alimenticios, provocando una disminución en la calidad de los mismos y un elevado riesgo sanitario debido a la capacidad que tienen ciertos géneros para producir determinados metabolitos secundarios tóxicos, conocidos como micotoxinas.

Los géneros Aspergillus spp., Penicillium spp., Fusarium spp. y Alternaria spp. se consideran como los géneros toxigénicos más importantes a nivel mundial, productores de aflatoxinas, fumonisinas, alternariol, altenueno, ocratoxinas, tricotecenos y zearalenona, substancias que son capaces de desencadenar diversos cuadros patológicos en el hombre y los animales, que van desde el desarrollo de actividades carcinogénicas, teratogénicas y mutagénicas, hasta la producción de desórdenes de tipo hormonal o inmunosupresor, dependiendo de la micotoxina considerada. Estos géneros son contaminantes habituales de los cereales, entre estos la cebada, utilizada principalmente en la elaboración de cerveza y como forraje

Una de las tantas ramas que tiene la microbiología es la micología que es quien se ocupa del estudio de los hongos. En promedio, se han descrito unas 80 000 especies de ellos, pero poseen importancia médica menos de 400, y menos de 50 especies ocasionan más de 90% de las micosis de humanos y otros animales. Por el lado contrario, muchas especies de hongos son beneficiosas para el género humano. Están en la naturaleza y son esenciales para la degradación y el reciclado de materia orgánica. Algunos realmente mejoran la calidad de vida de los humanos al contribuir a la producción de alimentos y bebidas, como quesos, pan y cerveza. Otros hongos han aportado metabolitos bioactivos secundarios y útiles en la medicina como los antibióticos (penicilina), y los inmunodepresores (como las ciclosporinas).

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II. 

OBJETIVOS

Realizar adecuadamente mediante el método de cuenta en placa, el número de mohos y levaduras viables presentes en productos alimenticios destinados al consumo humano.



Evaluar la calidad microbiológica de un alimento, que sea factible de estar contaminado con estos microorganismos.

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III.

MARCO TEORICO

Los hongos se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son útiles en la elaboración de algunos alimentos, sin embargo, también pueden ser causantes de la descomposición de otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de antibióticos, o la exposición del alimento a la irradiación. Por lo tanto, pueden ser un problema potencial en alimentos lácteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos, cereales y sus derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas, cajetas, especias, etc.

Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas, carbohidratos como polisacáridos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos. También pueden causar problemas a través de: (a) síntesis de metabolitos tóxicos (micotoxinas), (b) resistencia al calor, congelamiento, antibióticos o irradiación y (c) habilidad para alterar sustratos no favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas. Pueden también causar malos olores y sabores y la decoloración de las superficies de alimentos.

El término moho se suele aplicar para designar a ciertos hongos filamentosos multicelulares cuyo crecimiento en la superficie de los alimentos se suele reconocer fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado. Generalmente todo alimento enmohecido se considera no apto para el consumo. La identificación y clasificación de los mohos se basa en observaciones macroscópicas y microscópicas

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 Propiedades fisiológicas En comparación con la mayoría de las levaduras y de las bacterias, la mayoría de los mohos necesitan menor cantidad de humedad disponible. Un porcentaje total de humedad por debajo del 14 al 15 por ciento en la harina o en algunos frutos secos impedirá o retardará mucho el crecimiento de los mohos. Los mohos podrían considerarse mesófilos, es decir, que son capaces de crecer bien a temperaturas normales. La temperatura óptima de la mayoría se encuentra alrededor de los 25 a 30°C, aunque algunos son psicrótrofos y algunos son termófilos. Son aerobios, esto es cierto por lo menos en los mohos que crecen en la superficie de los alimentos. Casi todos los mohos son capaces de crecer dentro de un amplio intervalo de pH (pH comprendido entre 2 y 8.5), aunque la mayoría crece mejor a pH ácido. Son capaces de utilizar muchos tipos de alimentos, que van desde sencillos a complejos. Poseen enzimas hidrolíticas, y de aquí que algunos se utilicen para la producción industrial de las amilasas, pectinasas, proteasas y lipasas.  Usos Si bien tanto las levaduras como los mohos se asocian con aspectos negativos como la putrefacción y la infección, también pueden cumplir funciones positivas. Los mohos son útiles en la descomposición de materia orgánica en la tierra; son un elemento esencial en cualquier pila 6

FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA de compost. Las levaduras tienen la capacidad de fermentar y producir etanol, lo que las hace un ingrediente clave en la producción de bebidas alcohólicas, como así también de productos panificados.

IV.

