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• Santiago Perez

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II CORTE-MARZO 5 2018-CLASE 1 Vamos a empezar una serie de clases(3) en las que trabajaremos alrededor de los LT de la RI adaptativa, que son los LTCD4 y los LTCD8. Hoy haremos un reconocimiento del fenotipo de los linfocitos, entonces vamos a estar pensando en esto molecularmente, es decir las moléculas que los LT tienen expresadas y que las asociaremos con distintas funciones relacionadas con los LT esto sería a nivel celular, molecular, extracelular. Posteriormente hablaremos sobre la activación de los LT y aquí nos referiríamos a eventos citoplasmáticos. Lo que sabemos de los LT es que son de origen linfoide, durante el proceso de hematopoyesis a partir del progenitor linfoide común, se origina un progenitor de LT, que migra de la medula ósea hacia el timo, cuando ingresa al timo esta célula da origen a timocitos que maduran en el timo, lo que implica EXPRESAR RECEPTOR ESPECIFICO y otras moléculas, cuando logran hacer una expresión satisfactoria de esta molécula receptora, es decir, que funcione y esta funcionalidad se mide cuando se puede unir al MHC, y el segundo concepto adecuado es que además sea AUTOTOLERANTE, que significa NO ser específico para antígenos propios. Cuando los timocitos logran expresar el receptor funcional y demostrar autotolerancia salen del timo y al salir del timo se dirigen a los órganos linfoides secundarios (nodos linfáticos, bazo, las mucosas) recordando un principio: ellos NO SON ESTATICOS, tienen un proceso que se llama recirculación, o sea que cada LT CD4 o CD8 y LB, todo el tiempo está migrando de un nodo a otro nodo linfático y este viaje lo debe hacer para poder reconocer, porque hasta los nodos linfáticos van las APC. Los LT expresan sobre su membrana miles de moléculas diferentes, entre las cuales están los TCR, un LT tienen miles de TCR y lo que los condiciona es que son específicos para un mismo epitope del mismo antígeno, o sea que solamente un LT se puede activar frente a una molécula, además tiene receptores para citoquinas, quemoquinas, insulina, glucagón, prolactina incluso, tiene moléculas de adhesión y otras más; estas moléculas que los LT tienen las puede ir cambiando y esto aplica en: 1. Cantidad 2. Tipo de moléculas Cuando hablamos de linfocitos (incluidos los LB), podemos hablar de fenotipos de linfocitos, o sea 3 formas en las que un linfocito puede estar: 1. LT VIRGEN: Cuando sale del timo, este fenotipo implica que nunca se ha encontrado o ha reconocido el antígeno para el cual es especifico. 2. LT ACTIVADO: cuando el LT virgen se activa y este LT activado, puede ser activado: EFECTOR, que es el que cumple la acción efectora. ➢ si es LTCD4, su acción efectora es secretar citoquinas, los TCD4 efectores se llaman T ayudadores. ➢ Si es LTCD8, su acción efectora es la citolisis, los TCD8 efectores se llaman CTL( citotóxicos). Hay linfocitos T activados cuando hay un estímulo. 3. LT DE MEMORIA.

Se originan después de que un LT virgen se activó y se diferenció. Estos 3 fenotipos así cambien van a mantener la misma ESPECIFICIDAD. De acuerdo al fenotipo, las moléculas que tiene sobre su membrana pueden cambiar, en número y en tipo y de hecho hay moléculas que marcan que un linfocito es virgen, activado o de memoria. Vamos a agrupar estas moléculas en 3 grupos de acuerdo al tipo de función: 1. MOLECULAS RECEPTORAS, ya sabemos que el receptor de los LT es el TCR y aquí ya concluimos que un LT tiene miles de TCR´s distintos pero todos mantienen la misma especificidad, este se expresa durante su paso en el timo. 2. MOLECULAS ACCESORIAS, dentro de este gran grupo están: moléculas de señalización, que pueden generar señales al interior de ese linfocito y hay 2 tipos. A. moléculas de señalización para ACTIVAR, para activar señales de activación. B. moléculas de señalización para INHIBIR, para activar señales de inhibición. Un linfocito T al mismo tiempo puede recibir estas dos señales, porque al mismo tiempo tiene moléculas activadoras e inhibidoras, pero es de acuerdo a su ESTADO que prima más una señal que otra. Si el linfocito T tiene sólo moléculas activadoras, todo el tiempo está activándose y puede inducir la autoinmunidad, o si por el contrario tienen solo moléculas inhibidoras, esto puede inducir a la inmunodeficiencia y esto es lo que s e ve en la clínica. 3. MOLÉCULAS DE ADHESIÓN, están implicadas en adhesiones intercelulares, que es la unión física entre una célula con otra célula, estas moléculas de adhesión las vamos a relacionar en 4 eventos: 1. Durante la recirculación, esta comienza desde que es progenitor. 2. En la interacción con la célula APC. 3. En la migración hacia el lugar de infección, esto hace parte de la recirculación. 4. En la interacción con la matriz extracelular, esto significa de los LT efectores no solo son dirigidos hacia un lugar de lesión, sino que además son mantenidos en el lugar de lesión para que cumplan aquí la acción efectora; entonces aquí ya no es adhesión intercelular, porque la matriz extracelular no es célula, sino filamentos de actina, fibrinógeno, es todo el espacio que hay entre célula y célula que forma un tejido. TCR(molécula receptora) El TCR como molécula receptora es un heterodimero, que significa que esta compuesto por dos proteínas distintas: 1. Cadena alfa 2. Cadena beta Es por esto que pueden llamarse también linfocitos alfa-beta. Cada cadena está formada por DOMINIOS, que es una parte de una proteína. -LA CADENA ALFA tiene un dominio más externo que se conoce como: dominio variable de la cadena alfa(1). Debajo de este dominio vienen dominios constantes (3 o 4): transmembranales, citoplasmáticos.

La CADENA BETA tiene la misma estructura que la cadena alfa, 1 dominio variable y 3 o 4 dominios constantes. Los dominios constantes se llaman así porque son iguales en todas las clonas de linfocitos T. Los dominios variables se llaman así porque son diferentes por cada clona de LT, estos dominios variables de las cadenas alfa y beta son los que determinan la ESPECIFICIDAD de cada LT. PARCIAL Muchos linfocitos T con igual especificidad, forman: UNA CLONA Muchos linfocitos T con especificidades distintas: _______________ El TCR de los LT, no se expresa solo, sino acompañado de otras moléculas: ● ●

moléculas CD3. cadena Z.

El conjunto de TCR+CD3+cadena Z se conoce como el COMPLEJO TCR. Si una persona tiene una deficiencia genética en CD3 o cadena Z, el TCR nunca se expresa y si esto no sucede, no habría maduración y se tendría una inmunodeficiencia. El TCR es la molécula de unión al MHC y también reconoce el epitope que está siendo presentado por el MHC. Si es un TCR en linfocitos TCD8 se une a MCH-I y si es un TCR en linfocitos TCD4 se une a MCH-II. Si el epitope que se le está presentando es un antígeno propio, no debe haber activación y el LT que se une fácilmente se disocia; pero si el péptido que está reconociendo en ese MCH es específico para ese TCR se genera un ensamblaje fuerte y entonces el LT se ve promovido a estabilizarse y en este momento entran a funcionar CD3 y cadena Z. CD3 y cadena Z tienen una cola citoplasmática larga y en esa cola se encuentran unas regiones ricas en secuencias de tirosina-tirosina-tirosina…ITAM( motivos de interacción basados en tirosina), estos dominios ricos en tirosinas son fácilmente fosforilados, y fosforilar es agregar un grupo fosfato y las moléculas que hacen esto se reconocen como quinasas, entonces cuando un LT se une a un epitope para el cual es especifico, se comienzan a dar señales intracelulares, que empiezan a fosforilar a los dominios ITAM y esta es la base de la iniciación de las cascadas de señalización para la activación de los LT. Las moléculas CD3 se consideran marcadores fenotípicos de LT, esto significa que es una molécula de diferenciación poblacional, inmunológicamente entonces la molécula que marca a los LT es el CD3, por esto inmunológicamente y clínicamente si me dicen células CD3+, me están diciendo LT. ➢ CD3+CD8+, serán solo los LTCD8. ➢ CD3+CD4+, serán solo los LTCD4. En el momento de la unión entre el LT y la célula APC, se establecen otras interacciones moleculares que están dadas por moléculas de señalización y de adhesión. Las MOLÉCULAS ACCESORIAS son iguales en funcionamiento tanto para los TCD4, como para los TCD8 y en el momento de reconocimiento y activación la única variación se ve en el MCH que va a reconocer cada linfocito.

Estas moléculas accesorias siempre van a encontrar un ligando presente en la matriz extracelular, lo que implica que las moléculas siempre se van a unir a otras moléculas, estas moléculas pueden estar en la matriz extracelular, en células endoteliales, en células APC o en la célula blanco. Célula blanco: se refiere a la célula infectada o tumoral, sobre la cual un LTD8 va a ejercer su acción citolitica. Estas moléculas NO SON POLIMORFICAS, que significa que el número de alelos para los genes de esta molécula no tiene una variación mayor al 1%, esto desde la genética; desde lo molecular que son iguales en toda la población y por esta razón tienen una utilidad y es que se usan para diferenciar poblaciones celulares, que tipo de diferencias me permiten: 1. saber si es un TCD4 o TCD8 2. saber si es un CD8 virgen o citotóxico o de memoria y lo mismo para LT(fenotipos celulares). CORRECEPTORES Son las moléculas CD4(monómero) y CD8(heterodimero). ➢ si un LT es CD4+, es CD8➢ si un LT es CD8+, es CD4Desde el timo se empiezan a expresar estas dos moléculas, o sea que del timo ya salen DIFERENCIADOS. Estas moléculas se conocen como correceptores porque también se une al MCH como el receptor TCR, pero NO a la hendidura del MHC(el TCR si se une a esta) o sea que los correceptores no tienen nada que ver con el reconocimiento al epitope, pero si con la unión al MHC. Entonces el correceptor empieza a aumentar la fuerza de unión, si es el específico. La unión del correceptor al MHC, estabiliza y se induce la activación de una enzima llamada LCK(quinasa citoplasmática de linfocito) que fosforila a los dominios ITAM de CD3 y cadena Z y se va a iniciar la activación. MOLECULAS COESTIMULADORAS E INHIBIDORAS Luego de señal 1 de activación que es la interacción de moléculas como TCR, CD3, cadena Z y correceptores, si el LT no recibe otra señal de activación el se va a volver ANERGICO, o sea intenta activarse pero estas señales no son tan fuertes para que suceda y queda como un linfocito T sin energía. Entonces, tras la señal 1 de activación, tiene que haber una señal 2 de activación que es dada por las moléculas coestimuladoras. La molécula coestimuladora del LT es la molécula CD28, OJO en número no es una, son muchas…se requieren entre al menos 100 interacciones TCR-MHC para que un LT se pueda activar y lo mismo va a pasar con estas moléculas coestimuladoras. Los LT expresan la molecula CD28 que se va a unir a un ligando llamado: moléculas B7, tanto a CD28 como a B7 se le llaman coestimuladores. Existen 2 tipos de B7:

1. B7-1 o CD80 2. B7-2 o CD86 Cuando el CD28 se une con B7, a partir del CD28 se inician señales coestimuladoras(3 tipos), ojo recordar que lo que hace esto es generar cascadas de activación de moléculas intracelulares, no es unidireccional, una misma molécula activada puede generar una cascada de transducción diferente, la señalización a través de CD28 al LT le induce: 1. Supervivencia, porque induce inhibición de moléculas proapoptoticas, activando moléculas antiapoptoticas. 2. Proliferacion, que es entrar en mitosis o expansión clonal. 3. Diferenciación de células de memoria, ya sea CTL memoria o T ayudador de memoria. Las moléculas B7 las tienen las APC, la mejor es la célula dendrítica. El LT también tiene otras moléculas coestimuladoras, llamadas ICOS, estas últimas estan asociadas sobre todo a LTCD4 más que a TCD8; la molécula ICOS se une a ICOS LIGANDO y están implicadas en un evento llamado la reacción del centro germinal. El CD40L(L de ligando) es otra molécula coestimuladora que se une a CD40. MOLECULAS DE INHIBICIÓN CTLA4: se une a B7-1 o B7-2 y si se une a estos B7 lo que se va a generar es una señal mediada por fosfatasas que lo que hacen es defosforilar (quitar fosfatos), bloqueando la activación. Un LT virgen tendrá ambas moléculas CD28 y CTLA4 coexpresadas, la activación o inhibición dependerá entonces del número de moléculas B7 que traiga la APC. EXPLICACIÓN: Bajo un concepto de NO infección una célula dendrítica puede llegar a un nodo linfático y presentar un antígeno PROPIO, entonces como célula dendrítica tiene B7, el LT reconoce el Ag propio y lo que se da aquí es una interacción muy transitoria pero durante esta se puede establecer un contacto entre CD28 con B7 o CTLA4 con B7, pero lo que pasa es que CTLA4 TIENE MAS AFINIDAD POR B7, entonces si llega la CD con pocos B7 el que se gana la señal es el CTLA4, entonces la señal para este linfocito será de NO ACTIVACION. Ahora lo que pasa cuando una célula dendrítica reconoce en el lugar de infección PAMP´S DAMP’S o algo, aumenta la expresión de B7, entonces cuando llegue al nodo linfático tanto CTLA4 como CD28 serán estimulados, y en este momento gana la señal de CD28. Por lo anterior quien esta determinando de alguna manera la activación o no es la APC, si esta tiene pocos MHC con epitopes específicos y tiene pocos coestimuladores, prima señal de INHIBICION. Pero cuando una celula dentritica se ACTIVA, tiene muchos MHC’s mas o menos 7 millones y también tendrá muchas moléculas de B7 mas o menos el doble de la cantidad de MHCs que tiene. Si una persona presenta una mutación donde no se exprese el CD28, no habrá activación y por tanto estaríamos frente a una inmunodeficiencia. Si por el contrario tiene CD28 y no CTLA4 será una enfermedad autoinmune.

CTLA4 no es la única molécula de inhibición, los LT también expresan otras moléculas que se llaman PD1 que se unen a PD1L (ligando); están también las BTLA que se unen a HVEM y estas son otras moléculas de inhibición. Hay otras moléculas de señalización activadoras y se conocen como CD2 que se unen a unos ligandos llamados CD58, CD2 es otro marcador de linfocitos T, la señal a través de CD2 se conoce como una señal de activación y lo que se ha visto es que esta señal recibida favorece la transcripción de genes para CITOQUINAS y los LT dependen de la síntesis de citoquinas para muchos eventos, ejemplo: la importancia de la IL-2 es que induce la expansión clonal, los LT activados producen y secretan IL-2 que de forma autocrina induce expansión clonal, producen otras citoquinas que están relacionadas en otros eventos como TNF alfa (proinflamatorio), o IL10(inmunomodulador). Otra molécula de señalización se llama SLAM que tiene una interacción homodimérica, o sea que se une a otro SLAM y lo que se ve es que a través de SLAM se inducen señales para la activación. CD45R es una molécula muy importante, no tiene ligando conocido, pero tiene una función determinante y es la acción de fosfatasa que ya sabemos que desfosforila, pero aun así juega un papel importante en la activación y esto es porque la LCK fosforilada está en su forma inhibida, lo que se necesita para que se active es defosforilarla y esto lo hace el CD45R. Existen varios tipos de moléculas CD45: *RO-esta isoforma indica que el LT es de memoria. *RA- esta isoforma indica que el LT es virgen. *RB- no dice MOLÉCULAS DE ADHESIÓN Están implicadas en el rodamiento. CD44- es una molécula que tiene como ligando el ácido hialuronico que da firmeza a los tejidos y a medida que vamos envejeciendo se va perdiendo este hialuronato e inmunológicamente nos vamos debilitando, porque si se acaba el ácido hialuronico se disminuye la capacidad de migración de linfocitos. El ácido hialuronico se puede expresar en: células endoteliales, epitelios y matriz extracelular. Gracias a CD44 los LT pueden ser dirigidos hacia los sitios de infección, permite que se mantengan en estos lugares y está asociada a la reacción inflamatoria. Selectinas y ligandos de selectinas- los linfocitos expresan ligandos para selectinas y se llaman los ligandos de selectina E y los ligandos de selectina P, a través de estos ligandos los linfocitos se pueden adherir débilmente a los endotelios activados y generar lo que se conoce como rodamiento, marginación. Cuando los linfocitos son activados ellos expresan integrinas, que se van a unir a los ligandos de integrinas que se expresan en endotelios activados y esa interacción se asocia con la extravasación del linfocito y esto a su vez está relacionado con direccionarlos hacia los sitios de infección. Los LT (vírgenes y de memoria) expresan una selectina muy interesante llamada selectina-L, esta expresión induce una migración siempre hacia nodos linfáticos.

TAREA: buscar la molécula S1PR1 CLASE # 2. MADURACIÓN DE LINFOCITOS T. 14 MARZO Se habló sobre las moléculas expresadas por los linfocitos T, las clasificamos en grupos, como receptoras, de señalización, de adhesión y posteriormente vimos como se activa un Linfocito T, que después de hacer el reconocimiento del Ag para el cual es específico, se generan unas cascadas intracelulares, que inducen la transcripción de múltiples genes y éstos están relacionados con las diferentes funciones o eventos que se deben dar asociados al proceso de la activación. Se va a hablar de la maduración, tenemos un hueso con médula ósea, allí hay unas células no muy abundantes que son las pluripotenciales autoregenerativas y, que por proceso de división dan origen a progenitores mieloides y linfoides. El progenitor linfoide tiene un estadio muy inmaduro→ Progenitor linfoide común, de éste se puede formar: -Precursor de LB(del que salen LB). B1 o B2 (Los de la zona marginal o los foliculares). -Precursor de LT(Del que salen LT). LTCD4 o LTCD8. El precursor de LT se formó en la médula ósea y luego se dirige al timo, allí va a dar origen a unas células inmaduras que se conocen como los timocitos. Durante el proceso de maduración se van a dar unas fases marcadas por procesos de división celular y característicamente los diferentes estadios de maduración son los mismos para B y para T. Lo que diferencia las fases de maduración en el timo es la expresión secuencial de las moléculas del LT. Mientras va pasando por el timo, cada timocito se ve inducido a expresar receptores, moléculas de señalización, de adhesión y el cambio en la expresión de esas moléculas es el que va determinando qué tan maduro es. Durante el evento de la maduración hay unas fases proliferativas que permiten generar abundantes timocitos. Estos eventos de proliferación son importantes porque de cada 100 timocitos que empiezan a madurar durante todo el proceso, muchos de ellos van muriendo y únicamente terminan de madurar entre 3 y 5, o sea que mueren entre 95-97. Los que sobreviven son los que sufren eventos proliferativos, y aunque terminen poquitos se van a formar muchos. Existen unos puntos de control de la maduración. Tanto la maduración de LT y LB cumplen dos objetivos: 1. Generar células funcionales (que expresen un receptor capaz de unirse a una molécula de MHC). Para un LT que su TCR se una a una molécula de MHC, significa que puede reconocer un Ag. 2. Que el linfocito sea autotolerante, es decir, que su receptor no tenga alta afinidad por Ags propios. Cuando pasan por el timo, esos linfocitos son probados en esos dos puntos de control. Si un timocito no demuestra ser funcional, su TCR no se une al MHC, se elimina. Si un linfocito tiene un TCR específico para Ags propios debe ser eliminado. Si los puntos de control no se dieran, nos llenaríamos de células que no sirven, o peor aún, de células que pueden inducir enfermedades autoinmunes.

