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• Samiri Samiri

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INMUNOLOGIA INTRODUCCIÓN Los seres superiores están defendiendo constantemente su integridad biológica frente a agresiones, esencialmente externas. De no ser así, morirían como consecuencia de tumores e infecciones de bacterias, virus, hongos, etc. Para que estos fenómenos de defensa se lleven a cabo, los organismos disponen de un conjunto de elementos especiales, conocido como sistema inmune. La capacidad de defensa se adquiere antes de nacer y se madura y consolida en los primeros años de la vida fuera del seno materno. La inmunología es la ciencia que estudia los procesos moleculares y celulares implicados en la defensa de la integridad biológica del organismo a través de la identificación de las sustancias propias y detección de las sustancias extrañas y su destrucción. En cada organismo, los mecanismos de defensa son muy diversos y heterogéneos, aunque siempre existe una actuación integrada de todos ellos. Los mecanismos de defensa pueden ser de tipo inespecífico y específico. Los mecanismos inespecíficos están constituidos por las barreras naturales, tales como la piel, mucosas y otros que están protegiendo constantemente al individúo de contagios externos(Figura 1.). Otros elementos naturales de actuación son la lisozima de la saliva, lágrimas y secreciones nasales que tienen capacidad de romper la unión de azúcares en las paredes bacterianas, lo que puede inducir su lisis. También entre estos mecanismos inespecíificos se encuentra la respuesta inmune inespecífica que están constituidos fundamentalmente por los componentes de la respuesta inmune especifica. Entendemos por respuesta inmune todos aquellos eventos desarrollados por el sistema inmune al objeto de defender la integridad biológica del individuo frente a cualquier agresión (estimulo antigénico). La respuesta inmune puede ser, pues, de tipo inespecífica o innata y específica La respuesta inespecífica o innata es la primera barrera defensiva del organismo y no requiere sensibilización previa. La respuesta específica o adquirida se desarrolla solo frente a la sustancia extraña que indujo su iniciación y en ella participan prioritariamente los linfocitos y las sustancias liberadas por los mismos, anticuerpos y citocinas (Figura 1.). El sistema inmune se encuentra ubicado en los órganos linfoides y en su acción participan una serie de células, células inmunocompetentes, y moléculas, entre las que destacan las inmunoglobulinas, linfocinas y otras (Figura1.). Las distintas células inmunocompetentes se recogen en la Figura 1.4. Todas las sustancias que tienen la capacidad de estimular al sistema inmune, se conocen como antígenos y las partes del mismo que tienen capacidad inmunógena, se conocen como determinantes antígénicos o epítopos. Generalmente el sistema inmune responde de forma unitaria, por lo que la división en respuesta inespecífica y específica es más teórica que real. Lo que sí ocurre es que, dependiendo de las circunstancias, en unos casos predomina una u otra de estas modalidades de respuesta inmune. La Inmunología es una ciencia de gran amplitud que comprende diversas áreas: Inmunogenética, Inmunobiología, Inmunopatología o Inmunología clínica, Inmunofarmacología, Inmunología veterinaria, etc., todas ellas en continua expansión. RESPUESTA INMUNE INESPECIFICA. La finalidad de la respuesta inmune tanto inespecífica como especifica es la defensa de la integridad biológica del individuo, actuando como un sistema de mantenimiento de la homeostasis del organismo, al igual que lo hace, por ejemplo, el sistema respiratorio o el sistema nervioso. La respuesta inespecífica forma parte de los mecanismos inespecíficos de defensa y representa el primer sistema defensivo del organismo y es de especial significación frente a la protección del mismo ante infecciones y cáncer. Las células que mediatizan esta respuesta

inespecífica, son los PMN neutrófilos, macrófagos y células NK que son células que se caracterizan por activarse de forma inmediata siempre que cualquier sustancia extraña penetra en el organismo, como, por ejemplo ocurre, tras una herida. En este caso todas estas células se movilizan a dicho foco, reconocen y toman contacto con la sustancia extraña, que destruyen mediante el proceso de fagocitosis y citotoxiciadad natural (Tabla 1.1). En este tipo de respuesta participa también el complemento (C´), que está formado por una gran variedad de proteínas que se encuentran en el plasma. Los distintos componentes del complemento interactúan en un determinado orden para ejercer su acción en la defensa del organismo. Probablemente la fagocitosis es el principal elemento que actúa en este tipo de respuesta. La fagocitosis se lleva a cabo en varias fases, aproximación, fagocitosis y lisis (Figura 1. ). Los mecanismos de defensa inespecíficos aportan un buen sistema de protección. Sin embargo, en muchas ocasiones no son suficientes para defender eficazmente al organismo, pero por fortuna éste dispone de la respuesta inmune específica. RESPUESTA INMUNE ESPECIFICA La respuesta inmune específica se caracteriza porque es efectiva ante aquellos antígenos frente a los cuales se ha iniciado y desarrollado. Este tipo de respuesta es mediada por linfocitos y otras células como células dendríticas, macrófagos etc. Los linfocitos son de dos tipos: linfocitos B y linfocitos T. Los linfocitos T, a su vez, pueden ser linfocitos T colaboradores (Th), linfocitos T citotóxicos (Tc) y por algunos autores también se han propuesto los linfocitos T supresoresres/reguladores (Ts). La respuesta inmune específica, se considera que puede ser de dos tipos: humoral y celular. Aunque la separación de ambos tipos de respuesta es mas de tipo didáctico que real, en general se considera que cuando los elementos implicados son los linfocitos B, se trata de una respuesta tipo humoral mientras que cuando participan prioritariamente los linfocitos T tanto colaboradores (Th) como citotóxicos (Tc), se trata de una respuesta tipo celular. Reconocimiento del antígeno Para que se inicie la respuesta inmune específica, se requiere el reconocimiento del antígeno por parte de los linfocitos y subsiguiente activación de los mismos. Los linfocitos B reconocen el antígeno mediante inmunoglobulinas de membrana (mIg) mientras que los linfocitos T lo reconocen mediante el receptor de linfocitos T (TCR) (Figura 1.). La activación de los linfocitos B conduce a la síntesis de Inmunoglobulinas por los mismos mientras que cuando lo que se activan son los linfocitos Th o Tc su función prioritaria es la producción de linfocinas o la de lisar células respectivamente. Las inmunoglobulinas (Ig) son glicoproteínas formadas, al menos, por cuatro cadenas mientras que el receptor de los linfocitos T (TCR) es también una glicoproteína pero de solo dos cadenas (Figura 1.). Ambos tipos de moléculas tienen la propiedad de reconocer y unirse al antígeno. Cada inmunoglobulina tiene la propiedad de unirse específicamente al antígeno que indujo su formación. Respuesta inmune celular La respuesta inmune de tipo celular cubre una importante función como mecanismo inmunológico de defensa, actuando principalmente frente a virus, así como evitando la aparición y desarrollo de células tumorales. En ella participan esencialmente los linfocitos T colaboradores (Th) y citotóxicos (Tc). Presentación del antígeno Para que los linfocitos T, tal como se ha dicho anteriormente puedan reconocer el antígeno, éste debe ser debidamente presentado. Esta función se realiza por las células presentadoras de antígeno (APC) y sus determinantes antigénicos son expuestos en la superficie de estas células en el seno de las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) (Figura 1.8).