MATERIALES Y EQUIPOS

4.1) Materiales 

Tubos con cultivos bacterianos crecidos: Escherichia coli, Salmonella



Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Salmonella

Staphylococcus aureus



Placas Petri

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

Desinfectantes

4.2) Equipos 

Mechero bunsen



Asa de siembra

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

Estufa



Autoclave

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V.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

5.1) PREPARACION DE MEDIOS Preparacion de un medio solido en placa. 1. Pesar la cantidad de medio (si el preparado contiene agar debemos añadirlo concentración de 15 g/L.) e hidratarlo con agua destilada en una botella. 2. Autoclavar la botella sin cerrar totalmente el tapon de rosca. 3. Sacar de la autoclave, enroscar del todo el tapon e introducir la botella en un baño a 40ºC al menos durante 30 minutos. 4. Distribuir el medio en placas del mechero, flameando bien la boca de la botella para evitar las contaminaciones. 5. Dejar que el medio solidifique. 5.2) REALIZACION DE LA SIEMBRA 1. Marcar el material con nombre y grupo. 2. Realizar la siembra, como sigue. A) Siembra en medio liquido: Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un inoculo que se lleva al tubo estéril con medio liquido (agitándola en el seno del medio), tomando las precauciones mencionadas anteriormente. B) Siembra en placa: Divida la placa en tres partes, sembrar en cada tercio el inoculo tomado de los cultivos crecidos. Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma una gota de inoculo que se extiende sobre el agar de la placa deslizando el asa suavemente por su superficie en zig-zag. C) Siembra en agar inclinado:

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FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un inoculo que se extiende sobre el agar inclinado deslizando el asa suavemente por su superficie en zig-zag. En el caso del medio TSI, la siembra se deberá realizar tanto en superficie (aerobiosis) como en la profundidad del agar (anaerobiosis).

D) Siembra en el laboratorio 1. Por diseminación: sobre la superficie del medio ya gelificado y secado, contenido en la placa, de volúmenes de 0.1 – 0.2 mL de las disoluciones correspondientes 2. En profundidad: incorporando el inoculo en un volumen de medio fundido, manteniendo a temperaturas compatibles con la viabilidad microbiana (aproximadamente 45°C), que luego se vuelca en una placa Petri y se deja gelificar. Los volúmenes inoculados pueden ser de hasta el 10% del volumen del medio. Luego de la incubación en las condiciones apropiadas para cada microorganismo, la concentración de UFCs presentes en una suspensión se calcula multiplicando el número de colonias por placa, promedio de varias placas, por la inversa de la dilución de la suspensión, y dividiendo por el volumen sembrado. Cuando el número de microrganismos viables presentes en una muestra es bajo, se puede recurrir a la filtración de la misma a través de filtros de membrana que retienen bacterias. Luego de filtrar la suspensión o sobre una fina almohadilla de papel absorbente embebido con medio líquido, se incuba en condiciones adecuadas y se cuentan las colonias, que representan el número de UFC presentes en el volumen de muestra filtrado. 5.3) MORFOLOGIA COLONIAL

a) Morfología colonial de bacterias: El desarrollo de colonias sobre superficies de agar permite al microbiólogo identificar las bacterias porque las especies forman a menudo colonias con una forma y aspecto característicos. El tamaño, forma, textura y color de una colonia es propio de cada microorganismo. Por la forma:  Puntiforme 11

FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA  Circular y ovalada  Filamentosa  Irregular  Rizoide  Fusiforme Por la elevación:  Plana  Elevada  Convexa  Pulvinada  Umbonada  Montañosa  Crateriforme Por el margen:  Entero  Ondulado  Lobulado  Erosionado  Filamentoso  Rizado

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VI.

CALCULOS Y RESULTADOS

1. describir sus movimientos. Cuando se mira en el microscopio. Los mohos cuando se miran en el microscopio no cuentas con movimiento, ya que están ahí con una morfología filamentosa la cual está constituida por un micelio recibiendo en nombre de hifas, estando estas separadas en secciones generalmente multinucleadas por medio de septos perforados o bien carecer de estos. La pared celular del micelio de los mohos semeja un extenso sistema tabular por el que avanza el citoplasma para su dispersión y búsqueda de nutrientes. 2. Explicar la forma de mohos cuando se observa visualmente. Los mohos se observan visualmente cuando crecen en tiendas de antigüedades, invernaderos, saunas, granjas, molinos, áreas de construcción, floristas, casas de verano o también cuando crecen las superficies de alguna fruta produciendo podredumbre en estas. Se trata de una podredumbre blanda, acuosa y en general de color marrón claro. Si bien los tonos de marrones pueden variar de una fruta a otra el elemento principal que distingue a esta enfermedad es la consistencia acuosa de la podredumbre. En general comienza a desarrollarse a partir de una herida. Sobre esta herida aparece el hongo, primero de color blanco y luego se recubre de la esporulación azul característica que le da el nombre a la enfermedad. Podredumbre blanda de la fruta ocasionada por Penicillium expansum. Corte del fruto mostrando el avance de la podredumbre azul. A partir de heridas en la fruta (principal vía de ingreso del patógeno) se desarrolla la podredumbre. Sobre la herida se observa la esporulación azul característica de Penicillium expansum. Ciclo de la enfermedad: Los Penicillium son considerados parásitos de heridas. En la mayoría de las veces ingresan a la fruta a través de las heridas recientes ocasionadas en forma mecánica como ser pinchazos provocados por los cabitos, raspados o golpes, daños de insectos, daños por la manipulación por parte de los cosechadores o cualquier otro origen. Algunas veces la infección puede ocurrir por las lenticelas del fruto, especialmente si existieron alternancias de excesos y carencias de agua previo a la 13

FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA cosecha, o cuando la fruta se ha debilitado por la maduración y envejecimiento. Las esporas de Penicillium sobreviven de estación a estación en los bins o cajones contaminados. El hongo en estos cajones contaminados puede producir una gran cantidad de esporas. También pueden llegar las esporas a la cámara frigorífica provenientes del campo cuando los bins vienen sucios de tierra, de frutas podridas o por el aire. Los baños de poscosecha pueden ser una fuente de contaminación. Una sola fruta en mal estado puede tener esporas suficientes para contaminar toda la línea de empaque.

a. La muestra se coloca en el contador de colonias para poder hacer el

conteo de mohos formados. Número de unidades formadoras de colonias (UFC) en la placa: 11 Dilución de la muestra: 10-2 Volumen sembrado: 1ml Límite máximo permisible: 10-2 Recuento: 11 x 102 UFC/ml La muestra de papilla para bebes no se encuentra dentro de los límites permisibles de la RM 591-2008 MINSA por ende no es apta para el consumo humano.

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FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA b. También se aprovechó situación y se contó las levaduras que

estaban presentes en la muestra resultando: Número de unidades formadoras de colonias (UFC) en la placa: 40 Dilución de la muestra: 10-2 Volumen sembrado: 1ml Límite máximo permisible: 10-2 Recuento: 40 x 102 UFC/ml Concluyéndose que la papilla no es apta para el consumo ya que se encuentra dentro de los límites permisibles de la RM 591-2008 MINS

VII.

DISCUSION

a. Elabore su discusión tomando en consideración los objetivos de la práctica, los resultados obtenidos y la bibliografía consultada. Los objetivos de la práctica es la observación de los microorganismos vivos para poder estudiar su morfología y color en caso si lo tuviera, además de la observación de las diferentes clases de movimiento microbiano. Mohos Morfología

Color

La morfología de los Mohos

El color que se observo fue beige

observados en el microscopio

claro

fue filamentosa.

La muestra de papilla de bebe que se sometió a estudio contenía 11*102 unidades formadoras de colonia de mohos; esta excedía de los límites máximos permisibles según la RM N°591-2008-MINSA que estable lo siguiente:

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Según los datos obtenidos a partir de la muestra podemos concluir que dicho alimento para bebes no es apto para su consumo. La papilla de la marca Heinz es un alimento que si cumple con las condiciones para su consumo; se deduce que al momento de realizar el análisis de esta se cometió algunos erros, por consiguiente, se analizara en un diagrama de Ishikawa los posibles erros que se cometió al analizar la muestra.

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Muestreo

Homogeneidad: una fase

Conservación y transporte: T°ambiente contenida en su recipiente

Temperatura: Ambiente

Humedad: 87%

Ambiente

Plan de muestreo: Lote sin microorganismos

Contaminación: A. Mesas de trabajo no desinfectadas B. Ambiente sobrecargado de estudiantes.

Homogeneidad: 1 fase

Diluciones: 10^-2

Equipo y materiales

Competencia técnica: A. Usar apropiadamente teorías, procedimientos y herramientas en el desarrollo de las practicas de laboratorio. B. manejar equipos y materiales de laboratorio adecuadamente.

Conservación: Medios de cultivo a una T° igual a 60°C

Preparación: Se compro ya preparada

Medios de cultivo y reactivo

Esterilización: Se uso mechero de bunsen

Calibración: Exacta

Esterilización: Se uso mechero de bunsen

DIAGRAMA DE ISHIKAWA

Muestra

Preparación: 1ml

Calificación: Competente

Personal

RESULTADO

Finalmente realizando nuestro diagrama podemos notar que los



resultados obtenidos el experimento no concuerdan con los límites

máximos permisibles de la RM-591-2008-MINSA debido a que el

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FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA ambiente de laboratorio no fue el adecuado ya que no hubo una desinfección de las mesas de trabajo, además el ambiente estuvo sobrecargado de estudiantes, lo cual generó molestia y malestar al momento de realizar la experiencia de la identificación de los mohos.

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VIII. 

RECOMENDACIONES

Desinfectar el ambiente de trabajo con lejía a una concentración entre 50 a 200 ppm.