Dentro del timo hay otra función muy importante y es diferenciar los LTCD4 o LTCD8. Cuando un timocito cumple con todos esos procesos, termina egresando del timo como una célula TCD4 VIRGEN o TCD8 VIRGEN. Virgen significa madura, que ya es una célula funcional, autotolerante. Lo que determina que el progenitor linfoide común se vaya hacia una línea celular u otra es la activación de unas moléculas, en este caso la NOTCH 1 (el progenitor linfoide común la tiene). Si dicha molécula se une a su ligando WNT (esta molécula la tienen las células estromales de médula ósea) el progenitor linfoide común se polariza a precursor de células T y pierde su capacidad de dar origen a células B. Dicha estimulación activa un factor de transcripción(proteína que induce la síntesis para transcripción de unos genes en particular) que se llama el GATA-3. GATA 3 es el que va a convertir a la célula en precursor de LT. Hay una enfermedad asociada a la deficiencia o mutación de la molécula NOTCH 1→ Estas personas van a carecer de LT, es el origen de algunas inmunodeficiencias. Cuando ya se forma el precursor de LT, debe pasar de la médula ósea al timo. El precursor ingresa al timo por la zona corticomedular, se dirige hacia la corteza que es la parte más externa, allí el precursor sufre el primer evento proliferativo, es proliferativo y no expansión clonal, porque en esta última se generan células con igual especificidad. Allí las células no tienen ninguna especificidad porque NO tienen TcR. La proliferación se da por la IL-7, que sale de las células estromales del timo. El precursor debe tener entonces el receptor para la IL-7 y cuando se da la unión, de una célula se originan miles de células nuevas, llamadas TIMOCITOS. Si una persona no produce IL-7 o tiene una alteración en los receptores de IL-7→ No hay formación de LT. El SCID también conocido como síndrome del "niño burbuja" se debe a un trastorno autosómico recesivo que origina una disfunción intensa en las células T y B, y puede acabar con la muerte de los pacientes antes de los dos años de edad por infección masiva. El pronóstico de vida es muy bajo, 4-5 años. Uno de los niños alcanzó los 15 años y murió por un trasplante de médula ósea, existe algo llamado injerto contra huésped y es cuando el órgano que se trasplanta mata al huésped. Los timocitos se van a ir desplazando de la corteza hacia la médula, entre más cercanos estén a la médula, más maduros van a estar. La migración intratímica depende de quimiocinas y receptor de quimiocinas. La IL-7 es muy importante en la maduración de LT porque: 1. Promueve la activación de moléculas antiapoptóticas, una familia de moléculas que se conoce con el nombre de Bcl-2. La activación de la IL-7 bloquea la acción de vías proapoptóticas, lo que significa que le da supervivencia. 2. La acción de la IL-7 lleva a la activación de ciclinas, que son moléculas para sacar de la MIN 33:50____ celular y permitir la mitosis. 3. Promueven la expresión del CD25, que juega un papel importante en la activación. En general el papel de la IL-7 es promover la supervivencia en el timocito. Ya vimos que el precursor ingresa, es estimulado por IL-7, que hace que se den eventos proliferativos, que se generen muchos timocitos, cada timocito va a ser promovido a expresar un TcR. Los eventos que se han determinado es que diferentes timocitos expresan receptores TcR

con especificidades distintas. De una sola célula se originan células con especificidades distintas, o sea que cada célula expresó un receptor TcR con dominios variables diferentes. De un precursor pueden salir muchas células con TcR con la misma especificidad, pero al mismo tiempo van a salir células T con especificidades diferentes. No es que salgan 100 con 100 especificidades distintas, sino 100 y de esas 5 con las misma especificidad, otras 20 con la misma especificidad, etc. De ahí se empiezan a formar los clones, porque diferentes células con igual especificidad me forman un clon de linfocitos. ¿Por qué de una célula que no tenía ningún receptor, se forman muchas células T con especificidades distintas? Esto se da por eventos aleatorios. Yo puedo madurar y formar LT específicos para Ags que NUNCA me voy a exponer, ej ébola. Así como también puedo formar LT específicos para Ags propios, que son los causantes de enf. autoinmunes. Las células T específicas para las cuales yo quiero generar una especificidad NO se puede controlar, es decir yo me puedo exponer a un Ag y no tener la célula específica que lo reconozca, PORQUE NO LA MADURÉ. Allí es donde se forma el repertorio de LT: Suma de LT con especificidades distintas en un individuo. Se adquiere durante la maduración. La especificidad de cada LT está dada por su TcR y particularmente por la formación de los dominios variables de cada cadena y entre diferentes clonas los dominios variables van a ser distintos. Los dominios variables se forman así: Los genes para formar el TcR están ubicados en el cromosoma 7 y 14. En el 7 están los genes que forman la cadena beta y en el 14 los que forman la cadena alfa. Es muy fácil entender que consecuencias trae una alteración en estos cromosomas, bien sea deleción, inserción, lo que sea. La estructura de la cadena beta tiene un dominio variable y uno constante. Para formar el variable la célula necesita transcribir 3 genes, que son los genes V, D y J. Y para la cadena alfa, que tiene una estructura similar a la beta, se necesitan transcribir 2 genes: V y J. No son los mismos genes los que codifican para la cadena alfa y para la beta. Cada individuo tiene diferentes números de genes V, diferentes números de genes J, diferentes números de genes D para la cadena beta. Una persona para formar la cadena beta tiene 57 opciones V, 2 opciones D y 13 genes J, con esto puedo producir muchas combinaciones, así sea que solo cambie una opción del gen J, ya que ha generado variabilidad. Cada linfocito toma uno de la V, uno de la D y uno de la J y con seleccionar uno de cada uno forma un dominio variable. En el caso de alfa hay 50 y 70 (número de genes respectivamente) para V y J; entonces para formar el dominio variable de la cadena alfa también hay recombinaciones. Recordar que recombinación es la capacidad o probabilidad de seleccionar genes de forma aleatoria, entonces la formación de cada dominio variable se da por unos eventos de recombinación. A partir de una sola célula se producen muchas con especificidades distintas porque cada célula puede hacer una recombinación diferente y al hacer esto adquiere una especificidad diferente. Hay muchas que recombinan igual y al hacerlo van a formar una clona. (Si entiendo esto, con los LB es lo mismo, hasta el mismo nombre de los genes).

En conclusión, por procesos de recombinación es que cada linfocito puede adquirir una especificidad distinta a otro linfocito. Las recombinaciones se dan por la activación de unos genes muy importantes: RAG 1 Y RAG 2. A partir de estos genes se codifican unas enzimas que se llaman recombinasas. Además de lo anterior, se puede aumentar más la diversidad. Cada timocito tenía la opción de recombinar entre las distintas opciones de genes específicas, ya que eso es lo que está en la información del DNA, pero después de que se ha recombinado se puede modificar por la acción enzimática. Es decir, hay unas enzimas que modifican la recombinación que hizo el linfocito T y esas enzimas se llaman: Artemis y TDT (deoxidonucleotidil tranferasa terminal). Su importancia es modificar la selección o recombinación que los timocitos pueden hacer y al modificarla generan mayor diversidad. Por ende, la presencia de Artemis y TDT aumenta el repertorio diverso que cada persona puede formar (ojo, esto es en el timo ya que estamos formando el). La acción de estas enzimas se hace sobre el RNA. Hay personas que carecen de estas enzimas, la consecuencia es su diversidad es alta pero no tan alta como los que las tienen. Por otro lado, hay otro factor que aumenta la diversidad. ¿Por qué el sistema juega tanto a la diversidad? Porque entre más diverso a más antígenos distintos genero protección. La diversidad se aumenta modificando unas regiones dentro de los dominios variables que se llaman las regiones CDR (región determinante de complementariedad). Lo que hacen es que para modificar todo un dominio variable, con que se modifique una partecita ya se ve distinto, o sea entre clonas distintas dentro del dominio variable hay regiones que comparten, pero hay otras muy chiquitas que son diferentes. Esto quiere decir que para cambiar el dominio variable no hay que cambiar toda la secuencia, sino que se pueden cambiar unas pequeñas partes y eso genera mayor diversidad. OJO, conclusión: Una misma clona tendrá la misma secuencia. Una clona distinta tendrá una secuencia diferente, pero para cambiar el dominio variable no hay que cambiarlo todo sino unos pedacitos que se llaman CDR Resúmen: Factores que generan diversidad en orden. 1. Probabilidad de recombinar. 2. Enzimas TDT y Artemis. 3. Presencia de CDR. Todos estos factores ayudan a generar un repertorio diverso. Deficiencia o alteración en cualquiera de estos factores tendrá una consecuencia en cuanto al repertorio del individuo. Todos estos factores de diversidad van orientados a la generación de dominios variables distintos entre clonas de linfocitos. DIFERENTES ESTADIOS DE MADURACIÓN DE LINFOCITOS T. Tenemos la STEM CELL: Célula que está en la médula ósea. De esta célula se genera el PRECURSOR que ingresa al timo y este por acción de IL-7 sufre un evento de proliferación y surgen los timocitos. 1. Primer estadio del timocito: Pro-T. No tiene ninguna cadena de TCR. Aquí es donde se activa la recombinación y la primer recombinación es para formar la cadena beta. Los timocitos que logren expresar la cadena beta quedan en el siguiente estadio.

2. Estadio Pre-T: Aquí ya tienen cadena beta. Además, del estadio Pro-T al Pre-T se activa la enzima TDT. Las células que alcancen el estadio Pre-T solo tienen cadena beta y no tienen alfa, pero aquí ocurren unos eventos importantes: - Se induce la transcripción de esta cadena alfa. - Se induce la expresión de los correceptores CD4 y CD8. - Hay un evento de proliferación (vuelve y funciona la IL-7). Como resultado, la célula que en el estadio Pre-T logró cumplir con todo eso, pasa al estadio: inmaduro doble positivo. 3. Estadio Inmaduro doble positivo: Se caracterizan porque tienen un TCR completo y además tienen las moléculas CD4 Y CD8. Se llama doble positivo porque son tanto cd4 como CD8 positivos (CD4+ CD8+), es decir que todavía no se ha definido para ser un ayudador o un citotóxico. Quienes logran pasar a este estadio van a sufrir un evento que se conoce como selección positiva. Entonces los timocitos que hayan logrado entrar al estadio doble positivo van a entrar en los puntos de control: PRIMER PUNTO DE CONTROL: Evaluar si este TCR se une a un MHC. Consiste en permitirle la unión a moléculas del MHC (clase I y clase II) y estas moléculas las tienen las células del timo. Cada timocito tiene dos opciones: Unirse a un MHC de clase I o de clase II. Situación 1: El timocito se expone a moléculas de MHC clase I. Si el TCR es complementario para esa molécula, el timocito deja de expresar la molécula CD4, lo que significa que va a ser CD8+. Situación 2: Si el timocito se expone y se une a una molécula de MHC clase II, se va a diferenciar el CD4+ y va a dejar de expresar CD8 hasta desaparecer. Situación 3: Si si se ensayo con clase I y II y no se unió con ninguno de los dos, se elimina porque no pasó el primer punto de control y esto significa que no demostró funcionalidad. Se llama selección positiva porque del estadio doble positivo, quien logre expresar un TCR que se una a un MHC clase l o clase ll, pasa al siguiente (se selecciona positivamente). Y el siguiente estadio se llama: inmaduro simple positivo, es decir, o es CD4 o CD8. SEGUNDO PUNTO DE CONTROL: Mirar y determinar la afinidad que tienen por antígenos propios. Ojo, la selección positiva se dio en la corteza y participaron en este evento células epiteliales de la corteza del timo; el que fue seleccionado positivamente ahora pasa al siguiente estadio (inmaduro simple positivo) que se da en la médula del timo y en este evento participan células epiteliales de la médula tímica. Un Ag propio es una molécula que produzco yo (ej: insulina, la Hb, glucagón, IgE, IgA, TSH, etc). Estos timocitos tienen que ser expuestos a Ag propios en el timo, pero frente a Ag que no son del timo. Por ejemplo, debe ser expuesto a insulina, un Ag que no es propio del timo. Para que en el timo haya Ag propios se necesita que en el timo se transcriban Ag propios. Teniendo en cuenta esto, para probar la afinidad frente Ag que no se producen en el timo, lo que se hace es utilizar el gen AIRE (regulador de autoinmunidad). Este gen está activo en las células epiteliales tímicas, este produce un factor de transcripción que induce la síntesis de Ag propios extra-tímicos en el timo y que particularmente son Ag del sistema endocrino.

OJO: Quiere decir que en el timo sí se produce insulina, pero no producen insulina para regular la concentración de glucosa en sangre, solo se produce insulina como Ag para probar la afinidad. Otra cosa, en el timo no sólo se transcriben Ag endocrinos, hay Ag de muchos orígenes, pero a partir del gen AIRE sólo son Ag endocrinos. Se resalta este gen porque algunas enfermedades autoinmunes son direccionadas contra el sistema endocrino y se describió que la carencia del gen AIRE predispone a esas enfermedades. Ej: Diabetes, enf. Autoinmunes de tiroides (hipo e hipertiroidismo), etc. Tener en cuenta que NO todos los Ag propios están en el timo, hay Ag que no se sintetizan ni alcanzan a llegar al timo. Conclusión: Gracias a la acción del gen AIRE se pueden codificar Ag propios para permitir probar la afinidad de los timocitos con lo propio. Si un timocito demuestra tener una alta afinidad por los Ag propios, ese timocito tiene que ser regulado o eliminado. Eliminado es inducirle apoptosis (destruirlo). Y las células que sufrirán apoptosis serán todas las células que tengan que tengan la misma especificidad. Ejemplo: todas las células T (timocitos) que tengan alta afinidad por insulina, deben ser eliminadas. Esto se llama delección clonal por apoptosis, clonal porque se elimina toda la clona que tenga esa misma especificidad. Todo este proceso es lo que se llama selección negativa, es decir, proceso que consiste en eliminar por apoptosis a los timocitos que demuestren alta afinidad por Ag propios. En el timo algunos timocitos expresan un receptor TCR que es afín a lo propio, pero no tan afín, o sea que es medio autoreactivo. En el caso de esas células que “pueden causar una enfermedad autoinmune pero de pronto no la hace”, entonces en el timo esa célula no se delecciona clonalmente sino que se convierte en un T-regulador. No es que se arreglen, se les dice que no van a activarse frente a lo propio sino que va a ayudar a que cese la respuesta. Estas se llaman células T reguladoras naturales porque se originaron intratimicamente, y se originaron porque fueron timocitos que mostraron cierta afinidad elevada por lo propio, pero no era tan alta como para generar delección. Entonces: - Muy alta afinidad → muerte por apoptosis - Una afinidad alta pero no tan alta → T-reguladoras. La importancia de las células T-reguladoras que van a ingresar del timo y van a ayudar en la periferia a mantener la tolerancia y a inducir homeostasis. Ahora, si un timocito logró demostrar que era funcional y que además no era autoreactivo, termina el proceso y se convierte en una célula virgen que va a pasar del timo a los órganos linfoides secundarios. Esta célula virgen sale con las siguientes características: - Específico para un Ag que no es propio - Diferenciada en TCD4+ o TCD8+. Este proceso es muy selectivo, lo que significa que la gran mayoría de células mueren porque no logran el hecho de tener un receptor funcional. Aquí es donde mueren la gran mayoría de timocitos ya sea porque no expresaron la cadena beta, porque expresan la beta pero no la alfa o porque beta y alfa no se unen al MHC; la gran mayoría muere aquí. Otro porcentaje menor mueren porque son auto reactivos y finalmente terminan de madurar entre el 3 y 5%. En este proceso todo el tiempo ayudaron células epiteliales. Con el envejecimiento del timo las células son reemplazadas por adipocitos, entonces, con el tiempo la maduración de LT se vuelve más

permisiva y el riesgo de madurar células autorreactivas aumenta, por eso la autoinmunidad en la vejez tiene mayor relación. CLASE #3. RECIRCULACIÓN DE LT. 21 MARZO 2018 Los leucocitos no son células estáticas, tienen la capacidad de estar en recirculación y aun los que son residentes pueden moverse dentro de los tejidos, en el caso de los linfocitos(T y B) se ha descrito un patrón de recirculación y la recirculación es simplemente entender cómo se mueven por el cuerpo y la forma en la que un linfocito lo hace depende de su fenotipo(3). 1. LT vírgenes: tiene especificidad pero nunca se ha activado. 2. LT activados/efectores: ya reconoció el epitope para el cual es específico y se va a dirigir a cumplir su acción efectora. 3. LT de memoria: ya cumplió la acción efectora y aprendió cómo lo debe hacer. Los LT vírgenes vienen del TIMO y ellos recirculan entre órganos linfoides secundarios, o sea van a viajar entre estos. Es imaginarse que los LT vírgenes ingresan a un nodo linfático y después de pasar un tiempo en este, si no es activado o permanece como virgen, lo que hará es salir e ingresar a otro órgano linfoide secundario si en ese tampoco se activa se va hacia otro órgano linfoide secundario y así… tiene que recircular entre órganos linfoides SECUNDARIOS para poder hacer el reconocimiento del antígeno por presentación antigénica, porque es en estos órganos donde las células dendríticas presentan el antígeno. Ahora, si en un órgano linfoide secundario el LT reconoce el antígeno para el cual es especifico, ya no va a ser virgen ahora será activado-efector y su recirculación va a ser del lugar de activación(órgano linfoide secundario) al sitio de la infección. Hay dos tipos de células de memoria y de acuerdo a su tipo se mueven distinto: 1. De memoria central: son células que regresan al nodo linfático u órgano linfoide secundario donde fueron activados y tienden a permanecer en este órgano linfoide secundario, pueden ir a otros pero tienden a aumentar su presencia en este órgano linfoide secundario con el fin de aumentar la probabilidad de ser activado en ese órgano. Recordar que una de las características de la respuesta inmune que se da en órganos linfoides secundarios en el caso de los nodos linfáticos es que se inducen RESPUESTAS INMUNES LOCALES, entonces si un LT es específico para un Ag derivado de un helminto por ejemplo. ¿Por dónde aumenta la probabilidad de ser activado? Por los nodos linfáticos que se relacionen con el intestino. La activación de los LT de memoria central induce una nueva PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN y AUMENTO EN EL NÚMERO DE CÉLULAS EFECTORAS. 2. De memoria periférica: estas células quedan circulando entre el órgano linfoide secundario que fueron activados y el sitio donde cumplieron la acción efectora. Las células de memoria tienden a estar en mayor cantidad en el lugar donde cumplieron la acción efectora, esto permite que tras una nueva re-exposición al mismo Ag su activación se dé más rápidamente. Si una célula de memoria periférica se activa ella lo puede hacer en el lugar de la lesión, pero NO PROLIFERA, lo que hacen es secretar citoquinas muy rápidamente y esto ayuda a generar una respuesta inmune más ligera.