Las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad son glicoproteínas presentes en las membranas de la mayoría las células nucleadas, entre las que se encuentran las células inmunocompetentes. Estas moléculas son esencialmente de dos tipos, tipo I y tipo II y tienen entre otras funciones las de presentar el antígeno a los linfocitos así como participar en el proceso de maduración de los linfocitos T en el timo (Figura 1.9). Las células presentadoras de antígeno (APC) tienen como misión captar, procesar proteolíticamente en el interior de estas células y después presentar el antígeno a los linfocitos T conjuntamente con las moléculas de histocompatibilidad. Interacción celular Para que la activación del Ag se lleve a cabo se requiere que previamente se halla producido la interacción entre las células presentadoras y las respondedoras. Este fenómeno se lleva a cabo prioritariamente por las moléculas de adhesión que son un grupo muy heterogéneo de sustancias que se encuentran en la superficie de las células presentadoras y respondedoras y que como se ha dicho hacen posible la adherencia entre ellas y en consecuencia permiten la unión entre el receptor de las células T y el complejo MHC-Ag de la APC (Figura 1.). De igual manera, estas moléculas participan en todo tipo de interacción celular tanto en la respuesta celular como humoral. Inmunomoduladores de la respuesta inmune La respuesta inmune es regulada por moléculas conocidas como linfocinas, que son sustancias producidas por linfocitos en respuesta a una gran variedad de estímulos y que son capaces de regular el funcionamiento de otras células del sistema inmune. Las linfocinas actúan como señal complementaria facilitando la activación, proliferación y diferenciación de los linfocitos y en general de todas las células implicadas en la respuesta inmune (Figura 1.11). Activación Th y Tc Aunque existen excepciones, la separación de las funciones de los linfocitos Th y Tc viene dada por el origen de los antígenos que reconocen. Los linfocitos Tc reconocen a los antígenos presentados en superficie por moléculas MHC de clase I (Figura 1. ), mientras que los linfocitos Th interaccionan con el antígeno en el contexto de moléculas MHC de clase II. Asociados a las dos cadenas polipeptídicas polimórficas que constituyen el TCR se encuentra un grupo de moléculas monomórficas de membrana llamado colectivamente CD3, formando así el complejo TCR/CD3 y que sabemos que es imprescindible para la transmisión de la señal del reconocimiento antigénico al interior celular. En consecuencia se desencadena una cascada de reacciones bioquímicas en el citoplasma de la célula T, dando así lugar al proceso de activación, proliferación y diferenciación celular. Estos mecanismos implican la participación de una serie de sustancias intracitoplasmáticas, conocidas como segundos mensajeros. Como consecuencia de estos eventos se producirá finalamente la la transcripción de los genes implicados en la síntesis de la proteína y factor implicado en una determinada función. La activación de las células Th es el núcleo central de la respuesta celular que a su vez actúa sobre, macrófagos, células NK y linfocitos Tc que adquieren entonces la capacidad de lisar las células que portan el antígeno que indujo su activación. Respuesta inmune humoral La ausencia de este tipo de respuesta deja al individuo tan indefenso frente a toda clase de gérmenes patógenos y otras agresiones, que es incompatible con la vida si no se instaura a tiempo un tratamiento adecuado. En la respuesta inmune humoral intervienen los linfocitos B, que como se ha dicho anteriormente reconocen al antígeno a través de las inmunoglobulinas de membrana. Sin embargo este estímulo no es suficiente para que se inicie y desarrolle la respuesta inmune humoral. Para ello es necesario que los linfocitos B, además del estímulo antigénico, reciban el estímulo de ciertas citocinas (Figura 1.13) producidas por los linfocitos T colaboradores. Sólo cuando confluyen estos estímulos, el antigénico y el mediado por las citocinas, se produce la activación, proliferación y diferenciación de los linfocitos B hasta la formación de células memoria y células plasmáticas productoras de inmunoglobulinas, que serán el elemento efector

final de la respuesta humoral. En la Figura 1.14 se muestra un esquema con una visión general de la respuesta inmune. Características respuesta inmune específica La respuesta inmune especifica se caracteriza por ser de carácter clonal, reconocer unos antígenos y no otros (especificidad), desarrollar memoria y ser autoregulable. Especificidad. Se sabe que cada antígeno estimula solo a aquel linfocito o grupo de linfocitos que han desarrollado y en consecuencia poseen en su membrana los receptores capaces de reconocer y unirse específicamente a él. Estos receptores, tal como se ha indicado anteriormente, son las inmunoglobulinas de superficie cuando se trata de linfocitos B o el TCR cuando se trata de linfocitos T. Clonalidad. Cuando un linfocito o grupo de linfocitos es activado, este prolifera y se diferencia en múltiples células derivadas, todas ellas con idénticos receptores de superficie. Se dice entonces que todas estas células constituyen lo que se denomina clon celular. Tanto la especificidad como la clonalidad de la respuesta inmune fueron originariamente definidos en los años cincuenta por varios inmunólogos entre los que se encontraba Burnet y se conoció después por la teoría de selección clonal de Burnet. Esta teoría decía que cada antígeno estimulará a aquel linfocito o grupo de linfocitos que poseen en su membrana receptores capaces de reconocer y unirse específicamente a él y que como consecuencia se producía su proliferación y diferenciación en células con las mismas características de reconocimiento que los linfocitos originales (Figura 1.15). Este carácter clona, le confiere a este tipo de respuesta el carácter de gran eficiencia en cuanto que cada individuo solo pone en marcha aquellos elementos, celulares y moleculares, que le son necesarios para una determinada acción. Memoria Inmunológica. Otra característica importante de este tipo de repuesta es que el organismo mantiene memoria de un estímulo a otro cuando son de la misma índole. Eso se debe a la permanencia de linfocitos sensibilizados de larga vida después de un estímulo antigénico. Autorregulación. Este tipo de respuesta dispone de mecanismos internos de control, de tal forma que la intensidad de la misma se regula por acción de diversos tipos de moléculas entre las que destacan las inmunoglobulinas y sobre todo las citocinas. En la Figura 1.16 se recogen las distintas fases de la respuesta inmune. Respuesta primaria y secundaria. Cuando por primera vez un antígeno se pone en contacto con el organismo, se produce una respuesta inmune que se denomina respuesta primaria. Por el contrario, cuando al cabo de un tiempo el mismo antígeno vuelve a activar al sistema inmune, se produce una respuesta que denominamos respuesta secundaria o adaptativa (Figura 1.). Ambas respuestas son, cualitativa y cuantitativamente, diferentes. Las diferencias esenciales son:

1. En la respuesta primaria los niveles máximos de inmunoglobulinas se alcanzan tras un largo período de latencia después del estímulo antigénico, mientras que en la respuesta secundaria se alcanza más rápidamente.

2. La respuesta primaria es de menor intensidad que la secundaria. 3. La respuesta primaria predomina la IgM, mientras que en la secundaria predomina la IgG.

4. La respuesta secundaria, al predominar en ella la IgG de vida media más larga que la IgM, es más permanente en su acción que la primera. Ello se debe a que cuando un antígeno activa por primera vez a los linfocitos B, éstos necesitan tiempo para diferenciarse en las células plasmáticas responsables de la síntesis de inmunoglobulinas, mientras que cuando se trata de la respuesta secundaria, gracias a la permanencia de las células memoria, se alcanza mucho antes el nivel de células plasmáticas. Resulta así, que la respuesta será de menos intensidad que tras un segundo estímulo en que

ha aumentado el número de linfocitos sensibles gracias a la permanencia de células memoria con receptores idóneos para tal antígeno. Estos sistemas funcionan de forma secuencial, enviándose información entre ellos para una eficaz eliminación del patógeno. Así, una vez que entra el patógeno superando las barreras físico-químicas, se pone en funcionamiento el sistema inmune innato, con células y factores solubles que van a tratar de eliminarlos. Tras la activación de este sistema, es únicamente en los vertebrados donde puede ponerse en marcha el sistema inmune específico adaptativo, aunque coordinado con los componentes del sistema inmune innato. Como ejemplos de esta cooperación se encuentran el papel desempeñado por los macrófagos como células presentadoras de antígeno a los linfocitos T; los anticuerpos IgM e IgG son capaces de activar el sistema del complemento por la vía clásica; o la citotoxicidad dependiente de anticuerpo por parte de las células natural killer. CONCEPTO DE ANTIGENO Y HAPTENO Se entiende por antígeno toda sustancia con capacidad para generar una respuesta inmune, esto es que posee capacidad de ser reconocida como extraña por el sistema inmune. Sabemos que prácticamente cualquier tipo de molécula biológica, incluyendo azúcares, lípidos, hormonas, metabolitos intermediarios, carbohidratos complejos, fosfolípidos, ácidos nucléicos y proteínas pueden ser antígenos. Si se quiere producir anticuerpos contra pequeñas moléculas, éstas deben unirse antes de la inmunización a una macromolécula. En este sistema, la molécula pequeña recibe el nombre de determinantes antígenos (Figura 1. ). Los anticuerpos frente a un antígeno se unen a sus grupos determinantes. Esta capacidad de unión antígeno-anticuerpo (Ag-Ac), es la característica más importante y común de todas las inmunoglobulinas. Esta unión es no covalente y débil, de tal forma que la reacción es reversible, encontrándose los antígenos y los anticuerpos libres en equilibrio dinámico con los unidos. En general los antígenos son de mayor tamaño que la zona que participa en la unión con el anticuerpo, de modo que un anticuerpo solo se une a una zona muy restringida del antígeno. A esta zona del antígeno que participa en la unión con el anticuerpo se le denomina epitopo o determinante antigénico. La mayoría de los antígenos poseen múltiples epítopos, con lo que pueden unir múltiples anticuerpos a la vez siempre que los epítopos estén suficientemente alejados entre ellos para que no existan interferencias estéricas que lo impidan Clásicamente se llamaba antígeno a toda molécula capaz de generar un anticuerpo. En la actualidad sin embargo, se considera antígeno a cualquier molécula capaz de unirse a un anticuerpo independientemente de que pueda, por si sola, generarlo. Aquellas moléculas que además sean capaces de generar un anticuerpo se les denomina inmunogenas. En este sentido existen moléculas demasiado pequeñas que llamamos haptenos, que para generar anticuerpos necesitan ir unidas a moléculas mas grandes llamadas carrier. Una vez que se han generado de este modo, anticuerpos contra el hapteno, éste puede unirse a los anticuerpos. El hapteno es por tanto, una molécula antigénica pero no inmunógena. Tras la unión antígeno-anticuerpo (Ag-Ac), las sustancias extrañas (o antígenos) son neutralizadas y posteriormente destruidas por las inmunoglobulinas a través de mecanismos, que pueden ser diferentes según el tipo de inmunoglobulina que participa. INMUNOPATOLOGÍA Hay multitud de casos en los que los sistemas de defensa son en sí causa de enfermedad. Esto es, por ejemplo, lo que ocurre cuando el individuo reacciona incluso frente a sustancias que en principio son inocuas, como es el polen de plantas, etc. Entonces se habla de reacciones de hipersensibilidad (Figura 1. ) . En otros casos, por razones todavía no muy bien conocidas, el sistema inmune reacciona frente a componentes propios, que destruye, ocasionando graves trastornos, o incluso la muerte. Se trata de enfermedades por autoinmunidad, que pueden presentarse frente al sistema nervioso central, frente a casi todas las glándulas endocrinas, frente a componentes musculares, etc. También a veces, las células encargadas de la defensa inmune, comienzan a proliferar en grandes cantidades, llegando a producir auténticos cánceres de células libres como son las leucemias, que incluso en tan sólo meses pueden terminar con la vida del individuo.