Lavar con detergente y agua destilada los instrumentos de laboratorio a usar y esterilizar los mismos con el mechero de bunsen



Mantener la muestra en un lugar donde no se encuentre expuesto a las bacterias y/o hongos del ambiente.

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IX.

ANEXOS

1. Dibuja las estructuras de reproducción del moho

2. Anotar el nombre del moho identificado:

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3. Anotar la composición y utilidad de los medios de cultivo: Saboraud, agar de papa y dextrosa y agar de rosa de bengala 

Agar de Saboraud: 

Composición: El medio de cultivo presenta: peptona, tripteina y glucosa que son nutrientes para el desarrollo de microorganismos. Alto contenido de glucosa, presencia de cloranfenicol y mantiene un pH acido.



Utilidad: Este medio de cultivo es útil para el aislamiento y desarrollo de hongos y levaduras; debido a que contiene cloranfenicol, glucosa y pH acido inhibe el desarrollo de bacterias, específicamente para hongos asociados con infecciones cutáneas (patógenos y saprofitos).



Agar de papa y dextrosa: 

Composición: Infusión de papa (a partir de 200g) 4 g Dextrosa 20 g Agar 15 g * pH final en 5.6 ± 0.2 a 25ºC



Utilidad: Medio de cultivo adecuado para el aislamiento y recuento de hongos y levaduras en alimentos, productos farmacéuticos, lacteos y cosméticos. Fomenta la esporulación del moho y la producción de pigmentos en algunos dermatofitos



Agar rosa de bengala: 

Composición: Compuesto enzimático de harina de soja 5 g Dextrosa 10 g Fosfato monopotásico 1 g Sulfato de magnesio 0.5 g Rosa Bengala 0.05 g Cloranfenicol 0,1 g Agar, Bacteriológico 15.5 g.

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Utilidad: Se recomienda en los métodos estándar para la enumeración de levaduras y mohos a partir de alimentos y agua

REFERENCIA  Britania – Agar de Saboraud - Consultado el 19 de abril a las 23:58 https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a297121 6486e.pdf

 NEOGEN – Agar de rosa de bengala con cloranfenicol – Consultado el 20 de abril a las 22:58 https://foodsafety.neogen.com/sp/rose-bengal-chloramphenicol-agar

 Acumedia – Agar de papa dextrosa – Consultado el 20 de abril a las 23:00 https://foodsafety.neogen.com/pdf/acumedia_pi/7149_sp_pi.pdf

4. Porque es necesario realizar la técnica de micro cultivo para identificar moho La técnica de microcultivo resulta ser idónea para la identificación de estructuras fúngicas, pues te permite observar a través del microscopio el micelio en su conjunto no solo una parte del mismo. Ya que en otros procedimientos para tratar hongos filamentosos el micelio llega a quebrarse mientras que con esta técnica no hay necesidad de preocuparse de ese factor. El hongo (moho) crece sobre un cubreobjeto que luego se coloca sobre un portaobjetos al que añadimos un transparentador. Las hifas intactas facilitan su correcta identificación.

REFERENCIA  Microcultivo de hongos – Yeison cadena – Consultado el 20 de abril a las 23:25 https://prezi.com/kw6mvms_15ct/microcultivos-de-hongos/

 Microcultivo – Monografias – Consultado el 20 de abril a las 23:10 22

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X.



BIBLIOGRAFIA

Micro Ambiental cuaderno practicas.doc. Preparación de medios de cultivo.

Consultado

el

20

de

abril

del

2019.

Disponible

en:

https://www.ugr.es/~cjl/medios%20de%20cultivo.pdf..



Laboratorios MICROKIT. Rosa Bengala Cloranfenicol Agar. Madrid, España. 2005. Pdf. Consultado el 20 de abril del 2019. Disponible en: https://www.microkit.es/distribuidores-microkit/pdf/microkit39_es.pdf.



MARCOS GARCÍA, Marta; RIVAS GONZÁLES, Raúl. Hongos y levaduras creciendo en medio de cultivo Rosa de Bengala. Universidad de Salamanca, España. 2015. Consultado el 20 de abril del 2019.

Disponible

en:

http://bibbiologia.usal.es/imagenes/picture.php?/1705.



MDM CIENTÍFICA S.A.S. Agar PAPA Dextrosa. Medellín, Antioquía, Colombia. Pdf. Consultado el 20 de abril del 2019. Disponible en: https://mdmcientifica.com/wp-content/uploads/2018/09/O-P.PD-17INSERTO-Agar-PAPA-Dextrosa-Actualizado.pdf.



UNAM. PRÁCTICA 2.3 Esterilización y Preparación de Medios de Cultivo. Pdf. Consultado el 20 de abril del 2019. Disponible en: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Protocolo2_3_19088.pdf.

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