Lo que determina que las células vírgenes, activadas o efectoras tengan ese patrón de recirculación tan especifico es un conjunto de moléculas llamadas: moléculas de adhesión y dentro de estas hay varios tipos: -selectinas y sus ligandos -integrinas y sus ligandos A esto además hay que sumarle quemoquinas y receptores de quemoquinas porque lo que hacen estas es generar gradientes químicos que atraen células a un lugar determinado, si la célula se mueve de una forma distinta entonces es bastante lógico entender que expresan diferentes selectinas e integrinas de acuerdo a su fenotipo, pero hay también otras moléculas implicadas en la recirculación que son las moléculas: S1PR1 y S1P. S1PR1: es un receptor que está expresado en linfocitos T S1P: es el ligando para el receptor S1PR1, es una molécula soluble que está en circulación, químicamente es un LIPIDO, se produce por células endoteliales principalmente, también células epiteliales y se encuentra en grandes concentraciones a nivel de vasos sanguíneos. El receptor S1PR1 puede cambiar su expresión, o sea que hay momentos donde el LT tiene una alta expresión de receptor y otros momentos donde pierde la expresión del receptor. ● ●

Si el LT tiene una ALTA expresión del receptor→ se va a mover hacia donde esté el lípido. Si el LT pierde la expresión del receptor→ya NO es sensible al lípido y se puede mover en otra dirección.

Lo que determina que tenga muchos o pocos receptores expresados es la concentración del lípido y es una relación INVERSA. ● ●

Si hay mucho lípido →el LT disminuye la expresión de receptores. Si hay poco lípido → el LT AUMENTA la expresión de receptores.

Entender esto permite comprender cómo hace un linfocito para entrar y salir de un nodo linfático. Si tengo un órgano como el timo, aquí hay poco S1P, entonces los receptores S1PR1 son ALTOS y el lípido S1P está en circulación aumentado. Los receptores S1PR1 en circulación están disminuidos porque hay MUCHO LÍPIDO. RECIRCULACION DE UNA CELULA VIRGEN: Empezó en el timo, pasa del timo a la circulación y se va a dirigir a un órgano linfoide secundario, lo que hace que una célula virgen se vaya a un órgano linfoide secundario son las selectinas que expresa el linfocito virgen, las cuales son: selectinas- L que se unen a una molécula llamada CD34 o Gly-cam o Mad-cam que están expresadas en órganos linfoides secundarios, pero además el LT virgen expresa un receptor de quemoquinas llamado CCR7 que se une a las quemoquinas CCL19 y CCL21 que se están produciendo desde los órganos linfoides secundarios. Por la expresión de la selectina L y la molécula CCR7 los linfocitos T VIRGENES son llamados “de circulación a un órgano linfoide secundario”. Cuando el LT virgen ingresa a un órgano linfoide secundario, selectina L sigue expresado y CCR7 también, pero la concentración del S1P(lípido) en el nodo linfático va a ser baja porque aquí hay una enzima que lo degrada, entonces lo que pasa con el receptor S1PR1 en el nodo linfático es que se AUMENTA, porque si hay poco lípido el receptor aumenta.

Al aumentarse los receptores S1PR1 lo que pasa con el linfocito es que se ve promovido a salir del órgano linfoide 2rio a la circulación y en la circulación el S1PR1 disminuye su expresión, PERO como mantiene selectina L y CCR7 cuando baje S1PR1 el LT va a ingresar a otro órgano linfoide secundario y en este órgano el S1PR1 se va a volver a expresar y cuando lo haga lo va a llevar a circulación y así pasara su vida como célula virgen, expresando o inhibiendo el S1PR1 y manteniendo la expresión de selectina-L y CCR7. Como entenderlo fácilmente: las células que expresen selectina-L y CCR7 siempre serán dirigidas a un órgano linfoide secundario y las células que deben estar en órganos linfoides 2rios son las células vírgenes, pero para poder entrar y salir de un órgano linfoide secundario se requiere el cambio en la expresión del S1PR1 de acuerdo a la concentración del lípido. RECIRCULACIÓN DE LT ACTIVADO: Un linfocito T ingresa a un órgano linfoide 2rio, lo que se ha visto es que los LT vírgenes pueden pasar unas horas en ese órgano; en esas horas es que se comienza a dar la re expresión del S1PR1 para que lo pueda sacar, pero también en esas horas está la oportunidad de reconocer un Ag que le presente una célula dendrítica, entonces siempre que esté en órganos linfoides 2rios va a exponerse a múltiples antígenos, pero solamente se va a activar cuando reconozca el epitope para el cual es especifico. Las zonas grandes que tiene un nodo linfático son 3, la corteza, paracorteza y médula, en la PARACORTEZA es donde están los LT y aquí es donde se activan. Los LB están en la corteza, en los folículos linfoides. Si la célula dendrítica le presenta al LT el epitope para el cual es específico, se tienen que dar todas las interacciones supramoleculares mediadas por moléculas accesorias, formación de sinapsis inmunológica para que se pueda establecer todas las cascadas de señalización intracelular que van a terminar con la transcripción de genes inmediatos y tardíos. Entonces el LT va a entrar en fase de activación y esta célula NO SE PUEDE IR del órgano linfoide 2rio hasta que señalice, prolifere y se diferencie, porque si se va NO SE ACTIVA, entonces hay que retenerlo transitoriamente, o sea que hay que inhibir al S1PR1 y este se inhibe por la expresión de una molécula que se llama CD69. Esto quiere decir que a las células T que están siendo activadas se les induce la expresión de esta molécula CD69 y esta a su vez lo que me induce es la expresión de los INF alfa y beta tipo I y estos interferones salen de la célula dendrítica, o sea que la célula dendrítica no solo le presenta sino que también secreta los interferones. El CD69 bloquea transitoriamente al LT hasta que se active, prolifere(expansión clonal) y se diferencie y esto le toma un tiempo de 10 a 15 días porque es una respuesta inmune primaria para este LT. El LT se va a diferenciar en células efectoras y de memoria. Las células efectoras deben pasar del nodo al lugar de la lesión pero para poder hacer esto, primero debe ir a circulación, entonces se le promueve a las células efectoras que vuelvan a expresar el S1PR1 para que vuelvan a sangre, pero ya no pueden expresar CCR7 y selectina L porque se irían a otro nodo linfático. Los LT para saber dónde es el lugar de la lesión tienen: 1. las quemoquinas que se están produciendo en ese sitio y que los van a atraer. 2. El endotelio activado expresa moléculas de adhesión que van a empezar a atraer leucocitos a ese lugar y las que expresa son la selectina E(endotelios) y P(plaquetas), cuando los LT llegan al endotelio activado se unen con sus ligandos

a la selectinas expresadas en el endotelio y por las quemoquinas se favorece su extravasación que se ayuda por la permeabilidad vascular. Las moléculas que mantienen a los linfocitos en el lugar de la lesión son las integrinas que ayudan al rodamiento sobre el endotelio activado y a la adherencia firme para la extravasación (las quemoquinas también); pero sobre todo CD44 que se une con el ácido hialurónico que está expresado en la matriz extracelular ayuda a que el LT permanezca en el lugar de la lesión y permanecerá aquí hasta que cese el estímulo. Luego de cumplir la acción efectora y de controlar el estímulo las células efectoras se eliminan y van a permanecer las células de memoria. RECIRCULACIÓN DE CÉLULAS DE MEMORIA: Las células de memoria vuelven a expresar selectina-L y CCR7 para poder regresar a un nodo linfático y lo hacen para volver a hacer activadas tras una nueva exposición al mismo epitope, si sucede vuelven a proliferar y lo mismo que si se hubiese activado por primera vez solo que ahora el proceso lo hará en menos tiempo, otras células de memoria no vuelven a expresar estas moléculas(selectina-L y CCR7) y lo que pasa con estas células es que se quedan en el lugar de la lesión. INMUNOTERAPIA Es la modulación del sistema inmune en ciertas enfermedades, las autoinmunes, una de ellas es la esclerosis múltiple que se trata con un medicamento que se conoce como fingolimod, este lo que hace es bloquear a S1PR1 con el objetivo de que las células efectoras no vayan a circulación atrapando LT en los nodos linfáticos, evitando que células autorreactivas no vayan a dañar la vaina de mielina de las neuronas, este medicamento será entonces un inmunosupresor y deben tomarse paralelamente otras estrategias para revertir esta inmunosupresión. El costo de las terapias inmunosupresoras, son muy costosas, hasta 26 millones mensuales. FUNCIONES DE LOS LT LTCD4: Los LTCD4 efectores producen y SECRETAN citoquinas que inducen efectos biológicos en otras células, tanto leucocitos como no leucocitos, pero que de una u otra manera estarán integradas en la respuesta inmune. Su acción efectora la producen en el lugar de la lesión, es por eso que ahí mismo serán secretadas esas citoquinas. Es decir que estos LT se activan por presentación y cumplen su acción efectora por presentación. Presentación para activación: Lo hace la células dendríticas Presentacion para acción efectora: Lo hace macrofagos y LB Resumidamente-> Los LTCD4 se activan por la presentación de Ag´s peptídicos a traves de las molécula MHC de clase II. Y esos Ag´s pueden provenir de un virus, hongos, parásitos, bacterias, vacunas, tumores, toxinas, entre otros… (Es decir que reconoce antígenos que sean peptídicos y que puedan ser presentados por moléculas de MHC, y esos Ag´s pueden provenir de microorganismo que tengan proceso de replicación intra o extracelular, pero también Ag’s sintéticos como vacunas, o Ag’s naturales moleculares como toxinas).

La respuesta inmune que se dé, no será igual a un virus, hongo o parásito, ya que las citoquinas que secretan el LTCD4 van a variar dependiendo del Ag. Las citoquinas son moléculas que MODULAN la respuesta inmune, es decir que la MEJORA Y ESPECIALIZA, para lograr eso debe inhibir. Los LTCD4 de acuerdo a la especificidad que tengan y al estímulo que reciban durante la presentación antigénica, se pueden diferenciar en las SUBPOBLACIONES DE LTCD4, y acá es donde se habla de la poblaciones Th 1, Th 2, Th 9, Th 17, Th 21, Th 35, T reguladores, Th0, y estas se van a diferenciar por las citoquinas que producen y secretan. Por lo tanto las diferencias entre las poblaciones son los estímulos que inducen, de acuerdo a la citoquina que secrete. Es importante identificar las diferentes poblaciones, conociendo que citoquinas secretan y que células estimulan. VIRUS: El mejor mecanismo efector sería citolisis, y las células que pueden hacer esto son: NK, LTCD8 (este seria para virus que estén intracelulares), y la fagocitosis (para extracelulares) las células serian: macrofagos y neutrofilos. Por tanto las citoquinas que secretan los LTCD4 frente a un virus, van a estar dirigidas a esas células que se acaban de nombrar, pero también para LB para que puedan producir Ac’s que neutralicen. EL PERFIL TH1 DE LOS LTCD4 ->como se especializa en este perfil? Porque tiene una gran especificidad por un Ag (proveniente de un microorganismo intracelular), pero además durante la presentación se ve estimulado por citoquinas como IL-12, Interferón gamma, alfa y beta o interferones tipo 1, porque recuerden que la célula dendrítica no solo presenta, sino que también coestimula y secreta citoquinas que ayudan en la diferenciación. Una vez diferenciado el LT Th1 va a secretar: ● ● ●

Interferón gamma TNF-alfa TNF- beta

La citoquina principal del perfil Th1 es el interferón gamma-> ● ●

●

potencia la fagocitosis de macrofagos, y sabemos que es muy importante en la respuesta inmune a virus. Estimula a los LB para que produzcan Ac’s IgG (se logra por la cooperación TB), los Ac’s adecuados en la respuesta contra virus , porque: ○ Son opsoninas, es decir que favorecen las fagocitosis. ○ Son Ac’s que marcan células infectadas para que las reconozcan las células citotóxicas como las NK (ADCC- activacion de celulas NK a través de Ac’s). ○ Son Ac’s neutralizantes es decir que se une al microorganismo para evitar que este infecte una célula. ○ Son los Ac’s protectores frente a las infecciones virales. Estimulan a que los TCD8 y los NK, secreten interferones tipo 1 alfa y beta-> que inducen el estado antiviral.

Todas las citoquinas que esté secreta, va a potenciar la respuesta inmune en contra del virus. Al perfil Th1, se le conoce como un perfil pro-inflamatorio, ya que éste potencia la accion inflamatoria de macrofagos. El interferón gamma no solo le potencia la fagocitosis, también la potencia la producción de las citoquina IL-1, IL-6 y INF-alfa, que inducen la inflamación. Si se

genera una respuesta Th1 de forma descontrolada, estaremos frente a una respuesta inflamatoria crónica. La enfermedad GRANULOMATOSA CRÓNICA, es una enfermedad que se asocia a infecciones crónicas, y está muy relacionada con defectos en la fagocitosis. Personas que tienen una susceptibilidad genética , que no pueden destruir microorganismos fagacitodos, tienden a fromar granulomas. Un granuloma es la concentracion de macrofagos que han fagocitado pero no destruido, se da en (lepra, tuberculosis, algunos hongos y parásitos). EXPLICACIÓN: El macrofago fagocita pero no destruye al microorganismo, por tanto queda dentro de el, pero este macrofago seguira secretando muchas citoquinas inflamatorias que van a seguir reclutando más células, llega un momento en que hay tantos macrofagos que se pegan mucho y se fusionan, volviéndose células multinucleadas gigantes, y otras se vuelven como epitelios (cell epiteliodes= macrofagos modificados), y todo esto con el objetivo de contener ese microorganismo. Al lugar del foco de infección llegan los LTCD4 Th1, que se encargaran de mantener la inflamacion mediada por los macrofagos, generando todo esto un aumento en el # de granulomas. Formar un granuloma no es malo, porque mientras yo se una persona inmunocompetente las bacterias estarán contenida ahí, el problema es si entro en un estado de inmunosupresión; lo que pasaría es que lo LT se van, los macrofagos se vuelven inestables y dejan salir el microorganismo que ira a causar los daños. PERFIL TH2-> Es importante en la respuesta inmune a parásitos extracelulares grandes como los helmintos.Un LTCD4 que tiene un TCR específico para un epitope derivado de un helminto y que durante la presentación antigénica sea estimulado por IL-4,se va a convertir en Th2. Secretara: ● ● ● ●

· · · ·

IL-4 IL-5 IL-10 IL-13

En la respuesta inmune a gusanos las células efectoras son: Granulocitos (basófilos, eosinófilos y mastocitos), y entre esos 3 los más adecuados serán los eosinófilos-> porque tiene gránulos con proteína básica mayor y proteína catiónica; como los gusanos tiene un cubierta muy gruesa estas nos permiten alterar esa cubierta. La infecciones por estos gusanos generalmente se localizan en el intestino, por lo que los cuadros clínicos asociados serán diarrea, cólicos, moco.. todo esto lo promueven estas citoquinas. El moco se produce para eliminar la adherencia de los gusanos, y este es aumentado por las IL-13 y 4, estas mismas también aumentan el peristaltismo para facilitar la expulsión. La IL-5 induce la activación de eosinófilos, pero además promueve la hematopoyesis de eosinófilos. Todo esto es respuesta inmune innata, y la adaptativa? Serían los TCD4 y los LB que su función sería producir y secretar Ac’s-> IgE ya que está activa o degranula los eosinófilos, pero la producción de esa IgE, la induce la IL-4. IgE es un marcador clínico en infecciones parasitarias, al igual que la eosinofilia. La alergia está relacionada con la liberación de mastocitos que liberan histamina, y estos también se degranulan por IgE. Entonces el perfil Th2, es el perfil que induce la reacción alérgica, que se caracteriza por un aumento también de eosinófilos y de IgE. Por tanto nosotros como médicos, si

nos llega un paciente con eosinofilia y una IgE aumentada, pues vamos a tener 2 opciones: parásitos o alergia, también puede ser un síndrome de conn o linfoma de células B. Para diferenciarlos pues se necesita saber bien el cuadro clínico que tenga el paciente. PERFIL TH17 → Es un perfil importante en la respuesta inmune a bacterias y hongos extracelulares. El mejor mecanismo es la fagocitosis ya que son extracelulares, por lo que este perfil potencia a las mejores celulas fagociticas que tenemos: Neutrofilos. Este perfil tiene mucha importancia en la respuesta inmune de la mucosas. Es un LTCD4 que tiene una especificidad para un Ag proveniente de un hongo o una bacteria extracelular y durante la presentación es estimulado por las citoquinas DGEF- beta con IL-1 o IL-6, para diferenciarse en la población Th17. Secreta: ● ● ●

· IL-17 · IL-21 · IL-22

Estas citoquinas aumentan la acción de defensa de los epitelios y en contra de las infecciones bacterianas y por hongos, hay una molécula muy importante que son las DEFENSINAS, estas se les conoce como los antibióticos naturales porque lograr destruir y limitar el crecimiento de bacterias y hongos. Entonces se induce un aumento de las defensinas debido a la IL-17 y la IL-22. Por acción de la IL-17 se promueve la fagocitosis en los neutrófilos. La IL-21 ayuda a mantener la diferenciación hacia LT Th17. Implicado en enfermedad autoinmunes como la artritis y la psoriasis, se ha encontrado que en los infiltrados de la lesiones hay una alta concentración de IL-17, que es la que potencia los neutrófilos que actúan como proinflamatorios.