La Inmunología, en consecuencia, debe estudiar no sólo el papel que tiene el sistema inmune en el mantenimiento de la salud sino también en la génesis y evolución de la enfermedad. APORTACIONES DE LA INMUNOLOGIA La Inmunología ha contribuido de forma notoria al progreso de la ciencia actual, primero por aportaciones sobre bases empíricas y después sobre fundamentos sólidos, fruto del intenso esfuerzo desplegado en el estudio de los mecanismos de actuación del sistema inmune (Tabla 1.2) Durante la fase empírica que podemos considerar anterior al comienzo del presente siglo, la inmunología ofreció la solución a uno de los grandes problemas que ha azotado a la humanidad, las pandemias. Ello fue posible gracias a Jenner quien a finales del siglo XVIII y a Pasteur quien a su vez a finales del siglo XIX, prepararon las vacunas de la viruela y de la rabia respectivamente. Posteriormente se desarrollarían, entre otras, las vacunas antitifoidea (1898), anticólera (1892) y antidiftérica (1913). Después, en lo que podríamos denominar fase científica, y debido a un mejor conocimiento de las bases biológicas y celulares del sistema inmune, la inmunología se ha desarrollado ampliamente, siendo una de las ciencias que más ha evolucionado en los últimos años. Hasta aproximadamente los años sesenta los aspectos inmunológicos conocidos aparecían, en el contexto de la Microbiología, como el sistema capaz de defender al organismo frente a las infecciones. Desde entonces, los continuos avances en el conocimiento de los mecanismos implicados en la respuesta inmune han dotado a esta disciplina de un sólido cuerpo de conocimientos. A este desarrollo han contribuido de manera especial la puesta a punto de técnicas modernas, tales como los cultivos celulares, obtención de líneas celulares puras e híbridos celulares, posibilidad de obtener animales trangénicos, disponibilidad de las técnicas de biología molecular tales como clonaje de genes, técnica de PCR, el uso del láser y la microscopía electrónica. En consecuencia, hoy día la Inmunología posee su propia contextura interna y puede ser firmemente considerada como ciencia independiente al tiempo que hace posible el desarrollo de otras áreas gracias a la aplicación de reactivos y técnicas puramente inmunológicas, adquiriendo así una amplia proyección en Medicina, Veterinaria, Biología, Bioquímica, Agronomía y Farmacia. En resumen, la Inmunología ha influido en las siguientes áreas:

1. Enfermedades infecciosas. Haciendo posible la profilaxis de la mayoría de las enfermedades infecciosas mediante un progresivo y espectacular perfeccionamiento de las técnicas de vacunoterapia durante el presente siglo. Es de destacar a modo de ejemplo el descenso drástico que se observan en las tasas de morbilidad declaradas por poliomielitis, por sarampión o que la viruela ha sido completamente erradicada.

2. Transfusiones sanguíneas. La Inmunología hizo posible el descubrimiento de los grupos sanguíneos y los anticuerpos séricos frente a los mismos, gracias a lo cual se pueden realizar las transfusiones sanguíneas sin riesgo para el enfermo.

3. Trasplantes de órganos. Haciendo posible la prevención del rechazo de muchos de los órganos trasplantados. Eso se ha debido a un perfeccionamiento de las técnicas quirúrgicas pero, sobre todo, al descubrimiento de los antígenos responsables del rechazo (antígenos de histocompatibilidad) y a un mejor conocimiento de los mecanismos inmunológicos responsables del rechazo del trasplante, que están permitiendo la utilización de modernas terapias inmunosupresoras de gran efectividad en la actualidad. Los avances más recientes indican que pronto será posible el trasplante de animales al hombre (xenotrasplante) con lo cual se podrá dar solución a la escasez de donaciones de órganos.

4. Oncología. En donde la inmunología ha permitido un mejor conocimiento de la interrelación célula cancerosa-huésped. Estos conocimientos ya comienzan a repercutir en una mayor sobrevivencia de ciertos pacientes cancerosos y existen fundadas esperanzas de que en un futuro inmediato la inmunología pueda contribuir aún más, ofreciendo nuevas vías de solución a esta enfermedad. El descubrimiento reciente, por un lado, de oncogenes responsables de la malignización celular y, por otro, de los mediadores químicos de la respuesta inmune, entre los que cabe destacar las linfocinas y los interferones, ofrecen una amplia esperanza en la terapia de muchos cánceres y de sus metástasis. En la actualidad se encuentran en vía de ensayo varias vacunas terapéuticas con resultados verdaderamente alentadores.

5. Inmunopatología. En donde el conocimiento del sistema funcionales, ha hecho posible conocer la etiología y patogenia de una gran variedad de enfermedades surgidas por alteración del propio sistema inmune, tales como inmunodeficiencias, alergias, autoenfermedades, etc. Sin embargo, quedan problemas pendientes sin resolver, como es el reto que actualmente tiene planteada la Inmunología con el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), de una extraordinaria capacidad expansiva y alta mortalidad, y frente al cual no se dispone de un remedio eficaz que elimine de manera definitiva el virus HIV.

6. Métodos analíticos. Una gran variedad de métodos analíticos de gran precisión y sensibilidad se han desarrollado gracias a los conocimientos inmunológicos. Entre estas técnicas las más importantes que se pueden destacar son la inmunoelectroforesis, radio-inmunoensayo, hemaglutinación, etc. Hoy se puede considerar que, por ejemplo, la endocrinología moderna se ha podido desarrollar gracias a la aparición de un método, el radioinmunoensayo, capaz de medir los niveles de las distintas hormonas.

7. Biotecnología, industria y farmacia. Esto está siendo realmente posible gracias al extraordinario grado de cooperación existente entre los inmunólogos y científicos dedicados a la bioquímica, biología molecular, genética y farmacia, cuyos métodos como, por ejemplo, la tecnología del DNA recombinante, hibridaciones celulares, etc., están permitiendo la obtención de manera industrial, de sustancias y factores de gran interés farmacológico, entre los que podemos destacar, como mas sobresaliente, los anticuerpos monoclonales (AcMo).

8. Otras aportaciones. Además de lo indicado anteriormente, la inmunología ha contribuido a la solución de otros muchos problemas. Citemos, por ejemplo, la prevención de la eritroblastosis fetal en casos de incompatibilidad Rh entre la madre y el feto. Otra sensible y reciente aportación de la inmunología ha sido el esclarecimiento de la etiología de múltiples enfermedades, al descubrir una estrecha relación entre el padecimiento de las mismas y ciertos factores genéticos relacionados con el control del sistema inmune. También la inmunología ha aportado conocimientos y técnicas de gran utilidad en la Medicina Legal, alguna de cuyas áreas, como por ejemplo la identificación, se benefició ampliamente después del descubrimiento de los grupos sanguíneos y también durante la última década, gracias al descubrimiento de los antígenos de histocompatibilidad. La inmunología es una ciencia que actualmente se encuentra en pleno desarrollo, por lo que es de suponer que en el futuro siga aportando nuevos conocimientos para la solución de muchos de los problemas que tiene planteados la medicina y biología. En la Tabla 1.3 se expone una lista de los Premios Nobel concedidos a investigadores en el campo de la inmunología.