CLASE # 4. RESPUESTA INMUNE ADAPTATIVA HUMORAL. 2/ABRIL/2018 INMUNOGLOBULINAS O ANTICUERPOS: Son glicoproteínas que hacen parte de los receptores de los LB. El Ac actúa también como BCR (receptor de reconocimiento), es decir, el BCR está conformado por un Ac. COMPARACIÓN RECEPTORES LB y LT: - El TCR tiene unos sitios donde la región variable es más variable → CDR. Los Ac también tienen esos CDR (del 1 al 3, siendo el CDR 3 el más variable). - En cuanto a naturaleza química, los TCR reconocen péptidos lineales presentados por las moléculas del MHC. Los BCR reconocen, además de proteínas, cualquier naturaleza química (lípidos, CHO’s, glicolípidos, ADN) y pueden reconocerlo lineal o conformacional. HISTORIA: - Los señores Von Behring y Kitasato, premios nobeles post mortem, finalizando el siglo 19 y 20, se habían descubierto las bacterias que producen toxinas (botulínica, tetánica). Ellos necesitaban

producir vacunas contra esas bacterias. Ellos querían ensayar que esas bacterias y sus toxinas podían ser atacadas por “algo” que estaba en el humor, a lo que llamaron Antitoxina, para esto produjeron un Toxoide (toxina a la que se le quitó la virulencia, pero que despierta la respuesta inmune, es decir, Antitoxinas). Ellos creían que de una persona a otra o de un animal a otro, se podía transferir esa protección con antitoxinas, a lo que se le llamó → Seroterapia. El experimento fué: -

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Cogieron una toxina salvaje y se la aplicaron a un conejo → Murió. Cogieron esa misma toxina, le aplicaron sales de aluminio y lo volvieron un toxoide. Se lo aplicaron al conejo y 1 mes después le aplicaron la toxina → Sobrevivió. Con eso comprobaron que el toxoide había inducido la producción de antitoxinas en el conejo, de tal forma que cuando aplicaron la toxina, la antitoxina neutraliza y no permitió que el conejo muriera. Al mismo conejo le sacaron sangre, sacaron el suero y se lo aplicaron a un conejo 2. Aplicaron la toxina al conejo 2 y a un conejo 3. El conejo 3 murió porque no tenía protección y el conejo 2 sobrevivió, pues se le realizó una transferencia pasiva de Ac, es decir, adquirió inmunidad de forma pasiva, lo que evitó su muerte al aplicarle la toxina.

Lo anterior es el principio de la toxina antitetánica. Cuando me la aplican me están poniendo Ac anti tétano. La vacuna es otra cosa, es un toxoide. Con el experimento anterior pudieron desarrollar tres conceptos: Cuando se aplica un toxoide, el conejo no muere pero desarrolla unas antitoxinas. Estas antitoxinas lo protegen y además se pueden transferir a otro organismo. Esto hoy en día lo conocemos como inmunidad de forma pasiva, y puede ser natural o artificial. - El señor Paul Ehrlich, realizó un dibujo muy parecido a la teoría que hoy conocemos de la activación de los LB. El decía que cuando un LB con sus receptores reconocía “animáculos”, al reconocerlos, esa célula empezaba a producir más receptores y los secretaba. Lo que nos quería decir era que, el BCR que es un Ac, ese Ac reconoce un microorganismo, y produce más de los mismos (Ac) para que reconozca más microorganismos de los mismos pero en forma soluble.

como

él

En ese entonces todo se lo tenían que inventar. Tenían solo un microscopio convencional de luz, pero ni así se podían ver los Linfocitos lo dibujó.

- Los señores premios nobeles, había algo en el (porque de microscopía la forma del Ac.

Porter y Edelman, también aún cuando ya se conocía que humor llamado Anticuerpo reconocía Antígeno), por medio electrónica pudieron determinar

El Ac es una glicoproteína conformada por dos cadenas pesadas (verde oscuro) y dos cadenas livianas (verde claro). Estas cadenas están unidas por puentes disulfuro intra e intercadena. Está zonificado, tiene varias zonas o regiones:

-

-

La zona donde están las rayas es la región variable, es decir, como los “brazos”. La región amino terminal de la proteína conforma lo que se llaman las regiones variables. Hay región variable pesada y liviana. Hay regiones constantes: liviana y pesada.

Las regiones constantes son muy parecidas entre sí entre las inmunoglobulinas; quiere decir que los aminoácidos de esta región son muy constantes, muy parecidos. La región variable es lo que hace que cada Ac, que cada BCR reconozca un Ag o epítope diferente. En la gráfica vemos que la región variable tiene unas rayitas, las cuales se llaman región hipervariable, esto quiere decir que a pesar de que toda la zona es muy variable, muy diferente en todos los Ac, hay tres zonas que son regiones hipervariables (más variables que toda la zona). De esas zonas hacen parte los CDR y en esas regiones hipervariables es el sitio donde se une el Ag o epítope. Lo anterior es la razón por la que podemos producir teóricamente 1011 Ac o BCR diferentes. Regiones constantes pesadas en gris claro, regiones constantes livianas en verde, regiones variables livianas en amarillo y regiones livianas pesadas en gris. En la imágen vemos que las bolitas y palitos son los puentes disulfuro intra e intercadena, es decir, sostienen las dos cadenas, pero también entre las cadenas hay puentes. Sabemos que la región amino terminal es donde se encuentra la región variable y la carboxilo terminal es donde está la región constante. Este dibujo muestra amplificada la región hipervariable y nos dice que de todo un Ag, esa región es la que va a reconocer un epítope de ese Ag que tenga una forma geométrica determinada (en realidad no es por forma, es un asunto de atracción química).

Una bacteria es un Ag multivalente, es decir, que puede tener diferentes epítopes. Cada epítope va a ser reconocido por un Ac diferente. En conclusión: podemos tener muchos Ac que puedan reconocer una bacteria y por consiguiente, puede ser reconocida por diferentes clonas de LB.

Aquí ya nos dice que hay dominios o sitios 1, 2 y 3, que es una glicoproteína y que los CHO’s están en la región constante pesada. Nos repite que la región variable es el sitio de unión con el Ag. OJO: La región constante es la que tiene la función efectora. Las cadenas pesadas son diferentes, se pueden llamar → 𝜇, 𝛾, 𝛼, 𝛿o 𝜀 (miu, gamma, alfa, delta o epsilon) y de acuerdo a la cadena que tenga, tiene nombre la inmunoglobulina (𝜇→ IgM, 𝛾→ IgG, 𝛼→ IgA, 𝛿→ IgD, 𝜀→ IgE), entonces tenemos 5 isotipos o clases de inmunoglobulinas.

El alambre que vemos en la primera imágen del Ac se llama bisagra. Esta permite abrir y cerrar de acuerdo a la conformación del epítope. Es decir, ampliar el campo de acción del Ac (si el epítope está más lejano o más cercano). Pero además, no solo tiene movilidad hacia los lados sino que puede tener rotación. Entonces, tenemos 5 tipos de cadenas pesadas que dan el nombre de la inmunoglobulina y tenemos 2 tipos de cadenas livianas llamadas → 𝜅

𝑦𝜆

(kappa y lambda). Quiere decir que un

Ac puede tener una cadena pesada 𝜇 (IgM), pero puede tener las dos cadenas livianas o 𝜅 las dos, o

𝜆

las dos, no puede ser una

𝜆

y la otra 𝜅. El 60% de

nuestros Ac tienen cadenas kappa y el 40% tienen cadenas lambda. Sea una o la otra, no hace diferencia, es decir, no les da características. Sabemos que una proteína no es derecha, ella tiene dominios o estructuras conformacionales. El Ac en su estructura tiene puentes disulfuro intercadena, ellos cada más o menos 110 aminoácidos forman un bucle a través de un puente disulfuro → Esto se llama un dominio de inmunoglobulina. Vemos que en la región variable hay 1 dominio variable liviano y 1 dominio variable pesado, así como en la región constante hay 1 dominio constante liviano y 3 dominios constantes pesados.

En realidad, la estructura del Ac consta de hojas plegadas beta con alfas hélices. La primera proteína descubierta con los bucles mencionados fueron las inmunoglobulinas. De ahí en adelante cualquier proteína o glicoproteína que tiene esos bucles, la metieron en una superfamilia llamada → Superfamilia de las inmunoglobulinas. No porque tengan algo que ver con las Inmunoglobulinas, sólo es por los bucles. Ejemplo: -

Ig𝛼 e Ig𝛽→ Molécula que señaliza, la que tiene los motivos ITAM en el complejo receptorBCR. Receptor TCR → Es muy parecido a un brazo de un Ac, tiene dominios variables, dominios constantes y bucles. Moléculas MHC tipo 1 y 2 → Tienen bucles. Moléculas accesorias como CD2, CD3, CD4, CD8 → Pertenecen a esta familia por los bucles. Moléculas de adhesión como PECAM, ICAM, *EFA. Los receptores de las mismas Inmunoglobulinas. El receptor PolyIg, expuesto más adelante.

En conclusión, hay muchas proteínas con estructura parecida a las inmunoglobulinas, pero NO son ni familiares, ni similares ni cumplen funciones iguales. Sabemos que hay 3 CDR, que el CDR 3 es el más variable. Es decir, cuando uno mira los aminoácidos que hay en esa zona (CDR) hay muchísima más variabilidad. Esas 3 regiones (CDR 1, 2 y 3) está justo en la parte externa de la región variable, esto quiere decir que cuando llega el epítope ellas son las que primero lo van a encontrar; están muy expuestas.

Cuando llega el epítope hay unos cambios en algunas zonas, hay un movimiento como el de la unión ligando-receptor para poder agarrarlo bien. En la época en la que se descubrieron los Ac no había proteómica ni genómica y demás. Ya se sabía que era una Y pero no se sabía que hacía cada parte del Ac. Estos señores lo que hicieron fue utilizar dos proteínas o enzimas: 1. La papaína, la cual cortó por encima de la bisagra (las cadenas pesadas) y el resultado fueron tres partes: Dos zonas que pusieron en contacto con el Ag y se dieron cuenta que se unía a él, por lo que la llamaron fracción de unión al Ag (Fab) y una zona que al meterla a la nevera se cristalizaba, por lo que le dieron el nombre de fracción cristalizable (Fc). 2. La pepsina, la cual cortó por debajo de la bisagra, degradó esa fracción cristalizable y dejó los dos brazos juntos por la bisagra (los brazos que hay arriba de ella), con la facilidad de que esos dos brazos seguían conservando la unión con el Ag. Por esta razón se dieron cuenta que eran los dos brazos amino terminales los que se unían con el Ag. Podemos tener dos tipos de anticuerpos: Un Ac en la membrana (en el proceso de maduración de LB) y un Ac secretado (en el proceso de activación del LB). En el LB el proceso de maduración es más sencillo que el LT. El LB en su proceso de maduración expresa la cadena pesada 𝜇 y luego debe expresar las cadenas livianas para formar el IgM. Ese IgM va a ser parte de su receptor, es decir, el primer receptor que va a tener un LB en su proceso de maduración es una IgM. Luego se activa, llega a los epítopes, activa a ese LB con su BCR y lo que hace ese linfocito es secretar ese mismo receptor. Lo único que cambia es que ya no tiene región transmembranal ni intracitoplasmática, pero el Ac es el mismo, porque ahora soluble va a ir a reconocer ese epítope. ANTÍGENOS: Se le llama Ag a cualquier molécula que sea reconocida por un BCR o un TCR. NO quiere decir que con que ese Ag se una al BCR o TCR, pueda despertar una respuesta. Un Ag solo no despierta respuesta. Hay dos vocablos: Ag inmunógeno: Se llaman así solo aquellos que despiertan la respuesta. No todos los Ag son inmunógenos. Los CHO’s, lípidos, proteínas, ADN son Ag. Los lípidos NO son buenos inductores de respuesta inmune, los LT reconocen es péptidos. Recordar que la activación de un LT CD4+ implica la activación de otros grupos celulares con las moléculas que secreta. Si soy un Ag y no despierto una respuesta de LT CD4+, ni LT CD8+, no soy buen despertador ni amplificador de una respuesta. En VIH aparecen muchas infecciones porque se depletan los CD4, es decir, se depleta la central de comunicaciones, no hay citoquinas que activen otros grupos celulares. Entonces, los mejores inmunógenos son las proteínas porque activan a los LB y LT. Los NKT pueden reconocer glucolípidos y las moléculas presentadoras de glicolípidos se llaman CD1, pero no pueden activar a los CD4 ni a los CD8. Cualquier molécula puede ser Antígeno, pero Inmunógeno es aquella molécula que al unirse activa señalización intracelular y se activa la célula. Antígeno→ Glicoproteínas, metabolitos,hormonas, polisacáridos, ADN, microorganismos, etc. Hapteno→ Molécula que químicamente es muy pequeña y por ende difícilmente puede ser reconocida por estos receptores, no es inmunogénica. Los haptenos fueron descubiertos por Landsteiner, el mismo que descubrió el sistema ABO Decía que el aminobenceno(molécula muy pequeña) debería despertar una respuesta de Acs. Inoculaba conejos y nunca encontraba que generaran Acs contra esa molécula. A ese aminobenceno lo unió

a una proteína(ya se sabía que éstas si eran inmunogénicas). Hizo un sistema llamado Haptenotransportador o Hapteno-carrier. Ese es el principio de muchas vacunas, por ej a una de carbohidratos se les unen proteínas para poder que sea una inmunidad duradera. Si se dejara sólo el carbohidrato, si habría inmunidad pero muy bajita, IgM y no habría participación de los LT. Dicho sistema fue inoculado en los conejos. Cuando escanearon la sangre, encontraron: Acs para las proteínas, para el hapteno y para los dos. El sistema si funcionaba. Hay moléculas que en la clínica pueden actuar como haptenos: Penicilina, cefalosporinas, estreptomicinas, ácido acetil salicílico, sulfonamidas, anestésicos como la Succinilcolina. Si en algún momento, la penicilina se une a una proteína del glóbulo rojo, le causa una anemia hemolítica autoinmune. Los glóbulos rojos se empiezan a romper o a ser fagocitados. Esto es temporal mientras se está tomando el medicamento, luego vuelven los niveles a estar normales. Un microorganismo puede tener varios Ags, y éstos a su vez tener epítopes y que cada clona de linfocitos va a reconocer un epítope diferente. RECONOCIMIENTO DE AGS POR PARTE DE LOS ACS: El LT sólo reconoce sólo Ags lineales y un péptido de 8-11 AA’s (MHC I) o de 12-50 (MHC II). Los Anticuerpos pueden reconocer el Ag lineal o en forma conformacional(plegada).

DETERMINANTE CONFORMACIONAL O EPÍTOPE CONFORMACIONAL: Si está plegada y los epitopes están formados por estas dos moléculas cuando se denature la proteína, el Ac no lo va a poder reconocer. Cuando la proteína está conformada en su estructura terciaria, si están muy cerca los motivos que forman el epítope, el Ac lo va a reconocer. Si se denaturan, se separan, ya el Ac no podrá reconocer. DETERMINANTE LINEAL O EPÍTOPE LINEAL: Si tengo una estructura conformacional y lo que reconoce el Ac es una rayita, cuando se denatura, se va a poder seguir reconociendo. DETERMINANTE NEOANTIGÉNICO O NEOANTÍGENO: No hay epítope disponible, vistible en su estructura conformacional, pero cuando la proteína se denatura, se expone un Ag que no se veía antes, estaba “encriptado”. Cada que un Ag se une a un Ac debe haber un espacio de tiempo para poder que se unan, las interacciones existentes son las débiles: Puentes de hidrógeno, fuerzas electrostáticas, fuerzas de Van der Waals (nubes de electrones), fuerzas hidrofóbicas (lo similar atrae lo similar), catión pi interacción (nubes de electrones que se juntaban a veces por casualidad y algun átomo atraía más la nube del otro). Todas esas interacciones son corticas pero hacen que el Ag y el Ac tengan unos minutos en donde estén unidos y ese Ag puede inducir a que el Ac cumpla con su función efectora. AFINIDAD: La suma de la fuerza entre Ac y un sólo sitio de unión. AVIDEZ: Suma de la fuerza de unión entre Ac con dos o más epítopes. Si un Ac se une a un sólo sitio teniendo la oportunidad de unirse a dos, se dice que la avidez es baja. En el caso de la IgM que es un pentámero cuando es secretada, la avidez es muy alta, puede tener 3,4,5,8,9,10 sitios de unión con el Ag. FUNCIONES EFECTORAS DE LOS ANTICUERPOS: 1. Neutralización de microorganismos y sus toxinas. 2. Opsonización y favorecimiento de la fagoctisosis. 3. Activación de la vía clásica del complemento. 4. ADCC→ Citotoxicidad celular dependiente de Ac. 5. Degranulación de mastocitos. Cuando hay un microorganismo que va a entrar a un tejido o célula, él entra a través de un receptor e infecta. Cuando hay Acs, éstos no permiten que llegue al receptor y que entre. De esa forma neutraliza el microorganismo. En cuanto a los virus, los Acs sólo pueden actuar en el momento en el que éstos salen de la célula y van a entrar a la otra y los Acs van a evitar dicha entrada. En el caso de las toxinas, éstas necesitan un receptor para poder cumplir su función. Si el anticuerpo se une antes de que la toxina llegue a su receptor, entonces hay neutralización. Todos los fagocitos tienen el receptor FcƔR1, de más alta afinidad para IgG. Una vez que se une a ese receptor, se hace la señalización para la invaginación y el proceso de fagocitosis. Los receptores de las inmunoglobulinas son:

-PolyIgR -FcRN (receptor del recién nacido) -FcƔRI, FCƔRIIB y FCƔRIII(lo tienen los NK) son los de IgG. El de más afinidad se llama CD64, luego CD32 y el tercero CD16 (menos afinidad). -FCƔRIIA es un receptor activador -FCƔRIIB es un receptor inhibidor. Tiene motivos ITIM, cuando éstos son fosforilados atraen a las fosfatasas que quitan los fósforos, por eso inactiva la célula. La ADCC se da cuando hay un microorganismo o una célula opsonizada y no hay un fagocito, las NK que son inmunovigilantes van a unírsele con su receptor de baja afinidad que va a inducir a que unos gránulos lleguen al sitio donde está la célula y se degranulen, perforinas, granenzimas. La IgM es mejor activadora que la IgG, pues sólamente con dos cabezas globulares se activa el complejo C1, con la IgG se necesitarían dos moléculas con la distancia apropiada. ISOTIPOS DE LAS INMUNOGLOBULINAS: IgG→ Tiene a su vez 4 subtipos. IgG 1,2,3,4. La diferencia radica más que en la bisagra, en los puentes disulfuro. -De todas las inmunoglobulinas esta es la que se encuentra en mayor proporción en sangre. 80% -Hace parte de la respuesta inmune secundaria. -Atraviesa placenta. Inmunidad neonatal. Neutraliza los microorganismos para que el feto no se afecte. -Activa la vía clásica del complemento -Opsonina -Hace ADCC

IgM→ Pentámero 5-10% de las inmunoglobulinas en suero. -Hace parte de la respuesta inmune primaria. Aparecen títulos altos en la fase aguda de una enfermedad. -Primera inmunoglobulina en sintetizarse en el neonato. -Forma parte del BcR del LB virgen. “Función receptora más no efectora” -Puede atravesar mucosas en algunos momentos. -Neutraliza -Activa la vía clásica del complemento IgA→ Cuando está en mucosas es un dímero y puede tener dos subclases: IgA 1 que está en sangre e IgA 2 que está en mucosas y se encuentra en mayor proporción.

las secreciones -Neutraliza

de

- 10-15% de las inmunoglobulinas en suero. El resto está en las mucosas. -Está en la leche materna, en saliva, lágrimas, en todas tracto gástrico, respiratorio, genital.

La encontramos en monómeros, dímeros, trímeros. Las que no son monoméricas tienen una cadena de unión (join) cadena J. La producción de la IgA se da en la submucosa una vez que se activa el LB, el se diferencia en una célula plasmática que produce Acs, esa célula plasmática produce monómeros que se unen a través de esa cadena J, van a ir a una parte de la submucosa donde hay varios receptores llamados Poli IgR, que toma la IgA y al transportarla, forma una invaginación, una vesícula de transporte y la saca al lumen del tejido mucoso, cuando llega allá tenemos muchas enzimas que parten el poli IgR y hacen que se quede un pedazo tapando un punto de aquiles que tiene la IgA que es la cadena join, evitando su degradación. Eso que era parte del Poli Ig se llama el componente secretor y si no lo tuviera fácilmente las enzimas degradarían la IgA. IgE→ Ya sabemos que los LTH2 se activan ante la presencia de gusanos, de helmintos. No hay ninguna célula que pueda matar a éstos, ni fagocitarlos. Los LTH2 secretan IL-5 para activar a los eosinófilos e IL-4 para activar a los LB que produzcan IgE. Cuando a los basófilos, eosinófilos, mastocitos se les une IgE, ellos secretan una. Hay IgE que se han producido para proteínas específicas de los Helmintos, cuando ambas se unen hacen que los eosinófilos se degranulen, éstos tienen proteínas catiónicas: Proteína básica mayor y proteína catiónica del eosinófilo, ambas pueden empezar a “dispararle” y unirse al tegumento del gusano hasta que le forma pequeños poros y lo desestabiliza osmóticamente. Éstas células también inducen la producción de IL-4 e IL-13 que inducen peristaltismo, producción de moco que ayudan a defendernos de los gusanos, aunque un antihelmíntico sería lo mejor. -Participa en un proceso patológico, la alergia que también se llama hipersensibilidad de tipo inmediato, se produce cuando un alergeno llega por segunda vez a nuestro cuerpo, la primera vez lo que hace es sensibilizar, activar a los LTH2, activar a los LB y que los mastocitos que están cerca del sitio por ej si es un alergeno aéreo, la primera vez que una persona alergica al polen lo huele, no le pasa nada, el polen es captado por la célula dendrítica, ésta va al órgano linfoide

secundario, activa un LTH2 que secreta citoquinas para que se produzca IgE y se activen mastocitos. La IgE viene y se deposita en los receptores de los mastocitos de la nariz. Cuando entra por segunda vez, el alergeno llega directamente a los mastocitos, por eso estornudamos, nos da rinorrea, malestar casi de inmediato, porque la célula ya está “engatillada”, ya la IgE está ahí, se une y hace que la célula secrete prostaglandinas, leucotrienos, citoquinas proinflamatorias, histamina, etc. IgD→ -Se encuentra en una mínima cantidad en el suero. -La única función que se le conoce que no es efectora es ser parte del BcR del LB virgen con la IgM. -No se le ha identificado ninguna función efectora. Respecto al tiempo de vida media: -El de la IgG es mayor al de las demás. Los macrófagos en el suero están haciendo constantemente pinocitosis, y por ahí pueden tomar proteínas del suero, Acs y endocitarlos. En la membrana está el FC-RN, que permite que se trasloque IgG de la madre al feto. Pensaban que sólo estaba en la placenta pero se dieron cuenta que en los macrófagos, ellos cogian a la IgG, la unían y al unirla favorecían la formación de dos vesículas: 1) exocítica y reciclante y 2) otra que podía unirse al fagolisosoma y hacer la degradación. Gracias a ese receptor esos Acs se reciclan, pueden tener varios ciclos de endocitosis pero pueden durar hasta casi 1 mes. RESUMEN: IgG: -4 subclases. 1,2,3 y 4. Así se llama su cadena pesada. -Tiene 3 dominios constantes. -La más concentrada es la IgG 1. -Tiempo de vida media de casi todas es de 21-28 días. -La IgG 3 es de 7-8 días porque su afinidad por el receptor RN es bajita, entonces no se recicla tan fácilmente. -Atraviesa placenta. La IgG 2 lo hace deficientemente. Las otras 3 lo hacen bien. -La IgG 4 nunca activa la vía del complemento. -Si te preguntan cuál es la inmunoglobulina opsonizante debes decir IgG, pero igual tener en cuenta el punto de arriba. -La IgG 2 no es buena opsonina. No atraviesa mucosa. No activa mastocitos. IgA: -Tiempo de -Puede ser -Neutraliza en mucosa. IgM e IgE tiene IgM: -Puede -Mejor

vida

media monómero

de

2-3 o

días. dímero.

4 dominios constantes porque NO tienen bisagra. Las otras tienen 3.

ser activadora

de

pentámero la

o vía

clásica

un del

monómero. complemento.

-Forma parte -Atraviesa mucosas.

del

BcR

de

los

LB

vírgenes.

CLASE #5. MADURACI ÓN DE LB. 4 ABRIL Decíamos que los linfocitos hacen un aprendizaje para reconocer lo propio y lo extraño. La célula madre es la que origina todas las hematopoyéticas y dependiendo a la información que le llega toma decisiones: “me voy” a diferenciar en un progenitor linfoide o un mieloide de acuerdo a la célula que se necesita. En este caso se diferencia en progenitor linfoide, que a su vez puede dar origen a varios linfocitos: LB o LT. Esos LT pueden ser a su vez alfa-beta o gamma-delta. También de ese progenitor linfoide se diferencian las células linfoides innatas como las NK. Nos dedicaremos a los LB. Ese progenitor linfoide se compromete con el linaje del LB porque induce que se expresen unos factores nucleares que hacen que se comprometan con ese linaje. Ese LB madura en la médula ósea y esa maduración consiste en que debe empezar a expresar su receptor de membrana. El LT expresaba la cadena beta primero, el LB primero debe expresar su cadena pesada µ (la cadena pesada de la IgM) al lado de unas cadenas sustitutas. Un Ac es una Y, y cuando está en Y es estable, pero cuando está sola las cadenas pesadas no son estables, por ende unas cadenas sustitutas reemplazan mientras tanto a las cadenas livianas. Lo anterior explicado de otra forma: Cuando el linfocito se compromete con el linaje de LB, aparece el primer estadio que es un Pro-linfocito y que no tiene ningún receptor en su membrana. Este pro-linfocito es inteligente, se multiplica antes de empezar el proceso ya que más adelante debe superar unas pruebas y debe asegurar que al menos uno pase. Después de multiplicarse empieza a hacer unos re-arreglos para expresar la cadena pesada µ y unas cadenas sustitutas: Si este linfocito no logra organizar una cadena pesada µ, muere por apoptosis, si lo logra, sobrevive y pasa al siguiente estadío que se llama Pre-linfocito (primer punto de chequeo). Como pre-linfocito expresa un pre receptor que es el que hace las señalizaciones para que sobreviva (induce producción de proteínas antiapoptóticas y otras cosas). El LT hace lo mismo:

expresa cadena beta con una cadena sustituta y para pasar al siguiente estadío debe expresar la cadena alfa. ¿Qué puede hacer que un linfocito no exprese la proteína de membrana? Es decir, ¿por qué dice uno que no logró expresar la cadena pesada µ?: puede que en los marcos de lectura, llegue un codón de parada antes de que se exprese la proteína, o en su defecto no está bien plegada lo que no permite que se exprese en la superficie. Entonces dijimos que aquellos que no lo logran, entran en apoptosis sin oportunidad de entrar en el segundo estadio, mientras que los que si lo logran vuelven a multiplicarse o proliferar antes de entrar a prueba, y de estos linfocitos que expresaron la cadena µ, en el siguiente estadio les exigen que rearreglen los genes para que expresen las cadenas livianas (kappa y lambda). Aquellos que logren expresar esas cadenas livianas son las que entran al estadio de Linfocito inmaduro, y quienes no lo logran entran en apoptosis (segundo punto de chequeo). Es decir, para pasar al estadío de linfocito inmaduro, debe expresar toda la IgM sobre la membrana. El linfocito inmaduro (tanto B como T) sufre un proceso que se llama → Selección positiva y negativa, pero la del LB es más sencilla que la del LT, ya que el T primero hace una selección positiva para JP y JG virus, bacteria, hongo o parásito. 2- Evaluar la respuesta inmune al agente patógeno, para llevar a cabo esto: evaluando la activación celular o respuesta molecular. EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA CELULAR: Hemograma-> Busca ver como esta el comportamiento de los leucocitos cuando hay sospecha de infección. Si los leucocitos se encuentran aumentados, se puede asociar con una activación de la respuesta inmune, y puede se por 2 procesos: 1. Expansión clonal-> hace referencia a la activación de linfocitos, que son las unicas celulas que hacen expansión clonal. 2. Hematopoyesis-> este es un evento continuo pero frente a un estímulo esta se aumenta ya que se induce un aumento en la síntesis de las citoquinas hematopoyéticas lo cual activa más ese proceso y se aumenta el # de leucocitos. Pero ese aumento en el número leucocitario se vuelve muy inespecífico, porque no se puede decir exactamente si la infección es por bacteria, virus, parásito u hongos, ya que en todas se aumentará. CONCLUSIÓN: El hemograma no sirve para le Dx, a veces se vuelve orientador porque de acuerdo a los leucocitos que están aumentados se puede pensar más o no de cierto tipo de infección. Ejemplo: ● ● ●

MONOCITOS: Viral, bacteriano y fúngico. NEUTRÓFILOS: Bacterias y hongos. EOSINÓFILOS: Parásitos.

Estas son respuesta innata. ¿Y si se evalúa por la activación de linfocitos? Todos estos se aumentarian por la hematopoyesis y expansión clonal. ● ●

LT: Bacteria, hongos, virus, parásitos, tumores y cuadro alérgico. LB: Bacteria, hongos, virus, parásitos, tumores.

Todos estos son muy inespecíficos, por tanto solo nos queda la evaluación molecular:

● ●

●

Citoquinas: No se hace porque son moléculas inestables, de vida media muy corta y son también muy inespecíficas. Reactantes de fase aguda o proteínas de fase aguda: La más común es la proteína C reactiva (PCR), esta es producida en el hígado inducida por citoquinas (IL-1, IL-6 y TNFalfa) que son secretadas por los macrofagos activados por virus, bacteria y hongos. Por tanto sólo indicaría que hay una posible infección. Tambien recordemos que los macrofagos reconocen PAMP’S pero también DAMP’S -> Quiere decir que se puede activar en un paciente que se esté infartando que este insolado. POR TANTO ES SIMPLEMENTE UN MARCADOR DE INFLAMACIÓN SISTÉMICA POR: quemaduras, gestación, insolar, infarto, infecciones. Ac’s: Estos si sirven para un buen Dx. Una persona solamente produce y secreta Ac’s para aquellos Ag’s a los cuales se haya expuesto.

Los LB por procesos de maduración aleatoria ya son específicos es decir ANTI porque esto me indica la especificidad de la célula, ejemplo: anti-GP120 la proteína del VIH, anti-dengue 1, antitoxoplasma…. entre otros. Pero solo ese LB pasará a ser célula plasmática que secrete Ac’s, cuando me exponga al Ag; esos Ac’s se irán a sangre. Por tanto para confirmar la presencia de VIH en mi cuerpo: 1. encontrar el virus en mi cuerpo 2. encontrar Ac’s secretados en sangre específicos para Ag’s del virus Hay dos formas de exponerse a un Ag: ● ●

ACTIVA NATURAL: Infectarme ACTIVA ARTIFICIAL: Vacunarme

Debido a que los podemos adquirir por vacunación, no podemos asociarlos de una con una infección. Pero en caso de VIH, dengue, toxo, cándida, que no tiene vacuna, si encontramos Ac’s quiere decir que si tiene la infección. Lo que se hace aca seria la evaluación de ISOTIPO o de la cantidad de Ac o títulos. Prueba de laboratorio por la cual se determina la presencia de Ac’s: Serología, sero es de suero que es el componente líquido de la sangre en donde están las proteínas dentro de las cuales están los Ac’s. Si como médico solo pedimos una serología-> harán solo para sífilis, es por esto que se debe especificar para qué es. PRINCIPIOS DE LABORATORIO: 1. Evaluar la presencia de un Ag: Analito-> Ag Reactivo->Ac 2. Evaluar la presencia de un Ac para un Ag: Analito-> Ac Reactivo-> Ag La molécula a evaluar se va a llamar el ANALITO (analizar) y lo que se utiliza para evaluar la presencia del analito es el REACTIVO. ¿Que se espera de las pruebas de laboratorio? 1. Que sea rápida: para poder instaurar un tratamiento adecuado de forma temprana. 2. Que no sea costosa.

3. Que sean de fácil estandarización: que se puedan implementar en diferentes laboratorios. 4. Que se puedan reproducir rápidamente: que al mismo tiempo se pueda hacer Dx de múltiples pruebas. En el caso de las pruebas Dx que se utilizan Ac’s con reactivos, generalmente se utilizan Ac’s monoclonales, esto quiere decir que son Ac’s todos provenientes de la misma clona de linfocitos por tanto serán específicos para el mismo epítopo del mismo Ag. También hay Ac’s policlonales que son provenientes de diferentes clonas, pueden ser específicos para un mismo Ag pero diferente epitope o pueden haber Ac específicos para diferentes Ag’s. ¿Para qué son útiles estas pruebas de laboratorio? 1. Dx de infecciones: se pueden desarrollar pruebas para todos los microorganismos, lo que se debe conocer es el Ag de cada grupo de microorganismo. 2. Para hacer diferenciación de serotipos de microorganismo, ej: dengue 1, dengue 2, dengue 3, dengue 4. 3. Dx de enfermedades autoinmunes 4. Dx de cáncer ¿Que tipo de muestras se deben usar? La muestra va a depender de la sospecha: saliva, sangre, suero, plasma, LCR, líquido sinovial, tejidos… TIPOS DE PRUEBAS INMUNOLÓGICAS: 1. Las que utilizan Ag o Ac marcados: A la molécula (Ag o Ac) se le unirá otra molécula que puede ser una enzima, isótopo radioactivo, fluorocromo. Este reactivo marcado se busca que se una a su analito, y para saber si esto si se dio se da: una reacción enzimática o fluorescencia (emisión de luz). 2. Las que utilizan Ag o Ac NO marcados: Generalmente se hacen por evaluación de aglutinación, floculación o precipitación. Es simplemente observar o determinar la presencia de “grumos”. PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN: Evalúan la unión de un Ac a una Ag no solube (una molécula unida a una célula propia o a un microorganismo). Como ejemplo usaremos las pruebas de aglutinación para hacer la hemoclasificación: HEMOCLASIFICAR-> Es evaluar la presencia de un Ag eritrocitario, cuando ese Ag está unido a el. Tipos: ●

Directas: Se usan eritrocitos como partícula para aglutinar. ● Indirectas: Se usa perlas de látex. Los Ac’s como se unen específicamente a algún epitope de un Ag de un microorganismo. Estos Ac’s empiezan a unir una bacteria con otra bacteria y eso forma un grumo. Reaccion de aglutinacion: Es cuando un Ac al unirse a un Ag expresado aglutina a las células que tienen ese Ag.

Esta es una prueba de hemoclasificacion, en ambos se agrego una gota de sangre donde posterior se agregaron Ac’s, y solo en 1 hubo aglutinación +, en la otra no hubo; esto significa que en la muestra que dio -, las células no tenían el Ag específico para los Ac’s, por tanto las células quedaron dispersas, mientras que en el que dio + los Ac’s empezaron a agrupar o aglutinar los eritrocitos y se formaron grumos. Estas pruebas sirven para: 1) Determinar el grupo sanguineo-> Importante para un transfusión sanguínea y para trasplante de órganos, se mira antes esto que el HLA porque sino son compatibles en la hemoclasificación, pues no se hace el trasplante. PRINCIPIO DE LA HEMOCLASIFICACIÓN: El grupo sanguíneo de cada individuo está determinado por la presencia de unos Ag’s que se llaman: A, B, O. Estos Ag’s su naturaleza química son carbohidratos. Por lo tanto son TIMOINDEPENDIENTES -> Inducen respuesta inmune adaptativa humoral (Ac’s→ IgE solo se produce este tipo de Ac’s frente a esos Ag’s) Prácticamente sólo hay 2 Ag’s asociado, ya que el O es fantasma. Entonces quedaria solo el A y el B. Una persona puede tener el A, AB, B , o no tener ninguno de los dos que vendría siendo O.