Celula inmunocompetentes NTRODUCCION La acción del sistema inmune es posible gracias a la participación e interrelación de diferentes poblaciones celulares, conocidas como células inmunocompetentes. Estas células son fundamentalmente los linfocitos T y B, las células NK, células dendríticas, macrófagos y polimorfonucleares (tabla 2.1). Las células inmunocompetentes se encuentran distribuidas por toda la economía, como epitelios y mucosas, pero su concentración es máxima en los ganglios linfáticos y bazo. En estos tejidos se dan las condiciones óptimas para su estimulación antigénica gracias a que a ellos afluyen con facilidad las sustancias extrañas (antígenos) a través de los vasos linfáticos y es posible la interrelación celular, óptima para que se pueda iniciar y desarrollar la respuesta inmune. En este capítulo estudiaremos las características morfológicas y fenotípicas más importantes de estas células inmunocompetentes, así como también el sistema linfático, especialmente la estructura funcional de los ganglios linfáticos, bazo y timo. LINFOCITOS T Y B Los linfocitos son células de tamaño pequeño con un núcleo muy voluminoso y provistas de una membrana citoplasmática de especial importancia en la regulación de su funcionalidad. Estas células se dividen en linfocitos T y linfocitos B. Ambos tipos de linfocitos al igual que todas las células sanguíneas derivan de una célula progenitora pluripotencial que en el feto se encuentra en el hígado y después del nacimiento en la médula ósea. A esta célula precursora común se le denomina CFU-LH o Unidad formadora de colonias linfoides y hematopoyéticas (Figura 2.). Posteriormente esta célula se diferenciará para dar lugar, por un lado, a la célula madre hematopoyética pluripotencial (CFU-GMEM) para las series eritrocítica, granulocítico-macrofágica y megacariocítica. Por otro lado, dará lugar a una célula progenitora unipotencial (CFU-L), específica para la serie linfoide. Cada una de estas células progenitoras continuará diferenciándose hacia otras células inmaduras, originándose así las CFU-E (precursor eritrocítico), CFU-GM (precursor mielomonocítico) y CFU-Meg (precursor megacariocítico) a partir de la célula precursora hematopoyética. De la célula madre linfoidea derivarán dos células precursoras, CFU-T y CFU-B, que tras un proceso de maduración, conocido como linfopoyesis, originarán los linfocitos T y B respectivamente. En sangre periférica la proporción de linfocitos T es aproximadamente de un 70% mientras que la proporción de linfocitos B es de un 15%. En la Figura 2. se muestra una imagen de microscopía electrónica de barrido de un linfocito B (a) y un linfocito T (b) donde pueden observarse las diferencias en su superficie. Existen otras células de estirpe linfoide que no presentan características de linfocitos T ni B, denominadas células NK que poseen actividad citotóxica y secretora de ciertas citocinas. Linfopoyesis Las células pluripotentes, en las aves, se diferencian y transforman en células también inmaduras, que emigran, unas hacia el timo y otras hacia la bolsa de Fabricio, donde se transforman y maduran en linfocitos T o timo dependiente y linfocitos B o bolsa dependiente, respectivamente (figura 2.3). En los mamíferos, y entre ellos el hombre, estos procesos se realizan en el timo (linfocitos T) y en la propia médula ósea (linfocitos B) (Figura 2. ).

Veamos a continuación los aspectos más importantes de la linfopoyesis en el timo y en la bolsa de Fabricio o en los órganos equivalentes a la misma en los mamíferos. Linfopoyesis T El timo es un órgano situado en la parte superior del mediastino anterior, donde maduran los linfocitos T. El timo presenta su máximo desarrollo en el feto y en el niño,mientras que a partir de los 10-12 años comienza un proceso atrófico y degenerativo con gran invasión grasa, de tal forma que en el adulto sólo quedan residuos del mismo (Figura 2. ). Los precursores de los linfocitos T, durante el proceso de maduración intratímica, reciben el nombre de timocitos. Durante esta fase mueren muchos timocitos, aproximadamente el 95 por 100 de ellos, debido a que se eliminan aquellos que reconocen los antígenos propios del organismo. El resto de las células abandonan el timo, vía sanguínea, como linfocitos T maduros. Estos linfocitos colonizan los órganos linfoideos secundarios, situándose en la zona paracortical de los ganglios linfáticos y vainas paracorticales linfocíticas del bazo. Se han identificado algunos factores de transcripción que son imprescindibles para la diferenciación de los linfocitos a lo largo de la linfopoyesis. Entre estos destacan PU.1 e IKAROS que controlan el desarrollo de células T y B mientras que GATA-3 solo afecta el compromiso de las células T y E2A, EBF y Pax controlan el compromiso B. En el timo se han identificado células precursoras que poseen capacidad de generar células T, NK, B y células dendríticas del timo, y a lo largo de su diferenciación los precursores mas evolucionados van perdiendo paulatinamente la capacidad de generar células B, NK y células dendríticas en este orden. Durante el proceso de maduración intratímico, los timocitos adquieren una serie de moléculas nuevas en su superficie. Estas moléculas van apareciendo secuencialmente en los diferentes estadíos de maduración intratímica así como, en general, en todos los procesos de maduración y diferenciación hematopoyéticos. Se les denomina marcadores de diferenciación hematopoyética ya que son propios de los diferentes estadíos madurativos y pueden ser utilizados para definirlos. Se denominan con las siglas CD (cluster of differentiation o grupo de diferenciación) seguido de un número ordinal. La CFU-T, no expresa todavía en su superficie ninguno de los marcadores de los linfocitos T. Posteriormente estas células, ya en el timo, maduran distinguiéndose varios estados diferenciativos con la presencia de diferentes marcadores de superficie. Así en los timocitos inmaduros aparecen los marcadores CD7 y CD2, añadiéndose en un estadio posterior de maduración (timocito común), el marcador CD1. Ya en el timo va a ocurrir una especialización funcional, distinguiéndose dos subpoblaciones de timocitos maduros: Una es aquella que expresa en su superficie el marcador CD4 y que será el precursor inmediato de los linfocitos T colaboradores que aparecen en sangre periférica. La otra expresa en la superficie el marcador CD8 y dará origen a los linfocitos T citotóxicos/supresorescirculantes. En ambas subpoblaciones se pierde la expresión de la molécula CD1 (Figura 2.6). En la Tabla 2.2 se muestran algunos de los marcadores de diferenciación de las células linfoides de estirpe T. Los timocitos más inmaduros no expresan CD3, CD4 ni CD8, por lo que son conocidos como células triples negativas. A medida que van madurando, en estas células se produce la reorganización del TCR, la expresión del complejo CD3 y de las moléculas CD4 y CD8 conjuntamente (células dobles positivas), para después perder una u otra quedando bien como CD4-CD+ o como CD+CD8-. En el proceso de diferenciación de los timocitos a linfocitos maduros se destruyen gran número de células, tal como se ha indicado con anterioridad. Esto se debe a un proceso

de selección tímica que se realiza en dos fases y está condicionado por el grado de afinidad del TCR con las moléculas del MHC de las células epiteliales del timo. En una de las fases tanto los timocitos CD4-CD8+ como CD8-CD4+ se seleccionan positivamente, es decir, solo aquellos timocitos que poseen capacidad de reconocer las moléculas del MHC presentes en las células epiteliales del timo se van a diferenciar y crecer mientras que el resto mueren. Por el contrario, en el proceso de selección negativa se destruyen los timocitos que ahora poseen la capacidad de reconocer las moléculas del MHC presentes en el timo, con lo que se eliminan los clonos celulares autorreactivos. No se conoce bien cuando se efectúa uno u otro proceso, aunque todo parece indicar que se relaciona con la afinidad del TCR de los timocitos con las moléculas del MHC, de tal manera que cuando la afinidad es alta se efectuaría una selección negativa, mientras que cuando es baja la selección sería positiva. Mediante el empleo de ratones transgénicos para el TCR se han estudiado los factores responsables de la maduración de timocitos que conduce específicamente a linfocitos Tc maduros. Así, cuando el TCR del timocito reconoce moléculas del MHC clase I las células que preferentemente se desarrollan son los linfocitos Tc (CD8+), mientras que cuando lo que reconoce el TCR son moléculas MHC clase II las células que esencialmente se desarrollan son los linfocitos Th (CD4+). Linfopoyesis B. En las aves, la maduración de los linfocitos B se realiza en la bolsa de Fabricio, órgano linfoideo primario asociado a la cloaca y ausente en los mamíferos. En los mamíferos este proceso se realiza en la médula ósea. El proceso de diferenciación conducente a la formación de linfociots B es independiente de todo estímulo antigénico y se regula por factores presentes en el microambiente de los órganos linfoideos primarios. Durante el proceso de maduración de los linfocitos B, a partir de la célula progenitora (CFU-B), se distinguen varios estadios de diferenciaación, que incluyen las células pre-pre-B, las células pre-B, células B inmaduras y linfocitos B maduros (Figura 2.). En cada uno de estos estadíos de maduración las células expresan distintas moléculas en la superficie, utilizadas como marcadores de diferenciación. En la Tabla 2.3 se detallan los pesos moleculares y función de algunos marcadores de diferenciación de las células B, que están siendo utilizados para estudiar y clasificar las enfermedades originadas por alteraciones en el proceso de diferenciación linfocítica B (leucemias y linfomas). Ya en las células pre-B se detecta la presencia de cadena pesada m intracitoplasmática, adquiriéndose en la siguiente fase madurativa la capacidad de sintetizar las cadenas ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas IgM e IgD, detectables en la superficie celular. En consecuencia, la mayoría de los linfocitos B expresan estos dos tipos de inmunoglobulinas en su superficie. Posteriormente estos linfocitos, mediante un proceso de reordenamiento génico, se especializarán en la producción de una sola clase de las inmunoglobulinas IgG, IgA, IgM, IgD e IgE Figura 2.8). Linfocitos B Morfológicamente los linfocitos B son indistinguibles de los linfocitos T. Sin embargo, es posible establecer diferencias de tipo molecular que justifican su distinta función (Tabla 2.4). La característica más importante de los linfocitos B, por contribuir a su actividad funcional, es el hecho de que poseen inmunoglobulinas unidas a su membrana citoplasmática. Estas inmunoglobulinas son los receptores específicos para los antígenos, de tal forma que cuando se realiza la unión del antígeno a la inmunoglobulina de superficie, se va a producir la activación del linfocito B y su posterior transformación en célula plasmática. Éstas, son células