Sobre los eritrocitos hay muchos más antígenos porque estos son moléculas (proteínas, lípidos, carbohidratos, glicoproteínas) y los eritrocitos tienen muchas en su membrana, o sea que tienen muchos antígenos pero se resaltan los Ag’s ABO y los Ag’s RH para la hemoclasificación. RH: es otro antígeno y su naturaleza química es proteíca por esto son Ag’s timodependientes. Induce respuesta inmune adaptativa HUMORAL pero con ayuda de LTCD4, frente a este antígeno se induce cambio de isotipo y los Ac´s producidos contra el RH son Ac’s IgG, lo anterior tiene importancia clínica en una enfermedad que se verá más adelante llamada ERITROBLASTOSIS FETAL o la incompatibilidad del RH que afecta a gestantes. PRINCIPIO PARA LA HEMOCLASIFICACIÓN: Cada persona o individuo NO produce Ac’s contra sus propios Ag’s, pero SI contra Ag’s extraños a los cuales se exponga.

El sistema inmune NO ve el ag O, para él es invisible y por tanto no induce respuesta inmune. QUIZ TIPO SANGUÍNEO

Anti O

Anti A

Anti B

Anti RH

TRANSFUSIÓN

O+

X

✔

✔

X

O (todos + o -)

O-

X

✔

✔

✔

O (solo -)

A+

X

X

✔

X

A, O (todos + o -)

A-

X

X

✔

✔

A, O (solo -)

B+

X

✔

X

X

B, O (todos + o -)

B-

X

✔

X

✔

B, O (solo -)

AB+

X

X

X

X

AB, A, B, O. (todos + o -)

AB-

X

X

X

✔

AB-, A-, B-, O-

Anti: Son los Ac’s que el paciente tiene en circulación, el prefijo anti me indica la especificidad. Cuando me dicen que un individuo tiene Ac’s anti dengue es porque hay un Ac que se une a dengue, si digo anti RH estoy diciendo que es un Ac que se une al RH. TIPO SANGUINEO O+: es una persona que tiene los ag O y Rh o sea que NO va a producir Ac´s para estos antígenos propios, pero si se expone a los ag’s A y B podrá y va a producir Ac’s contra los antígenos A y B. PRINCIPIO INMUNOLOGICO: Si una persona tiene Ac’s específicos para un antígeno, la exposición a ese antígeno induce respuesta inmune, llevado a la clínica: Si tengo un paciente O que necesita ser transfundido, las unidades de sangre que usaré son de tipo O, pero NO puedo transfundirle sangre A porque el Ac anti A se uniría al Ag A del eritrocito transfundido e induciría la destrucción de eritrocitos. Si transfundo un individuo con una sangre para la cual tiene Ac se va a generar una respuesta contra el eritrocito y sucederá destrucción del eritrocito, agravando el problema.

A todos los grupos sanguíneos puedo transfundirles unidades tipo O porque el eritrocito O no tiene ningún antígeno y no genera una respuesta inmune, es por esto que las personas con grupo sanguíneo O+ se les dice DONANTE UNIVERSAL. Las personas AB+ pueden recibir todos los tipos sanguíneos y es por esto que se llaman SUPER UNIVERSAL. Las personas O- pueden recibir sangre tipo O+ la PRIMERA VEZ, porque apenas se va a exponer y va a producir los Ac’s, en siguientes transfusiones NO. · Las personas con grupos sanguíneos RH+, se pueden transfundir con unidades de sangre (+) o (-) y nunca habrá problema porque si lo transfundo con una sangre RH+ pues él ya es + y no pasa nada y si transfundo con RH- será lo mismo porque estos eritrocitos NO tienen el antígeno y pues no pasa nada. ·

Las personas de grupo sanguíneo RH- se deben transfundir con unidades (-)

En el caso de las personas de grupo sanguíneo O, desde el momento en que nacieron ya tenían anti A y anti B lo que implica que estuvieron expuestas en algún momento a estos antígenos según en el principio. Los antígenos A y B que indujeron la producción de Ac’s salieron de las bacterias intestinales fetales que tienen los mismos antígenos. Las personas que son RH-, a menos de que sean expuestas al RH+ por transfusión o exposición a sangre con RH+ seguirán siendo negativas para estos anticuerpos, mientras que a los otros antígenos la exposición se da en estadíos fetales. En la sangre de un paciente O+ hay eritrocitos sin A, sin B y con el O(fantasma) o sea libres de antígenos pero en la SANGRE o SUERO como tal está el anti A y anti O(proteínas), o sea Ac´s que destruyen los eritrocitos con A y eritrocitos con B. ¿Entonces por qué le puedo poner la sangre tipo O a una persona tipo A o B o AB? R/ Porque cuando donamos sangre, se dona completa pero los bancos descomponen la sangre en hematíes, plaquetas y plasma y cuando uno recibe unidades de sangre lo que recibe son HEMATÍES (célula) libres de Ac’s. Hay transfusiones de sangre completa pero para esto se necesitaría mucha homología. HEMOCLASIFICACIÓN Lo primero que debemos saber para una transfusión es el tipo de sangre del paciente y esto no puede guiarse por lo que dice la cédula, sino que el bacteriólogo hace la hemoclasificación y usted confía es en esto. Tengo dos pacientes y los vamos a mirar horizontalmente. Cada paciente representa un papel y en él hay tres círculos y a cada círculo se le agregó una gota de sangre del mismo paciente.

*PACIENTE 1: PRIMER POZO O CIRCULITO: se le agregó anticuerpo anti A y AGLUTINA, LO QUE significa que el Ac que agregué se unió a el antígeno o sea que la persona tiene el antígeno. SEGUNDO POZO O CIRCULITO: se le agregó anticuerpo anti B y AGLUTINA. TERCER POZO O CIRCULITO: se le agregó anticuerpo anti D (es el mismo RH) y AGLUTINA. GRUPO SANGUÍNEO: AB+ *PACIENTE 2: PRIMER POZO O CIRCULITO: se le agregó anticuerpo anti A y AGLUTINA. SEGUNDO POZO O CIRCULITO: se le agregó anticuerpo anti B y NO AGLUTINA. TERCER POZO O CIRCULITO: se le agregó anticuerpo anti D y AGLUTINA. GRUPO SANGUINEO: A+

CLASE 7 - MIÉRCOLES 11 DE ABRIL Corrección→ Había dicho que la región variable tenía 2 dominios La región variable del Ac que puede ser de la cadena pesada y de la cadena liviana, tiene un dominio variable pesado y un dominio variable liviano. Cuando una célula se activa, se activan una serie de estructuras o moléculas que van a llevar a la activación y a la respuesta que esta célula da ante este estímulo. A una célula le llega un mensaje y ésta responde secretando otras moléculas o expresándolas en su membrana para cumplir la función efectora. Los LB no son la excepción, una vez que se unen los epítopes al BcR, empiezan una serie de cascadas de señalización. Tenemos unas quinasas que están pendientes de cualquier movimiento del receptor y éstas empiezan a fosforilar algunas moléculas que van a hacer que toda esa señalización llegue hasta el núcleo y que desde allí empiece el proceso para la síntesis de esas moléculas.

OBJETIVOS: -Conocer cómo se activan los LB -Conocer los eventos que ocurren en la reacción del centro germinal. ANTÍGENOS T-DEPENDIENTES: Deberían ser Ags que tuvieran proteínas, porque el LB como APC tiene la facilidad de poder endocitar, procesar y presentar epítopes proteicos a los LT. El nombre de T-dependiente es porque puede ser susceptible de ser presentado y activar a los LT y una vez que están activados van a secretar citoquinas y éstas van a ayudar en procesos importantes para los LB, por ej: -Cambio de isotipo (sino hay citoquinas, no se dará esto). Las citoquinas son mensajeras y de acuerdo con la citoquina que se secreta al LB, este LB deja de producir la inmunoglobulina que produce inicialmente que es IgM y la cambia por el isotipo que va a necesitar. Si es un Helmintos necesita IgE. Ese cambio sucede en la reacción del centro germinal. -ANTÍGENOS T-INDEPENDIENTES: Se llaman así porque tienen varios epítopes igualitos que van a tomar varios BcRs al mismo tiempo, la activación va a ser muy buena así sean carbohidratos, o sean proteínas como la Pilina que tienen la misma estructura. Este tipo de Ags van a activar generalmente a los LB-1 o a los LB de la zona marginal del bazo. Cuando son activados, secretan inmunoglobulina M No pueden hacer cambio de isotipo, maduración de la afinidad, ni generación de células de memoria y plasmáticas de larga vida. Algunos ags muy puntuales pueden inducir un poquitico de cambio de IgM a IgG (pero no es lo común). Si preguntan: ¿Qué isotipo de inmunoglobulina inducen los ags t-independientes? IgM en casi todos los casos. Hay dos citoquinas importantes para los procesos de los LB, para la transición, para la maduración, para el mantenimiento de la memoria y para el mantenimiento de las células plasmáticas de larga vida. Se llaman: -APRIL: Se puede unir a BCMA y BAFF-R. -BAFF: Especialmente en los procesos de transición. Se puede a unir a los 3 receptores. Ambas en los procesos de memoria y mantenimiento de las células plasmáticas de larga vida. Ellas tienen unos receptores: BCMA, TACI y BAFF-R. Van a promover la sobrevivencia, la diferenciación, la coestimulación. Cuando un LB-2. Si dejara en un examen, IgM+ e IgD+ y dijera poner el nombre de la célula, sería LB-2 folicular. No es B1 ni de la zona marginal del bazo porque ninguno de éstos tiene IgD+. Tenemos un LB-2 que va a unirse al Ag, lo endocita, prolifera, hace expansión clonal y se diferencia en una célula plasmática que produce inicialmente IgM. En la respuesta primaria producimos mucho IgM, su función efectora es neutralizar. Algunas de esas células que se activaron, la mayoría empieza a producir IgM, unas pocas van a hacer la reacción de centro germinal, allí se dará:

-Cambio de isotipo; se va a producir la inmunoglobulina pertinente, la que es especializada, la que va a favorecer la eliminación de ese microorganismo. -Maduración de la afinidad; significa que esos linfocitos van a volver su BcR más afín, es como tener un imán chiquito cuando tengo un Ag que es metálico, pero voy a cubrir todo con imán, de tal forma que la próxima vez que vea a ese mismo ag, lo agarre con más fuerza, más rápidez, de una forma más efectiva. Una vez que esos linfocitos ya han hecho las dos cosas de arriba, entonces se diferencia en células de memoria (que van a actuar cuando por segunda, tercera, cuarta vez se encuentren al mismo Ag. Y se van a generar células plasmáticas de larga vida; son aquellas que van a seguir secretando desde la médula ósea pequeñas cantidades del anticuerpo.

¿Por qué le piden títulos de Acs de una vacuna que se aplicó hace 5 años? ¿De dónde salen? A través de las células plasmáticas de vida larga; son las únicas que van a secretar casi de por vida anticuerpos contra un “reto” que ha sido proteico. Ej: cuando bebé te aplican la vacuna de la TBC y a los 20 años te siguen saliendo títulos. Las células de memoria están en los órganos linfoides secundarios o en los sitios de la infección, pero quiescentes, quiere decir que no están reproduciéndose, no están secretando anticuerpos. ACTIVACIÓN DEL LB

Para que se active un LB tiene que haber una unión cruzada, quiere decir que el Ag debe ser reconocido como mínimo por dos moléculas, que puede ser IgM, IgD, en el caso de los LB-2 foliculares. La IgM puede recepcionar primero solita el epítope, pero luego encontramos que están juntas (ver img). Las balsas lipídicas son unas estructuras que están en la membrana que ayudan en el proceso de acercamiento del complejo receptor, eso sucede en el TcR también. Cuando sucede esa interacción con el Ag, todo se activa y empieza a darse un movimiento para acercar las moléculas, Ig alfa, Ig beta, IgM, Igd, para que se de la unión. La activación se da después de esa unión cruzada, allí Ig alfa e Ig beta son susceptibles de ser fosforiladas por esa familia de tirosinas-quinasas que están muy cerca del receptor (en la img “Lyn”). Según un artículo se comprobó que si hay movimientos que se pueden observar en el dominio pesado μ4 de la inmunoglobulina M. Cuando ya el BcR se junta se dan las fosforilaciones.

ig alfa e ig beta son fosforiladas por lyn (tirosina quinasa), cuando ya están fosforiladas atraen químicamente a Syk y a su vez fosforila a otras moléculas. Lyn también fosforila al Btk y ésta activa a la fosfolipasa C gamma , para que tome el IP3 (inositol trifosfato) de los fosfolípidos de la membrana y los convierta en diacilglicerol y en inositol trifosfato. Estas dos moléculas sirven como segundos mensajeros que van a activar factores nucleares. El CR2 o CD21 tiene a su lado una molécula CD19, no tiene motivos ITAM, recepciona C3d, que sale de la fragmentación c3b, es la última porción. El CD19 activa una quinasa que se llama PI3K que va a ayudar en el proceso de la señalización, la va a amplificar. En la img se ve que hay receptores activadores e inhibidores. El CD22 y el FCƔRII tiene motivos ITIM (motivos de inhibición basados en tirosina) no ITAM, estos son motivos de inactivación basados en tirosina. Cuando la célula se está activando, también allá pueden ir a fosforilar esas tirosinas de allí(donde dice Y Y) y al fosforilarlas ellas activan fosfatasas cuya función es quitar fósforos. En conclusión no habrá activación, se acaba. Un LB se inactiva cuando ya ha cumplido su función, cuando ya se forman una gran cantidad de complejos inmunes “la cosa está funcionando bien”, ya efectivamente se está eliminando el microorganismo. Hay una familia de tirosinas-quinasas (Fyn, lyn y Blk) que fosforilan a ig alfa e ig beta. Atrae a Sik, ésta es fosforilada. A su vez éstas quinasas empiezan a fosforilar a otras. Btk activa fosfolipasa C gamma 1(PLCγ1) para producir: -Diacilglicerol→ quinasa c.

Activa

la

proteína

-Inositol trifosfato→ Activa las enzimas dependientes de Ca. Calcineurina y calmodulina. Por otro lado se van a activar las Ras quinasas, esta vía va a activar a las quinasas ERK y JNK para formar o activar a factores nucleares.

En conclusión, después de la activación de múltiples moléculas, de segundos mensajeros, se van a activar 3 factores nucleares: 1. NAFT: 2. 3. AP-1.

se le descubrió NF-kB:

al LT Factor

primero,

pero está nuclear

en

todas las kappa

células. B.

El Myc no es un factor nuclear, es un factor receptor. Hay otros factores nucleares más, por ej, los IRFs, pero en todas las células de la respuesta inmune se usan los mismos factores nucleares, no son específicos para una sola. ¿CÓMO PUEDEN PARTICIPAR MOLÉCULAS DE LA R.I. INNATA EN LA ACTIVACIÓN DEL LB? El CR2 puede actuar con el BcR ayudando en el proceso de activación. Los LB 2 de la zona marginal del bazo son los que más CR2 tienen, reconocen Ags que vienen en sangre, son los encargados de eliminarlos. IgM con TLR se ha visto más en los LB-1. Tanto CR2 como TLR son moléculas que han participado en la respuesta inmune innata pero que acá participan como si fueran correceptores, coactivadores de esa célula. sI ELLOS NO ESTÁN SI SE ACTIVA EL LB PERO NO LO HACE COMO TAN GRANDE. El ag llega al BcR y ya vimos toda la señalización, una de esas señalizaciones hace que haya una invaginación, endocitosis, los LB hacen endocitosis mediada por clatrina, se hace el endosoma y se va a hacer un reciclaje (lo que decíamos que hacía la IgG, que era reciclada, porque no era degradada, sino que volvía con unas vesículas recicladoras a salir), se forma una vesícula reciclante que vuelve y expone el BcR y el microorganismo queda susceptible de ser procesado y presentado por el LB en el contexto de las moléculas del MHC II. REACCIÓN

DEL

CENTRO

GERMINAL

Sabemos que los LT maduran en el timo, ellos deben hacer una recirculación cuando ya hacen selección + y - salen a poblar los órganos linfoides secundarios, como los ganglios linfáticos, allí se ubican en la paracorteza. El LB madura en la médula ósea, salía inmaduro o en estado transicional y en el bazo acababa de madurar. El LB-B2 folicular no se queda quieto, sino que empieza a recircular entre los órganos

linfoides secundarios. En un ganglio linfático, los LB se ubican en la corteza, en los folículos linfoides. Llegan allí, de un órgano a otro a través de Selectinas, Integrinas, Quemoquinas y receptores de quemoquinas, favorecen ese desplazamiento, para que salgan a la sangre y puedan ir pasando de un órgano al otro. Después de que las selectinas e integrinas han funcionado a nivel del endotelio vascular para que las células puedan ir llegando, saliendo, llegan al ganglio y se ubican esos LB en el folículo linfoide a través de la expresión del receptor CXCR5, su ligando es CXCL3 que es secretado por las células dendríticas foliculares que se encuentran justamente en el folículo linfoide. Los LT para ubicarse en la paracorteza, llegan por las vénulas epiteliales altas y en la paracorteza hay 2 quemoquinas: CCL19 y CCL21, el LT virgen está expresando el CCR7. ¿Cómo llegan las células dendríticas del sitio de la lesión al ganglio linfático? La célula dendrítica se une a Ags, los va endocitando, procesando y presentando mientras va por la linfa y llegan a través de los vasos linfáticos aferentes a los ganglios linfáticos cercanos a presentarle a los LT que están allí virgenes, busca hasta que encuentre el TcR específico para ese epítope. En la paracorteza se activan los LT. Mientras tanto por esos mismos vasos linfáticos aferentes vienen las bacterias, los Ags, algunos de estos (pequeños) pueden pasar directamente desde el ganglio al folículo donde están los LB, si hay un BcR específico para ese Ag se va a unir. Mientras por un lado los LT se están activando por las Células Dendríticas, los LB se pueden estar activando directamente por el Ag. Si el Ag es muy grande o viene en un complejo inmune o un C3b unido a él o un Ac que no cabe por esos ductos...Se descubrieron unas células llamadas Macrófagos del seno subcapular que no fagocitan a ese Ag, sino que son ricas en receptores que van a captar esas moléculas de ese Ag y lo sostienen allí, viajan con esos Ags hasta el folículo y esperan allí y si ven un LB que tiene un BcR que sea más afín que ese receptor que está sosteniendo, SE LO QUITA. No está presentando, está ENTREGANDO, está cargando ags que estaban en la linfa para ir a entregarlos al BcR del LB. Otros autores hablan de que hay células dendríticas en la médula que hacen eso mismo de arriba, cargar los ags para entregárselos a los BcR del LB. El LB empieza a tener una serie de cambios, hay señalizaciones intracelulares para que se expresen las células antiapoptóticas para la sobrevivencia de ese LB y prolifere y haga expansión clonal, para que exprese moléculas coestimuladoras como el B7-1 y B7-2, para que exprese receptores de citoquinas porque el LT luego le va a secretar unas citoquinas que el necesita. Ese LB empieza a expresar el receptor de quemoquinas: CCR7, entonces miren lo que sucede: El CxCR5 lo hace quedarse allí en el folículo linfoide, pero cuando el se activa empieza a expresar un receptor que lo hace caminar, salirse del folículo y llegar a la zona de los LT, el receptor es el CCR7 y las quemoquinas que lo atraen son CCL19 y CCL21. Resúmen: Llegó el Ag, entró al folículo de la forma que haya sido (lo ayudaron o directamente), el BCR lo reconoció, lo endocitó, lo procesó y lo presentó. En el proceso de activación hay varias cosas, dijimos que expresa moléculas coestimuladoras, hay supervivencia, expresa receptores de quemoquinas y empieza a expresar un receptor que los va a sacar de allí. Por parte de los LT → La célula dendrítica que llegó a la zona de los LT con un Ag, buscó y encontró un linfocito virgen al cual presentarle ese Ag. Recuerden que un LT virgen no se activa si no hay moléculas coestimuladoras. Este LT virgen se activa y la mayoría de ellos van a salir al sitio donde se encuentra la infección a colaborar con las células que están allí defendiendonos.