más grandes que los linfocitos, muy ricas en retículo endoplásmico, y especializadas en la síntesis y secreción de grandes cantidades de inmunoglobulinas (Figura 2.). También los linfocitos B poseen receptores para mitógenos y para el virus Epstein-Barr (EBV). Precisamente el tratamiento de linfocitos con EBV es el procedimiento de elección para la preparación de líneas celulares de tipo B (inmortalización de una población celular) de gran utilidad en la actualidad para el estudio de estas células. El receptor que utiliza el EBV en la superficie del linfocito B es el mismo receptor que la fracción C3d del sistema del complemento o CD21. Linfocitos T Los linfocitos T son una población celular muy heterogénea formada por, al menos, tres tipos diferentes de células. Entre los marcadores de diferenciación que definen los linfocitos cabe destacar el marcador CD2 que actúa de receptor para la molécula LFA-3, fundamentales para la unión entre el linfocito y la célula diana. En la Figura 2.2b se muestra una imagen de un linfocito T al microscopio electrónico de barrido. Los linfocitos T poseen receptores específicos para los antígenos. Estas moléculas conocidas como receptores T o TCR, han sido identificadas, utilizando tecnología de DNA recombinante, resultando ser altamente polimórficas y de gran importancia funcional. Estructuralmente constan de dos cadenas glicoproteícas ancladas en la membrana celular y unidas por puentes disulfuro y que estudiaremos en el capítulo 7. El receptor T se encuentra asociado estrechamente en la superficie celular al complejo molecular CD3. Tipos de linfocitos T No todos los linfocitos T son idénticos entre sí. Analizando las características funcionales de los linfocitos T, se observan al menos tres comportamientos muy distintos entre sí que deben basarse en diferencias moleculares y estructurales de estas células. Los tres tipos de linfocitos T funcionalmente distintos son:   

Células T de colaboración (T helper cells). Células T citotóxicas (T cytotoxic cells). Células T supresoras/reguladoras (T suppressor cells)

Células T de colaboración (Th) Esta subclase de linfocitos T participa de forma importante en la iniciación y desarrollo de la respuesta inmune, tanto humoral como celular, debido a su capacidad de producción de linfocinas, entre las que destacan la interleucina-2 (IL-2), la interleucina-4 (IL-4) y interferón gamma. Fenotípicamente, la característica esencial de esta subpoblación linfocitaria viene definida por la presencia de la molécula CD4 en la superficie celular. Esta molécula es de gran importancia funcional y también se utiliza para la cuantificación de esta subpoblación. Se distinguen dos poblaciones diferentes de estas células, Th1 y Th2. La Th1 produce IL-2 e intererón gamma mientras que la Th2 produce IL-4, 5y 6. Células T citotóxicas (Tc). Una vez activada esta subclase de linfocitos T, adquiere capacidad citotóxica, siendo, por tanto, los principales responsables de los fenómenos de citotoxicidad de la respuesta inmune célular. Estas células se caracterizan por expresar el marcador CD8 y, al igual que lo hacen los linfocitos Th, el complejo TCR-CD3 y otras moléculas importantes funcionalmente tales como CD2 y LFA-1. Células T supresoras (Ts) y/o reguladoras. Estos tipos de células poseen acción reguladora de la respuesta inmune. La regulación de la actividad del sistema inmune es de gran importancia en todo el comportamiento del mismo y,

sobre todo, en el desarrollo de tolerancia frente a los componentes propios del organismo. Estas células expresan en su membrana moléculas CD8 al igual que lo hacen los linfocitos T citotóxicos y su mecanismo de acción no solo no es muy bien conocido en la actualidad sino que también la propia presencia de estas células se está cuestionando. Células Asesinas Naturales (NK) En la década de los años 70 Herberman observó que los linfocitos obtenidos de individuos sanos eran capaces de destruir células tumorales sin que existiera sensibilización previa. La citotoxicidad mediada por estas células se denominó citotoxicidad natural, y a las células encargadas de desarrollar esta actividad se las denominó Natural Killer (NK) o células asesinas naturales. Estas células representan aproximadamente el 10% de las células mononucleares de sangre periférica y fenotípicamente no poseen marcadores ni de los linfocitos T ni de los linfocitos B y corresponden con un tercer tipo de células linfoides conocido anteriormente como linfocitos nulos o tercera población. Desde el punto de vista morfológico la mayoría de las células con actividad NK corresponden con los linfocitos granulares grandes (LGL) por su gran tamaño y la presencia de abundantes gránulos citoplasmáticos (Figura 2. 10). Aunque hoy se sabe que los linfocitos pequeños también pueden desarrollar esta acción citotóxica. Las células NK se definen como linfocitos que no reorganizan los genes de las inmunoglobulinas ni tampoco los del TCR y que, por tanto, no expresan sus productos así como tampoco el complejo CD3 completo. Por el contrario, expresan en su superficie las moléculas CD16 y CD56 y para su acción citolítica no requieren la expresión de moléculas del MHC en la célula diana. Estas células son responsables de la citotoxicidad celulomediada dependiente de anticuerpos (ADCC), es decir, destruyen células con antígenos extraños en su superficie frente a los que se han producido anticuerpos. Las células NK contribuyen a la defensa frente a células infectadas por virus, bacterias, hongos y parásitos. Pero la principal actividad de la célula NK es su capacidad de actuar frente al crecimiento de células tumorales impidiendo su expansión y la formación de metástasis. El síndrome de Shediack-Higashi es una deficiencia selectiva de actividad NK y cursa con una alta incidencia de tumores. Las células NK derivan de células hematopoyéticas stem cell presentes en el hígado fetal o en médula ósea del adulto. Su proceso de maduración se efectúa fuera del timo en órganos linfoides periféricos, desconociéndose los procesos requeridos para que esta diferenciación se produzca, y el órgano donde se desarrolla. Esto explica que no se afecten sustancialmente los niveles de células NK en animales atímicos y en inmunodeficiencia severa combinada observada tanto en animales como el hombre. También las células NK podrían derivar directamente, de las células doble negativas que sabemos son también CD16 positivas que se encuentran en el timo y que son precursoras de las células T. Células mielomonocíticas Las células inmunocompetentes de estirpe mielomonocítica son los macrófagos y los granulocitos. Ambos tipos de células proceden de un precursor común, la CFU-GM o Unidad formadora de colonias granulocítico-macrofágicas, de la médula ósea. Esta célula progenitora, mediante un proceso de diferenciación, dará lugar a dos series de células sanguíneas: a) la serie mieloide, cuyo último eslabón madurativo son los granulocitos, y b) la serie monocítica, cuyo elemento diferenciativo final lo constituyen los macrófagos. El proceso de diferenciación y maduración de las células monocíticas en médula ósea se denomina monopoyesis y al proceso de formación y maduración de las células mieloides se le conoce como mielopoyesis,

Monopoyesis Durante el proceso de maduración de los macrófagos, a partir de la célula progenitora (CFUGM) de médula ósea, se distinguen varios estadíos diferenciativos, que incluyen los monoblastos, promonocitos, monocitos y macrófagos. En cada uno de estos estadíos de maduración las células expresan distintas moléculas en su superficie, cuya función, en la mayoría de los casos, es aún desconocida (Figura 2.11). Las mejor caracterizadas son las moléculas CD16 y CD11b que, como ya hemos indicado, actúan como receptores para el extremo Fc de la IgG y para la fracción C3bi del complemento respectivamente. En la Tabla 2.5 se detallan algunas características de estos marcadores, muchos de los cuales están siendo utilizados para clasificar las leucemias de estirpe monocítica. Mielopoyesis El proceso de diferenciación de los granulocitos en médula ósea incluye varios estadíos madurativos: mieloblasto, promielocito, mielocito, metamielocito y granulocito. En cada uno de estos eslabones diferenciativos las células mieloides expresan distintas moléculas de superficie. Los marcadores de diferenciación son compartidos, en su mayoría, con células de la serie monocítica ya que, como hemos indicado anteriormente, ambas estirpes celulares tienen un origen común. En la Tabla 2.6 se resumen algunas de las características diferenciales de los macrófagos y granulocitos. Se observa que los granulocitos carecen de la propiedad de sintetizar interleucina 1 y además no poseen la molécula CD14 ni los antígenos de histocompatibilidad clase II. Macrófagos La denominación de macrófagos engloba, en realidad, a una serie de células con características ligeramente distintas y con funciones similares, distribuidas en varios lugares del organismo. Así, los macrófagos van a recibir diferentes denominaciones según los diferentes tejidos donde se encuentren (Tabla 2.7). A este conjunto de células hísticas, se le da la denominación genérica de sistema retículo endotelial o sistema mononuclear fagocítico. Los macrófagos son células grandes con un solo núcleo, un aparato de Golgi muy desarrollado, gran cantidad de lisosomas y muy ricos en enzimas de diferentes tipos, entre los que destacan proteasas, peroxidasas y lipasas. Estas células poseen, además de la capacidad fagocítica ya indicada, capacidad de adherencia a los tejidos, al vidrio y al plástico, así como una gran movilidad en estas superficies (quimiotaxis). Los macrófagos tienen una vida media de varios meses. Poseen también gran actividad metabólica, sobre todo en lo que se refiere a síntesis de proteínas, incluso cuando se encuentran en reposo. En la Figura 2.12 se muestra una imagen al microscopio electronico de barrido correspondiente a un macrófago. Los macrófagos poseen en su membrana una serie de receptores de gran importancia funcional, como son los receptores para la fracción Fc de la IgG, receptores para las fracciones C3bi y C3b del complemento que se conocen como CD-11b y CD-35 y los receptores para interleucinas e interferones, todos ellos, de gran interés en la iniciación de la respuesta inmune. Granulocitos El otro grupo de células, los granulocitos neutrófilos, se caracterizan por poseer una vida muy corta (vida media de menos de 48 horas) por lo que se encuentran en continua renovación, para mantener los niveles sanguíneos. Son células de gran tamaño cuya característica más llamativa es la segmentación del núcleo en varios lóbulos. Se les denomina también polimorfonucleares neutrófilos. En la sangre estas células se encuentran en período de

tránsito hacia los tejidos, donde esencialmente ejercen sus funciones, al igual que ocurre con los otros tipos de polimorfonucleares : eosinófilos y basófilos (Figura 2. ). Otras células Además de las células tratadas hasta el momento, hay otras células que pueden intervenir como células inmunocompetentes. Estas son los eosinófilos, basófilos, células cebadas, células dendríticas y células de Langerham. Las células dendríticas, son de gran importancia en la presentación antigénica a los linfocitos y se encuentran en los ganglios linfáticos y en el bazo. Fenotípicamente éstas células se caracterizan por poseer en su membrana una gran densidad de moléculas de histocompatibilidad de clase II. En la Figura 2.se muestra una imagen de microscopia electrónica de barrido correspondiente a una célula dendrítica. Las células de Langerham de la epidermis, cuya característica morfológica más llamativa es la presencia de gránulos en raqueta de tenis denominados gránulos de Birbeck, también son ricas en antígenos MHC-clase II. Su misión es captar y transportar los antígenos extraños hasta los ganglios linfáticos de la proximidad, a través de los vasos linfáticos. Durante su paso por los vasos linfáticos estas células se adaptan y cambian de morfología denominándoselas células a vela. Una vez en el ganglio linfático las células a vela se introducen en la paracorteza que es el área de las células T, se interdigitan y presentan el antígeno a los linfocitos T. Ahora estas células presentadoras reciben la denominación de células interdigitadas reticulares por su particular disposición en los ganglios. En la ANTIGENOS DE DIFERENCIACION En la membrana plasmática de los linfocitos se han podido identificar múltiples moléculas, gracias al empleo de la tecnología de los anticuerpos monoclonales (AcMo). A estos antígenos y se les denominan antígenos de diferenciación. La celebración periódica de talleres (workshops) internacionales, donde los investigadores remiten sus AcMo para la realización de estudios multicéntricos, ha propiciado la progresiva sistematización de la abundante información obtenida. Estos se adscriben, según su especificidad, a grupos de diferenciación conocidos como CD ó clusters of differentiation, cada uno de los cuales incluye a todos aquellos AcMo que reconocen una misma molécula o, en casos excepcionales, un complejo molecular (ej. CD3). Los antígenos de diferenciación leucocitaria son estructuras cuya distribución no está necesariamente restringida a estos tipos celulares; no obstante, algunos pueden llegar a constituir, por su patrón selectivo de expresión, marcadores de diferentes propiedades de la célula, tales como: la estirpe de diferenciación a la que pertenece, su estadio madurativo, el estado de activación metabólica o, incluso, su especialización funcional. La secuencia habitual seguida en la caracterización de un antígeno de diferenciación se inicia con el análisis de su distribución celular y tisular, habitualmente realizado por técnicas de inmunofluorescencia, combinadas con la citrometría de flujo, y métodos inmunohistoquímicos. El aislamiento para su análisis electroforético se realiza por medio de técnicas de inmunoprecipitación, a partir de lisado de células radiomarcadas, que permiten valorar algunas de las principales características bioquímicas tales como su masa relativa (Mr), punto isoeléctrico (pI), la presencia de uniones covalentes intercatenarias, y determinadas modificaciones postraduccionales (ej. glicosilación, fosforilación), así como explorar el proceso de biosíntesis. DISTRIBUCION DE LAS CÉLULAS INMUNOCOMPETENTES. Las células que componen el sistema linfoide se agrupan formando órganos discretamente encapsulados o bien acúmulos difusos de tejido linfoide (Figura 2.15). Los órganos linfoides

contienen linfocitos en estado variable evolutivo y se clasifican en primarios (órganos centrales) y en secundarios (órganos periféricos). Los órganos linfoides primarios constituyen el principal origen de la linfopoyesis, es decir, donde los linfocitos se diferencian a partir de células madre linfoides y proliferan y maduran hacia células con capacidad efectora. En mamíferos, incluyendo al hombre, los linfocitos T son producidos en el timo, mientras que los linfocitos B se producen en el hígado fetal y en la médula ósea fetal y adulta. En los órganos linfoides primarios, los linfocitos adquieren sus receptores antigénicos específicos, y también aprenden a discriminar entre autoantígenos, que serán tolerados y antígenos extraños que serán atacados. Los órganos linfoides secundarios que incluyen bazo, ganglios linfáticos y MALT (mucosal associated lymphoid tissue) (amígdalas, placas de Peyer del intestino y cúmulos linfoides del tracto urogenital), proporcionan el medio en el que las células implicadas (macrófagos, células presentadoras de antígeno, linfocitos T y B) pueden interaccionar entre sí y con el antígeno. Órganos linfoides primarios Timo Es un órgano linfoepitelial de forma bilobulada situado en posición retroesternal sobre la cara anterior del pericardio. Deriva de un esbozo epitelial formado a partir de la tercera y cuarta bolsas faringeas, de aparición muy temprana en el embrión. En el hombre su estructura aparece completamente desarrollada en el tercer mes de gestación. El parénquima tímico está constituido por una malla de células epiteliales rellena de células linfoides (denominadas timocitos) y se organiza formando lobulillos tabicados por trabéculas conjuntivas. Dentro de cada lobulillo se puede distinguir una zona externa o corteza, que contiene la gran mayoría de los timocitos, y una zona interna o medular que es pobre en timocitos (Figura 2.). El estroma del timo está constituido fundamentalmente por la malla de células epiteliales que adoptan diferentes formas. En la médula se hallan también células dendríticas interdigitadas, derivadas de la médula ósea, que son células presentadoras de antígeno. En la unión corticomedular se hallan también macrófagos. En la médula existen, además, unas estructuras denominadas corpúsculos de Hassal formados por células epiteliales y macrófagos dispuestos de forma concéntrica. Las células epiteliales del timo, tanto de la corteza como de la médula, expresan una gran riqueza en moléculas del MHC clase II, imprescindibles para el reconocimiento de autoantígenos por los linfocitos T. Bursa de Fabricio y su equivalente en mamíferos En las aves, los linfocitos B se diferencian en la bolsa de Fabricio, órgano constituido por un segmento intestinal con pliegues dirigidos hacia una luz central. Estos pliegues se componen de tejido linfoide formando corteza y médula. En los mamíferos, islotes de tejido linfoide en el hígado fetal y en la médula ósea fetal y adulta se ocupan de la producción de linfocitos B. Organos linfoides secundarios Bazo Se trata de un órgano situado en el hipocondrio izquierdo, detrás del estómago y cerca del diafragma. Su superficie externa se compone de una cápsula fibrosa con algunas fibras musculares lisas y penetra profundamente en el parénquima del órgano. Básicamente, en el bazo se distingue la pulpa roja que es un reservorio vascular para hematíes y la pulpa blanca que contiene el tejido linfoide, el cual se dispone alrededor de una arteriola central, presentando áreas T y B. Las células T se disponen más próximas y alrededor de la arteriola central, mientras las células B se disponen exteriores a la misma. También son frecuentes las células reticulares dendríticas y macrófagos en el centro germinal, así como macrófagos