Pero hay unos pocos, predestinados genéticamente, que expresan un factor nuclear llamado BCL6 y se van a diferenciar en LT foliculares. Esos LT foliculares empiezan a expresar el receptor de quemoquina CxCR5, es decir que hace un cruce. Los LB que eran ricos en el CxCR5 ahora salen del folículo con el CCR7, y los LT que eran ricos en CCR7 expresan el CxCR5 para acercarse al folículo. No estamos hablando de una sola célula si no de varios LT y varios LB que van caminando unos para adentro y otros para afuera. Aquellos LB que estén expresando el mismo epítope que les presento la célula dendrítica al LT se van a encontrar y esto se llama → COOPERACIÓN BT, la primera, que ocurre extrafolicular (en las inmediaciones del folículo). Lo que ocurrió es que la una ya salio, la otra iba a entrar, se atrajeron por la parte de la presentación antigénica. Lógicamente hay muchas moléculas unidas. Esa primera cooperación BT ocurre para que el LT le secrete citoquinas al LB y esta se pueda diferenciar en Células plasmáticas de corta vida productora de IgM principalmente. Este Ac es el que va a ir al sitio de la infección a activar el complemento, neutralizar, etc. Todo esto está sucediendo extrafolicular. Resúmen: Por un lado el LB se activó, procesó y presentó → Salió porque expresó CCR7. Por otro lado, la célula dendrítica procesó y presentó → Activó el LT que se llama LT folicular → LT folicular empezó a expresar CxCR5. Al intentar el uno entrar y el otro salir, aquellos linfocitos que se encuentren y que tengan el mismo epitope, van a hacer la primera cooperación BT, la cual produce una reacción extrafolicular en donde se producen muchas células plasmáticas de corta vida que producen principalmente IgM. En Abbas dice que se han encontrado pequeñas cantidades de IgG (cambio de isotipo) sin maduración de la afinidad (es decir en la primera cooperación). Cuando un LB endocita y se activa, hay varias vías de señalización: una de ellas decíamos que producía la endocitosis, pero hay otra que hace que se exprese un receptor muy importante llamado CD40. Es decir, el LB endocitó, procesó y presentó pero a su vez está expresando el CD40 y el receptor de citoquinas visto al principio. Cuando se encuentra en esa primera interacción BT, le presenta el epítope al TCR que hace una señalización. En esa señalización del LT, el hace dos cosas: 1. Expresa el ligando del CD40 y 2. Secreta citoquinas. Este (creo que el LT) ya venía activado porque el mismo Ag lo activó. Cuando se une el ligando del CD40 con el CD40, es una señalización muy importante para el LB, al igual que las citoquinas. Es importante porque gracias a esa señalización, el LB va a proliferar, va a secretar Ac y se va a diferenciar en células plasmáticas productoras de Ac. OJO → Persona con mutación en el CD40 (el cual es importante tanto para la maduración de la afinidad como para el cambio de isotipo), es decir, que no tenga CD40 o no tenga CD40 ligando no hace ninguno de estos procesos, no hay reacción del centro germinal → Síndrome de HiperIgM, es una persona que jamás hace cambio de isotipo ni maduración de la afinidad, su respuesta siempre es la misma y por eso es una inmunodeficiencia. A estas personas hay que estarles aplicando inmunoglobulinas mensualmente, excepto la IgM. La interacción LT-LB uno la ve como en 3D, como si el receptor y el ligando fueran grandotes, pero realmente es como la imágen. La sinapsis inmunológica es como un cierre (ligando-receptor, ligando-receptor).

REACCIÓN DEL CENTRO GERMINAL En esta reacción ocurre: 1. Maduración de la afinidad, que se hace a través de Hipermutaciones, principalmente en la región variable y principalmente en las cadenas livianas. Como se hacen mutaciones se cambia el marco de lectura y puede ser que la inmunoglobulina que tenía un aminoácido cargado positivamente, en la hipermutación cambie por un aminoácido cargado negativamente y eso hace diferencia en la unión con el Ag. 2. Cambio de isotipo: Cambiar de IgM a IgA, IgE, IgG. 3. Se generan después de esto células plasmáticas de larga vida y células de memoria. Entonces, el proceso es así: Veníamos de una primera cooperación BT con una secreción de IgM. Ojo: La mayoría de los LB se diferencian en células plasmáticas de vida corta, unos poquitos, los de la reserva por decirlo así, se devuelven al centro germinal y entran con los LT foliculares (la proporción sería: de 10 LB, 7 se diferencian en C.P. vida corta y 3 se devuelven). Entonces, los LB que se devuelven se multiplican, endocitan el BCR y hacen una especie de concurso → Van a hacer unas mutaciones al azar en la cadena liviana para cambiar el BCR, con el objetivo de mejorar la afinidad, NO CAMBIARLA, sólo mejorarla, que sea más fuerte y más efectiva. Esto es lo que se llama Maduración de la afinidad. Recordar que los LB SIEMPRE antes de hacer una actividad importante se multiplican para que alguno se salve. Entonces, al ver el microscopio vamos a encontrar una zona oscura que indica que los LB se multiplicaron tanto que no pasa la luz. Listas las mutaciones, ellos vuelven a expresar el BCR. Cuando endocitaron el BCR se llamaban Centroblastos, y cuando lo vuelven a expresar se llaman Centrocitos. Estos centrocitos van a hacer el concurso y el que se encarga de decir o verificar si mejoró o no la afinidad es la Célula dendrítica folicular (que es una célula dendrítica captadora de Ag). Ella se la pasa recogiendo cuanto complejo inmune-Ag llega ahí y lo tiene ahí siempre expresado. Aquí va a haber algo que en los textos se define como Selección de afinidad → va a haber una selección positiva que no se debe confundir con la de la maduración. La selección aquí es por afinidad, pueden ocurrir dos cosas: 1. Se seleccionan positivamente por afinidad: Aquellas en las que el BCR haya mejorado la afinidad y cuando vea la célula dendrítica que está expresando el Ag, ese BCR le va a quitar ese Ag porque es más afín. La célula dendrítica sólo lo sostiene, si viene un LB que su BCR es más afín, se lo quita, lo endocita, lo procesa y lo presenta a los LT foliculares que entraron con él, en el contexto del MHC tipo ll → Segunda cooperación BT. Cuando se hace la segunda cooperación BT (intrafolicular), es ahí cuando el LT le va a secretar citoquinas a ese LB para que cambie de isotipo por IgA, IgG o IgE, de acuerdo al microorganismo. Por ejemplo, si el macroorganismo era un helminto el LT folicular va a secretar IL-4 para que produzca una IgE. Aquí también es importante el CD40 y el CD40 ligando, por eso aquellas personas que no expresan los anteriores, siempre van a producir IgM. Una vez han hecho maduración de la afinidad y cambio de isotipo, los LB se diferencian en: 1. Células de memoria, que van a estar tanto en órganos linfoides secundarios como en los tejidos). 2. Células que inicialmente se llamarán Plasmoblastos, mientras llegan a la médula ósea, en donde se nombran → Células plasmáticas de larga vida, que van a seguir secretando pequeñas cantidades de Ac y son las que nos van a defender INICIALMENTE si el

microorganismo entra por segunda vez. Se aclara inicialmente pues son las células de memoria las que se activan para producir grandes cantidades de Ac si entra el mismo microorganismo por 2, 3, o 4 vez. 2. Mientras tanto, los que NO alcanzan a quitarle el Ag a la célula dendrítica folicular, no reciben señalización de sobrevivencia y se activan las proteínas pro-apoptóticas. Por ahí hay unos macrófagos que van fagocitando y limpiando esa zona, por consiguiente esa zona se llamará Zona de luz. Muchos han muerto, los han limpiado y al microscopio veo más claro. Hablábamos al inicio que una célula dendrítica activa un LT virgen, que unos pocos de esos tiene BCL6 expresado lo que los diferencia en LT foliculares, que hay expresión de CxCR5 → intenta entrar al folículo. ¿Qué sucede cuando interacciona con el LB que ya se había activado y salió? Recordar que el CD40 era expresado por el LB, pero el LT también necesita su señalización, para lo que utiliza el ICOS como receptor y el ligando del ICOS que lo expresa el LB. Ese ICOS le sirve al LT folicular para que exprese más BCL6 y al hacerlo, favorece que se venga al folículo a hacer la reacción del centro germinal. Hay una característica del LT folicular que no la tiene ninguna otra célula → Tiene la facultad de producir citoquinas como si fuera una Th2 porque secreta IL-4, como si fuera Th1 porque secreta IF-gamma y como Th17 porque IL-21, es decir, ella no es ni Th1 o Th2 ni nada, tiene la capacidad de secretar citoquinas de todas ellas (Th1, Th2, Th17). Preg: ¿Mientras el LB está haciendo la endocitosis del BCR, el LT folicular qué está haciendo? Recordar que un LT solo se activa cuando le hacen presentación antigénica, entonces si no hay presentación el se queda en el folículo esperando. Esta imágen muestra la importancia de la célula dendrítica folicular. Tiene receptores para IgG, para el complemento, CD40, etc. ¿Para qué? Los Ag pueden estar en complejos con moléculas del complemento o con inmunoglobulinas y lo que hace el LB es robarselo.

La maduración de la lo que se ve en la imágen: antes, lo agarraba pero no mejoró esa unión, ahora si hablando hay una unir ese Ag.

afinidad consiste, geométricamente, en Arriba → Así era la unión Ac-Epítope era fuerte. Abajo → Con las mutaciones lo agarra muy bien, químicamente atracción mayor, una fuerza mayor para

El cambio de isotipo consiste en: Sabemos que cuando el Ag es timo independiente, sólo se va a producir IgM. En la primera cooperación BT sólo se puede producir IgM, hay participación de CD40 y CD40 ligando; se induce a que se produzcan células plasmáticas de corta vida que también ayuden en la reacción de centro germinal y en la maduración de la afinidad. En la reacción de centro germinal se van a producir las otras: IgG, IgA e IgE. Hay un interrogante, pero algunos autores dicen que es el IF-gamma el que induce a que se produzca isotipos y subclases de IgG (IgG1, IgG3), que la IL-4 induce a que se produzca IgE e IgG4. El TGF-beta, APRIL, BAFF

y otras citoquinas pueden inducir a que se produzca IgA. Esto sucede en la segunda cooperación BT. ¿Como ocurre un cambio se de isotipo? Al principio del tema habíamos visto que se corta la región variable pero la constante NO se toca. A partir del cambio de isotipo, se corta el ADN en el sitio donde necesite que se acerque la región constante, entonces si se necesita cambiar de IgM a IgE, cortan el resto haciendo un bucle y de ahí en adelante, cuando ya se hace cambio de isotipo, ese LB siempre va a producir ese isotipo. Ya no se necesita que tenga todas las posibilidades si no la que se requiere → Respuesta especializada. OJO: No es específica, la especificidad la mide la maduración de la afinidad; la especialización la mide el cambio de isotipo. La selección de afinidad que ocurre cuando el linfocito mide su afinidad. Primero se da la primera cooperación BT → Entrada a la rección del centro germinal. CD40 es muy importante porque induce la activación de una enzima llamada AID (deaminasa inducida por activación), la cual participa en la maduración de la afinidad y el cambio de isotipo. Miren que es como un consecutivo: Si no hay CD40 → no hay AID, si no hay AID → No hay maduración de afinidad ni cambio de isotipo, y sin esto no hay Reacción del centro germinal. AID es el que ayuda a hacer las hipermutaciones, aunque era una misma clona, cada uno dijo cuál BCR iba a hacer. Aquel que le quita el epítope a la célula dendrítica y se lo presenta al LT folicular es el seleccionado por afinidad, los otros se eliminan. - Si se mejora la afinidad, lo que se cambia en el Ac es su reconocimiento por el Ag, más NO su función efectora; la función efectora del Ac la cumple la región constante y lo que estamos cambiando es la región variable, por eso no cambia. - Si yo cambio un BCR por un Ac secretado, lo que cambia es su función efectora, pues el BCR no opsoniza, no neutraliza, etc. Pero su reconocimiento al Ag no cambia. - Cuando se cambia el isotipo, lo que se cambia es la función efectora. La unión con el Ag no se cambia porque la región variable es la misma, aquí lo que se cambió fue la región constante que es la que se encarga de la opsonización, neutralización y la unión al complemento. La célula plasmática que se formó en la reacción de centro germinal o inicialmente llamado plasmoblasto, se ubica en la médula ósea. La células estromales de la médula ósea van a secretar unas quemoquinas que van a hacer que ellas lleguen aquí. El CXCR4 va a hacer que ella camine desde el centro germinal hasta la médula ósea que es rica en CXCL12 (secretado por las células estromales). Ellos se ubican allí y los eosinófilos que viven allí le van a secretar pequeñas cantidades de APRIL e IL-6 para que ella esté secretando pequeñas cantidades de Ac, de tal forma que si entra nuevamente el mismo microorganismo, mientras se activen las células de memoria, ella está neutralizando u opsonizando. Las que responden en forma rápida, eficaz y muy fuerte son las células de memoria, las plasmáticas defienden “por poquitos” y son las que permiten tener los títulos. CLASE 8. Continuación PRUEBAS DE LABORATORIO. 16 ABRIL/2018 Vimos el principio de que estas pruebas inmunológicas están basadas en la interacción de un Ag con un Ac, bajo el principio de que la determinación de la presencia de un Ac específico para un Ag indica exposición previa a un Ag, sea natural (infección) o artificial (vacunas). PERO puede surgir otro concepto → Yo puedo tener Ac específicos para un Ag sin haberme expuesto a ese Ag por medio de inmunización pasiva, es decir, transferencia de Ac. Entonces, un niño que nace de madre VIH (+) o SIDA y como médico quiero saber si el niño está infectado. Se le toma Ac contra VIH en la sangre del niño y le dan positivos. Con esto NO digo que

tiene VIH aunque tenga Ac específicos, ya que es un neonato y durante la gestación hay transferencia transplacentaria de Ac, por ende esos Ac contra VIH probablemente vienen de la madre y no puedo confirmar Dx. Lo mismo un niño en lactancia, quiero saber si como a la mamá le dio dengue, al niño también le dió; le tomo Ac específicos para dengue y le dan positivos, ¿son del niño? Puede que sí, puede que no, en la lactancia hay transferencia de Ac. Esta situación hay que tenerla en cuenta para hacer un Dx donde determine Ac. Si es una persona que se ha inmunizado pasivamente para un Ag esos Ac van a dar positivos. Otro ejemplo es una persona que llega a consulta diciendo que la mordió un perro ardilla o murciélago. Inmediatamente decimos que le puede dar rabia y el manejo para esto es darle sueros hiperinmunes transfiriendo Ac (después del suero también le aplican la vacuna). Después de eso usted le va a hacer Dx para confirmar que esté infectado, los Ac le dan positivos pero estos Ac son los que le puso el médico → No se puede confirmar Dx. Cuando se hace una inmunización pasiva previa, los Ac que se van a detectar pueden provenir de esa vía de inmunización. Una persona adulta como nosotros que no ha recibido inmunización pasiva por transferencia, ya no nos lactan (y si lo hicieran ya no nos pasan Ac jaja), aquí la presencia de Ac va a indicar la exposición a un Ag. Habíamos hablado de PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN. Que las íbamos a ver en dos enfoques clínicos → Hemoclasificación (ya visto) y el test de Coombs. TEST DE COOMBS: Existe un reactivo llamado Reactivo de Coombs: Son Ac anti Ac. Generalmente son Ac IgG anti IgG. Anti significa la especificidad, a qué Ag se une; como ejemplos tenemos: Antitoxo (Ac que se une específicamente a Ag’s de toxo), los famosos: ANA’s: Ac antinucleares (Ac que yo produzco que se unen a Ag del núcleo → Autoinmunidad) otro son los AntiTPO, es decir, Ac que se unen contra la enzima TPO, la cual producimos nosotros y por ende es autoinmunidad. Entonces, el suero de Coombs tiene Ac IgG contra IgG, ya que la IgG es una proteína y puede inducir una respuesta inmune. Desde la clínica se puede usar dentro de varios contextos y es la utilidad de este test es lo importante que hay que recordar. Hay dos formas de realizarlo: test de coombs directo e indirecto. Test de Coombs directo → Lo puedo solicitar bajo la sospecha clínica de: 1. Anemia hemolítica autoinmune: Paciente anémico que tiene niveles de hierro bien, come bien (carne, vegetales), no tiene sangrado pero los eritrocitos están bajitos → sospecho de una enfermedad autoinmune, donde el sistema inmune está destruyendo los eritrocitos. Para confirmarlo solicito un test de coombs directo. 2. Anemia hemolítica inducida por fármacos: Paciente anémico con toda la característica clínica de la anemia (cansado, pálido, somnoliento, fatigado) → hay ciertos fármacos que son adsorbidos por los eritrocitos, se producen Ac contra el fármaco y los eritrocitos serían los que se destruyen. Esta se trata muy fácil: cambio el fármaco y ya. 3. Reacción hemolítica tardía en personas que han sido poli transfundidas: Una transfusión previa puede inducir una sensibilización sobre todo en aquellas personas que son Rh (-). Recordar que paciente Rh (-) sólo puede ser transfundido por un tipo de sangre (-), ya que siendo negativo, si le transfieren positiva, el sistema produce Ac contra el Rh, y si en una segunda transfusión le vuelven a dar Rh (+) → lisis de eritrocitos. Si el paciente es Rh (+) se le puede dar cualquiera de las dos. 4. Enfermedad hemolítica del recién nacido → Eritroblastosis fetal o Enfermedad de la incompatibilidad del Rh: Bajo este panorama clínico, si quiero confirmar lo que hago es solicitar un Coombs directo. Como médico se puede sospechar fácilmente una