especializados en la zona marginal (área que rodea a los folículos linfoides) que junto a las células foliculares dendríticas de los folículos primarios (folículos no estimulados sin centro claro germinal) se ocupan de la presentación del antígeno al linfocito B (Figura 2.) .Ganglios linfáticos Conforman junto a los vasos linfáticos una compleja red corporal cuya función es filtrar los antígenos procedentes del espacio extracelular y la linfa durante su circulación desde la periferia hasta el ducto torácico. Los ganglios linfáticos, en el humano, son redondeados u ovoides y presentan un hilio donde los vasos sanguíneos entran y salen respectivamente. Básicamente, se distingue un área B denominada córtex, un área T denominada paracórtex y un área medular central (Figura 2.). El paracórtex, contiene linfocitos T y abundantes células presentadoras de antígeno (células interdigitantes o histiocitos de la zona T) quienes presentan abundantes antígenos MHC clase II en superficie. La zona medular presenta algunos cordones linfoides separados por espacios vasculares (senos medulares) que contienen la mayor parte de las células plasmáticas y los macrófagos sinusales de los ganglios linfáticos. El córtex contiene agregados de linfocitos B dispuestos formando folículos primarios y secundarios. Los folículos primarios son primordiales sin centro claro germinal (anteriores al estímulo antigénico) y los folículos secundarios poseen claros centros germinales (tras el estímulo antigénico). Estos últimos contienen además células presentadoras de antígeno y algunos macrófagos, linfocitos T, y células NK, quienes junto a los macrófagos sinusales parecen jugar un papel en el desarrollo de la respuesta de las células B, como su adquisición de memoria; esta parece ser la función primordial de los centros germinales (Figura 2.). Tejido linfoide asociado a mucosas (MALT) Acúmulos dispersos de tejido linfoide no encapsulado se observan frecuentemente en diversos órganos, particularmente en áreas submucosas gastrointestinales, respiratorias y urogenitales. Los elementos linfoides se encuentran formando agregados difusos u organizados formando folículos con centro claro germinal (Figura 2.20). En el tracto intestinal, se observan elementos linfoides difusos en la submucosa del órgano, y formando folículos linfoides con centro germinal en las denominadas placas de Peyer. El epitelio que reviste las placas de Peyer transporta el antígeno y en sentido inverso, la IgA secretora producida por las células plasmáticas muy abundantes en el epitelio (Figura 2.). En el hombre, además se encuentra abundante tejido linfoide con centros germinales en las amígdalas faríngeas y también en paredes bronquiales y a lo largo del tracto urogenital. CIRCULACIÓN LINFOCITARIA Una vez que los linfocitos B y T abandonan los órganos primarios, pasan al torrente circulatorio, a través del cual circulan por el organismo. A los tejidos llegan a través del torrente sanguíneo, siendo recogidas por los vasos periféricos del sistema linfático que las conduce a los distintos ganglios linfoideos, de donde pueden de nuevo volver a la sangre y a los diferentes tejidos o almacenarse en el bazo (Figura 2.22). En la Tabla 2.8 se recoge la proporción de leucocitos en sangre. De esta forma el contacto de los linfocitos con los antígenos se puede establecer en el organismo a nivel de los diferentes tejidos, sistema linfático, bazo y sangre, aunque es fundamentalmente a nivel de los ganglios y el bazo donde se puede desarrollar una respuesta inmune, ejerciendo una acción, bien local en ganglios y bazo, o bien general, dado que los elementos efectores (las inmunoglobulinas y linfocitos activados) pueden ser distribuidos

por toda la economía a través del sistema circulatorio y linfático. En la Figura 2. se representa un esquema de las circulaciones sanguínea y linfática con la distribución porcentual de los linfocitos en sangre, bazo y órganos linfáticos.

INMUNOGLOBULINAS NTRODUCCION A finales del siglo XIX, Von Behring observó que los sueros de animales que habían padecido difteria contenían sustancias que neutralizaban el efecto de la toxina diftérica. A estas sustancias, que se caracterizaban por ser termolábiles y no dializables, se les denominó anticuerpos, debido a su capacidad de reconcer a las toxinas bacterianas. En 1937 Tiselius descubre la electroforesis y aplica este nuevo método al fraccionamiento de proteínas plasmáticas, identificando así los anticuerpos como las proteínas del suero que se desplazan más lentamente. Esta fracción recibió el nombre de g-globulina, quedando así asociados temporalmente, los conceptos de anticuerpo y de g-globulina, como equivalentes (Figura 3.).Posteriormente, se comprueba que no todos los anticuerpos migran electroforéticamente con las g-globulinas, sino que muchos de ellos lo hacen con las a y b globulinas. Esto se observó analizando los niveles de las distintas fracciones de globulinas antes y después de la inmunización de animales con un antígeno(Figura 3. ). Se concluye entonces, que no todos los anticuerpos son gammaglobulinas, por lo que Hebermans propone el término de inmunoglobulinas para designar a todas las sustancias con capacidad de anticuerpo. Hoy se conocen cinco tipos de inmunoglobulinas: IgM, IgA, IgG, IgD e IgE, cada una de ellas con ciertas características distintas (Tabla 3.1). ESTRUCTURA DE LAS INMUNOGLOBULINAS Las inmunoglobulinas son glicoproteínas que, según ya indicó Porter en 1959, están formadas por cadenas polipeptídicas agrupadas, dependiendo del tipo de inmunoglobulina, en una o varias unidades estructurales básicas. Unidad estructural básica Cada unidad está compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas unidas entre sí por puentes disulfuro y otras uniones de tipo no covalente (Figura 3.). Para su estudio se han empleado diferentes procedimientos. Por ejemplo, tras la rotura de los puentes disulfuro por sustancias de carácter reductor, como el mercaptoetanol, se individualizan las cuatro cadenas polipeptídicas y éstos atendiendo a su tamaño, son de dos tipos: de bajo peso molecular (aproximadadamente 22 KD) y de alto peso molecular (50-70 KD, dependiendo del tipo de Ig). Los polipéptidos de bajo peso molecular reciben el nombre de cadenas ligeras o cadenas L (Light) y las de alto peso molecular, cadenas pesadas o cadenas H (Heavy) (Tabla 3.2). Dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas se agrupan de tal manera que existe una proximidad espacial entre los cuatro extremos amínicos de las cadenas ligeras y pesadas por una parte, y entre los dos extremos carboxílicos de las cadenas pesadas por otra. Esta estructura básica de las inmunoglobulinas puede ser fraccionada mediante la utilización de enzimas (papaína, pepsina, etc.), como fue efectuado por Porter en 1959, obteniéndose diferentes tipos de fragmentos (Figura 3 ). El tratamiento con papaína produce la ruptura específica de las cadenas H, en el espacio comprendido entre el puente disulfuro que las une entre sí y los que las unen a las cadenas ligeras. Se obtienen tres fragmentos: uno denominado Fc, que determina la actividad biológica, contiene el alotipo y determina la clase y subclase de cadena pesada y dos denominados cada uno de ellos Fab, que contienen el idiotipo y es por donde la molécula se une al antígeno.