eritroblastosis fetal → La mamá tiene un Rh (-), sólo eso. El día que en consulta haya una madre o una mujer que quiere quedar en embarazo, lo primero es hemoclasificar y si es Rh (-) se sospecha que esa mujer puede hacer una eritroblastosis fetal y toma las medidas necesarias, OJO, a la mujer no le pasa nada pero al feto sí. El primer cuidado es embarazarse de un man Rh (-), pues ahí el riesgo es nulo. *Mamá Rh - + Papá Rh - y sale hijo con eritroblastosis: hijo del lechero. En todo caso, sirve para evaluar Hemólisis. Hay que entender por qué es producida la hemólisis → Los eritrocitos son lisados cuando a ellos se le unen Ac. Esos Ac pueden ser de la clase IgG, y estas pueden llevarlo a la lisis de 3 formas: 1. Activan el complemento → Se ensambla el complemento y en la vía final se induce el MAC (complejo de ataque a la membrana). 2. Hacen ADCC → Una NK reconoce el eritrocito y le produce lisis por liberación de gran enzimas y/o perforinas. Menos frecuente. 3. Son moléculas opsonizantes → Viene un macrófago, reconoce el eritrocito y lo fagocita. Más frecuente. Osea que cuando Ac IgG se unen a los eritrocitos, el eritrocito puede ser destruído por lisis por complemento, lisis por células NK o lisis por macrófagos → Ese es el mecanismo de daño del eritrocito, pero en todo caso está siendo destruído por la unión de Ac. El test de Coombs directo es muy sencillo: Se tiene el paciente con anemia, se sospecha de anemia por hemólisis (inducida ya sea por fármacos, autoinmune, transfusión o eritroblastosis fetal). Lo que se infiere es que a los eritrocitos de esa persona se le han unido Ac y que esos Ac inducen lisis, la más frecuente es fagocitosis en el bazo. Para comprobar que esa hemólisis sí es porque en esos eritrocitos hay Acs unidos, se le toma una muestra de sangre y le agrega el reactivo de Coombs (Acs que se unen a Acs): -

-

Si esos eritrocitos están sensibilizados (quiere decir que tienen Acs unidos) los Acs del reactivo se van a unir a los Acs del eritrocito y los van a aglutinar formando grumos, entonces la sedimentación se da mucho más rápido y eso es lo que se va a observar → Prueba de Coombs positiva. Si estos eritrocitos no tuvieran estos Acs unidos, los Acs del reactivo no se unirían a nada y los eritrocitos quedarían libres, disueltos y la aglutinación no se daría, por lo tanto la sedimentación no se daría tan rápidamente.

Lo importante aquí es reconocer qué utilidad clínica se le puede dar a la prueba de Coombs (bajo qué sospecha clínica). Test de Coombs indirecto → se puede utilizar en: 1. Detección de Ac en el suero de mujeres Rh (-) → El día que atienda a una mujer que quiera quedar en embarazo o esté en embarazo y sea Rh (-). A esta mujer se le busca Ac para que en el embarazo a su feto no le induzca ningún daño. 2. En el suero de pacientes que han sido politransfundidos y que han generado una respuesta inmune frente a esos eritrocitos. Recuerden: Si una persona produce Ac’s contra los Ags eritrocitarios, los puede lisar. Eritrocito de una mujer Rh (-), independientemente del grupo (A-, B-, AB-, O-). Si es negativo no tiene el antígeno Rh (una proteína) y eso se logra por genética. Entonces, esta mujer tiene muchos antígenos: el A, B, AB o fantasma O, pero carece de Rh. Si esta mujer por algún factor se expone a sangre que tenga el Rh, es decir Rh (+), el sistema inmune de la mujer va a reconocer al

Rh y como resultado se genera la siguiente cascada: Una respuesta inmune adaptativa → activación de LT CD4+ (porque el Rh es una proteína) → Se activan LB → reacción del centro germinal → Formación de LB de memoria y células plasmáticas de vida larga para el Rh (esas células de memoria y plasmáticas hicieron cambio de isotipo y maduración de afinidad), en conclusión → esa mujer produce anti Rh y esos cuerpos quedan en circulación por las células plasmáticas de vida larga. A la mujer no le va a pasar nada ya que estos Ac son para un Ag que ella no produce. Hay varias formas para exponerse a eritrocitos que tengan anti Rh: 1. Que la hayan transfundido, lo que aplica también para hombres. Entonces, una mujer o hombre Rh (–) que haya recibido una transfusión sanguínea. 2. Una exposición por gestación: mujer Rh (–) que se embarace de hombre Rh (+), su feto tiene un Rh (+), quiere decir que se expone y la mujer queda sensibilizada. Entonces si usted como médico atiende a una mujer con Rh (–), le preocuparía que ese feto que ella va a desarrollar tenga Rh (+). Como estos son Acs IgG (que son transplacentarias) atraviesan la placenta, entran a circulación fetal, inducen lisis de eritrocitos y el niño nace anémico con todo el daño subsecuente que se pueda generar. Por eso a una mujer Rh (–), para su descarte se le solicita un test de Coombs. OJO: No creerle al paciente si dice que nunca se ha embarazado, hay mujeres que se embarazan y sabiéndolo o sin saberlo tienen abortos y sabemos que en ese punto se pueden sensibilizar. Por eso de todas formas se les solicita la prueba. Lo otro es que a una persona, sea hombre o mujer con Rh (–) que necesite una transfusión, se le solicita un test de Coombs indirecto porque usted tiene la sospecha de que esa persona puede tener Acs anti Rh. El test de Coombs indirecto es sencillo de realizar: Le tomo la muestra de suero al paciente (porque en el suero están los Ac) para saber si tiene Ac que puedan destruir eritrocitos. El suero del paciente se mezcla con eritrocitos que se saben son Rh (+). Si el paciente tiene Acs anti Rh se van a unir, después de esto se agrega reactivo de Coombs y lo mismo: -

Si el paciente no tiene esos Acs porque no se ha sensibilizado, no sucede esa unión AgAc, no se une el reactivo a los Acs y por lo tanto no habría aglutinación. Recordar: las pruebas de Coombs son pruebas de aglutinación.

Las pruebas anteriores son PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN DIRECTAS, porque en todo caso la partícula que aglutinan son eritrocitos. También hay aglutinaciones indirectas y para eso se utilizan perlas de látex, que son unos polímeros que producen los laboratorios y lo que hacen es pegarles ya sea Ag o Acs a esas perlas de látex, recordando el principio → Si mi reactivo tiene Ag se va a determinar Acs y si tiene Acs, se van a determinar Ag. Entonces estas PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN INDIRECTAS tienen una amplia utilidad, por ejemplo: 1. Antiestreptolisina O: Aquí voy a buscar un Ac específico para la estreptolisina que es un Ag presente en bacterias beta-hemolíticas. Entonces por medio de esta prueba se puede hacer dx de bacterias. 2. Proteína C reactiva: Puedo buscar concentración de pCr y aquí utilizaría un reactivo que tenga Ac que se una a la proteína C reactiva. 3. Factor reumatoideo: Es un Ac asociado a diferentes enfermedades autoinmunes, entre ellas: artritis, lupus y otros síndromes autoinmunes. 4. Pruebas de látex para Criptococo neoformans: Sobre todo en pacientes donde hay sospecha de inmunosupresión, que se utiliza como vía de evaluación de la inmunosupresión o infección por oportunistas como el criptococo. 5. Infecciones virales como rotavirus.

Estas pruebas de aglutinación indirectas tienen una gran utilidad para hacer dx de moléculas o dx infeccioso. Tiene ventajas y desventajas. Ventajas: No son costosas, requieren poco equipo, son fáciles de realizar y de interpretar. Desventaja: Su gran desventaja es que son subjetivas, dependen del ojo del observador. Todo depende de la experticia de quien analice la prueba para confirmar si realmente hay o no una prueba positiva. PRUEBAS DE FLOCULACIÓN: El principio de floculación es muy similar a la aglutinación. -VDRL: Es una prueba que se utiliza para el dx de sífilis. Sífilis es una bacteria espiroqueta que se adquiere por vía venérea y causa infecciones tanto agudas como crónicas. El agente infeccioso no se elimina completamente del cuerpo, queda para el resto de la vida. ●

Diferencia entre una infección aguda y crónica: el tiempo, pero se enmarca sobre todo si el agente se elimina totalmente del cuerpo o no.

Es una prueba no treponémica, es decir que no se determina la presencia del treponema, del agente infeccioso. Se determina la presencia de Acs heterólogos, estos son aquellos que reaccionan frente a un ag similar para el cual tienen especificidad, en este caso se usan unos ags que son una mezcla de ciertas moléculas: cardiolipina, lecitina y colesterol que vienen del corazón de buey, que tienen estructura similar a los ags del treponema, estos se van a unir a Acs que están presentes en la sangre de la persona que sospechamos que tiene sífilis. Si en la muestra están presentes los Acs = Floculación. Si no hay floculación, no hay una reacción como de aglutinación. La evaluación se hace a través de microscopía. VDRL (+) = Prueba reactiva, porque no es confirmatoria. estás determinando la presencia de acs más no del agente como tal. Después se solicita la prueba confirmatoria: INMUNOFLUORESCENCIA: donde se utilizan acs marcados que se unen al microorganismo y su observación se hace por microscopio. En un VDRL se detecta además el título de dilución hasta el cual fue positiva la prueba. Se hacen diluciones seriadas y se reporta hasta que punto hubo una floculación positiva, el número de la dilución hasta la cual dio positivo. Se tiene la muestra del paciente, se empieza a diluir de forma secuencial, tengo 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 y 1:64. La importancia de la interpretación de estas diluciones, entre más diluido y positivo, indica mayor títulos de Acs, es decir, entre más diluida la muestra y todavía Acs presentes significa que en la muestra original había una gran cantidad de Acs. Tenemos la muestra del paciente con Acs positivos, indica que en algún momento esta persona se expuso al treponema. Tuvo sífilis hace 5 años, se la trataron y respondió al tto, sigue teniendo Acs presentes debido a que la células plasmáticas de vida larga siguen produciendo acs por el resto de la vida. Pero entonces, si esta persona no se ha vuelto a exponer, los títulos van a ser bajos, lo que significa que a las primeras diluciones se van a consumir aglutinando y como son tan poquitos hacen muy buenas aglutinaciones pero llega el punto y muy pronto que se acaba las aglutinaciones. Hasta 1:8 da positivo. Dicen que los títulos superiores a 1:8 significa que hay muchos títulos, que salen aparte de las células plasmáticas de vida larga de los linfocitos T de memoria que se han activado por

exposiciones, y si se activan los LB de memoria se generan plasmáticas de vida corta que producen Acs, que se suman a los Acs que vienen de plasmáticas de vida larga. En conclusión la interpretación de los títulos sirve para evaluar si la infección es actual o pasada. PRUEBA DE DX RÁPIDO DE SÍFILIS: RPR. Es una prueba de aglutinación, hay un kit similar al de hemoclasificación, se aplican gotas de sangre de la persona sospechosa y se le agregan los reactivos y de acuerdo al número de aglutinaciones observables se habla de: Reactivo, reactivo débil o no reactivo. Al ser una prueba de aglutinación, la interpretación es visual muy similar a la forma de evaluar la aglutinación por hemoclasificación. PRUEBAS DE DX QUE UTILIZAN AGS Y ACS MARCADOS. Ac marcado: Ac específico para un epítope de un ag, que se produce en el laboratorio y se le une una molécula que puede ser enzimas, fluorocromos o isótopos radioactivos. Estos acs son usados como reactivos y cuando se unen a un ag para el cual son específicos, la evaluación de esta interacción ag-ac, se hace estimulando esta molécula. Enzima→ se induce reacción Fluorocromo o isótopo radioactivo→ Induce emisión de luz.

enzimática.

La molécula se unen a una parte del Ac que no altera la unión con el ag. Hay fluorocromos de muchos colores, verdes, naranjas, amarillos. El microscopio de fluorescencia es el que estimula al fluorocromo a fluorescer. Hay dos tipos: -Fluorescencia directa: Se tiene la muestra en la cual se sospecha está la presencia de un Ag, puede ser por biopsias, autopsias...A esa muestra se le agregan los Acs específicos para el Ag que se está sospechando y esos Acs están marcados con fluorocromos. Después del contacto de éstos con la muestra, si está el Ag específico, pues los Acs se van a unir y esa placa o pozo es llevada al microscopio y allí se evalúa la emisión de luz fluorescente, si la hay indica la presencia del Ag en la muestra. Si no hay fluorescencia los acs son desechados. Ej: maceración de cerebros de perros infectados con virus de la rabia. -Fluorescencia indirecta: Se utilizan 2 acs. Se tienen células o tejidos con Ags específicos y se quieren evaluar la presencia de Acs. Ej: En el lab se tienen las células o tejidos con ags de virus de la rabia, se le agrega la muestra del paciente, si la persona tiene esos Acs específicos, se van a unir al Ag y se le va a agregar un segundo Ac que está marcado con un fluorocromo, que a su vez se une al primer Ac y se hace la evaluación por microscopia. Ventajas -Elevada sensibilidad→ Capacidad de evaluar pequeñas concentraciones del analito. -Se puede diseñar para una gran cantidad de ags o anticuerpos. -No son muy costosas. Desventajas -Son cualitativas, entonces se vuelven subjetivas, por ende habrán falsos positivos o falsos negativos.

PRUEBA DE ELISA Generalmente pensamos en VIH. Esta prueba es útil para el Dx de agentes infecciosos y no infecciosos. Es una técnica de laboratorio. Se usa para: Dengue, chikv, zika, VIH, ver toxoplasma en mujeres gestantes, en laboratorio en investigación si se quiere determinar la concentración de citoquinas proinflamatorias en sangre. Sirve para detectar la presencia de Ags o Acs. Es de las pruebas de mayor utilidad. Se usan Acs marcados con una enzima, la evaluación es colorimétrica. Las placas son de 96 pozos y se utilizan por filas, aparece el concepto de controles + y - , que son para comparar. Para que se pueda indicar que la prueba fue +, el análisis tiene que dar similar al control + y se usa el control negativo para determinar cómo es el resultado si no hay reacción. Asuman cada fila como una muestra proveniente de un paciente distinto, la prueba es positiva si hay cambio en el color. Dx de virus Zika, para evaluarlo buscaron Acs contra Zika en pacientes que consultaron a la clínica. Paciente 1→ Tiene Acs contra el virus Zika porque en las distintas diluciones, al menos una fue igual al control + Paciente 2→ Hay reacción pero no es comparable con el control + Paciente 3→ Si Paciente 4→ No Paciente 5→ Si. Es el que más títulos de Acs tiene, porque a mayor dilución, mayor presencia de Acs. Paciente 6→ Si Paciente 7→ Si, tiene los títulos más bajitos de todos. Paciente 8→ Si Pero el ELISA no se interpreta así, ya que es cuantitativa, se hace a través de un espectrofotómetro que mide densidades ópticas. Tipos de ELISA: -ELISA DIRECTO: ya no se usa. - ELISA INDIRECTO: Determinación de Acs específicos para un Ag. Cada laboratorio que hace determinaciones, tiene las placas ya sensibilizadas, o sea que son ag específicas, es decir, si el lab quiere hacer Dx de VIH, debe conseguir placas sensibilizadas con Ags de VIH. Al pozo se le agrega la muestra y si en ésta hay Acs contra el Ag se van a unir y después se agrega el Ac marcado con la enzima y el Ac es específico para el Ac, entonces son Anti-Anticuerpos y después se le agrega al pozo el sustrato para la enzima, como son peroxidasas, se le agrega peróxido, si hay una reacción positiva cambia el color del pozo, por eso se le llama una reacción colorimétrica.

-ELISA DE CAPTURA O SÁNDWICH: Se usa para evaluar la presencia de un Ag específico. Se quiere evaluar la concentración de Proteína C reactiva en un paciente infartado. En el laboratorio tengo unas placas cubiertas con Acs específicos para proteína C reactiva, agrego muestras del paciente, si si está la proteína, habrá unión con los Acs. Después agrego otro Ac específico para la proteína C reactiva, este segundo anticuerpo viene marcado con la enzima y lo mismo, se adiciona el sustrato para esa enzima y si hubo reacción positiva = cambio en la coloración, si no hay proteína C reactiva no se da la interacción y al agregar el segundo ac, tampoco se va a unir. Entre cada paso hay unos lavados y en cada uno, se elimina lo que no se unió.