Cadenas Ligeras. Hay dos tipos de cadenas ligeras, estructuralmente diferentes, que se conocen como cadenas ligeras tipo kappa (k) y cadenas ligeras tipo lambda (l). La familia de genes que codifica para la cadena ligera k se localiza en el cromosoma 2 y los loci de los genes homólogos que codifican para la cadena l, en el cromosoma 22. En cada molécula de inmunoglobulina las dos cadenas ligeras son del mismo tipo, k o bien l, pero nunca existe una de cada tipo en la misma inmunoglobulina. Las cadenas ligeras están formadas por unos 200 aminoácidos con la particularidad de que existen dos puentes disulfuro que unen grupos de unos cincuenta aminoácidos. Concretamente la IgG1 posee 214 aminoácidos y su estructura secundaria y terciaria están determinadas por dos puentes disulfuro intracatenarios que unen los aminoácidos 23 con el 88 y 134 con el 193, (Figura 3.) . A su vez, estas cadenas ligeras tienen otro puente disulfuro intercatenario, por el cual cada una de ellas se une a una cadena pesada para constituir la unidad básica de las inmunoglobulinas. Este puente se encuentra en el último aminoácido (214) de la parte carboxílica para el tipo k y en el penúltimo para el tipo l. Cadenas pesadas. Estas cadenas poseen unos cuatrocientos aminoácidos estableciéndose entre algunos de ellos puentes disulfuro (intracatenarios) que asocian unos 60 aminoácidos y que condicionan la estructura secundaria del polipéptido. Por ejemplo, las cadenas pesadas de la IgG1 poseen 440 aminoácidos y los puentes disulfuro unen el aminoácido 22 con el 96, el 144 con el 200, el 261 con el 321 y el 367 con el 425. Estas dos cadenas pesadas están unidas la una a la otra por puentes disulfuro intercatenarios, ya indicados anteriormente, y que pueden ser de uno a cinco dependiendo del tipo de inmunoglobulina. En estas cadenas pesadas, y a nivel de los puentes disulfuro intercatenarios, hay una zona de unos 15 aminoácidos, de gran flexibilidad debido a su estructura y constituye lo que se denomina zona bisagra por donde se deforma la molécula de inmunoglobulina cuando se produce la unión con el antígeno, facilitándose así su acoplamiento con éste. Los loci de los genes que codifican para la cadena pesada se localizan en el brazo largo del cromosoma 14. Parte variable y constante de las cadenas ligeras y pesadas. Estructuralmente, las cadenas ligeras poseen dos partes: una corresponde al extremo carboxílico que diferencia las cadenas ligeras en dos tiposk y l, y constituye la parte constante de las cadenas ligeras (CL). La otra corresponde al extremo amínico, que es muy variable y constituye la parte variable de las cadenas ligeras (VL) y corresponde a la zona de interacción con el antígeno. Las partes constante y variable son prácticamente de igual tamaño en las cadenas ligeras. También las cadenas pesadas poseen una parte variable y otra constante. Aproximadamente el tercio del extremo amínico de estas cadenas se caracteriza por ser estructuralmente muy variable, por lo que se conoce como parte variable de las cadenas pesadas (VH). La estructura de este fragmento, al igual que en las cadenas ligeras, depende del tipo de antígeno que reconoce, dado que este extremo también participa en la unión de la inmunoglobulina con el antígeno. Por el contrario, aproximadamente los dos tercios del extremo carboxílico de todas las cadenas pesadas de un mismo tipo de inmunoglobulinas poseen una estructura idéntica. De ahí que esta parte de las cadenas pesadas se conozca como parte constante de las cadenas pesadas (CH). Esta parte constante es diferente según la clase de inmunoglobulina que consideremos, determinando la existencia de cinco tipos de cadenas pesadas: g, a, m, d y e que definen a su vez las cinco clases de inmunoglobulinas: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE respectivamente. (Figura 3. ).

Características de los distintos tipos de inmunoglobulinas Debido a esta distinta estructura, las cadenas pesadas van a presentar distintas propiedades biológicas, tales como la capacidad de unirse entre sí, fijar complemento, fijar la pieza de secreción y unirse a macrófagos, neutrófilos y células NK. En la tabla 3.1 se recogen las principales tipos de inmunoglobulinas y en la tabla 3.3 las principales propiedades de las mismas. Hemos de considerar que incluso entre moléculas de una misma clase existen, según a la subclase a la que pertenezcan, ciertas diferencias cómo se observa en la Tabla 3.4.

Isotipos Si inmunizamos un animal de una especie con inmunoglobulinas procedentes de una especie distinta, la mayoría de los anticuerpos generados (antisuero heterólogo) irán dirigidos contra la región constante de la inmunoglobulina que hayamos inyectado, permitiendo definir lo que llamamos el isotipo de una inmunoglobulina determinada. Los genes que codifican para las distintas variantes isotipicas están presentes en todos los individuos sanos, es decir, todos los individuos sanos poseen los genes g1, g2, g3, g4, m, a1, a2, d, e, k y l; que codifican respectivamente para las regiones constantes G1, G2, G3, G4, M, A1, A2, D y E de las cadenas pesadas y para las regiones kappa y lambda de las cadenas ligeras. Existen cinco isotipos de cadena pesada (M, G, A, D y E) y dos de cadena ligera (k y l). Así diremos que el isotipo de una determinada inmunoglobulina es G1 o que esa inmunoglobulina es de la clase G y subclase 1, que a su vez puede tener unas cadenas ligeras del isotipo kappa o lambda.

Dominios moleculares en las cadenas ligeras y pesadas. Tanto las cadenas pesadas como las ligeras poseen grupos de aminoácidos unidos por puentes disulfuro intracatenarios. Estos segmentos repetidos en las cadenas L y H se conocen como dominios. Los dominios de la parte constante de las cadenas pesadas presentan una gran homología secuencial no sólo entre ellos, sino también con la región constante de la cadena L. De forma similar, los únicos segmentos variables en las cadenas L y H presentan cierta homología entre ellos y en menor grado a los de la región constante. La cadena L tiene dos dominios, uno corresponde a la región variable (VL) y otro a la constante (CL). La cadena H tiene un dominio en la región variable (VH) y tres o cuatro en la constante dependiendo de la clase de inmunoglobulina que consideremos (tres en la IgG, IgA e IgD y cuatro en las IgM e IgE). Estos dominios de la región C se denominan CH1, CH2, CH3 y CH4 cuando aparece este último (Figura 3. ). Los dominios V son los responsables de la unión con el antígeno y los dominios C, con excepción del CH1, constituyen el fragmento Fc que, como ya se ha indicado, determina las propiedades biológicas de las inmunoglobulinas. Concretamente es por el dominio CH2 por donde se produce la unión a las proteínas del complemento y se establece el enlace con la cadena glicosilada que completa la molécula glicoproteica de las inmunoglobulinas. Es entre los dominios CH1 y CH2 donde se establece la zona bisagra.. Regiones hipervariables Las zonas variables, tanto de la cadena L como H, poseen a su vez unas regiones en donde se concentra fundamentalmente la variabilidad. Son tres pequeños segmentos que constituyen las denominadas regiones o segmentos hipervariables o región determinante de complementariedad CDR (Complementarity Determining Region), pues determinan la forma del centro activo que permite el reconocimiento y unión al antígeno. Cada una de estas regiones hipervariables se componen de 17 a 20 aminoácidos y cambios en muy pocos aminoácidos de estas zonas suponen una enorme diversidad de posibilidades de unión al antígeno sin variar el resto de la molécula (Figura 3. ). El resto de la parte variable es relativamente constante, de modo que sustituciones en los residuos que la constituyen, no afectan la especificidad de combinación; constituye un “sostén de trabajo” pues su misión es presentar adecuadamente en el espacio las regiones hipervariables al antígeno, por lo que los residuos que componen esta zona se denominan residuos FW (Framework). Moléculas adicionales a la unidad estructural básica. En las inmunoglobulinas aparecen, además de las cuatro cadenas polipeptídicas básicas, un componente glucídico (que representa el 2-14 % del peso total de la molécula) y en algunas clases de inmunoglobulinas, glicoproteínas adicionales conocidas como cadena J y pieza de secreción(Figura 3. ). La cadena J es una glicoproteína con un 12 % de azúcares y un peso molecular de 15 kD que une, mediante puentes disulfuro, extremos Fc en la IgA e IgM. La pieza de secreción es una glicoproteína de 58 kD de peso molecular que sintetizan las células epiteliales de las mucosas y glándulas exocrinas.

Estructura espacial de las inmunoglobulinas. Una vez conocida la secuencia primaria de aminoácidos en las cadenas peptídicas de las inmunoglobulinas, la deducción de su estructura espacial permitió entender la forma en que millones de diferentes sitios de unión al antígeno son construidos sobre una estructura común. Las inmunoglobulinas pueden estar constituidas por unidades básicas simples, como es el caso de la IgG, IgD e IgE; en forma de dímeros (dos unidades básicas unidas), como es el caso de la IgA, o incluso por hasta cinco estructuras básicas unidas por sus extremos Fc como es el caso de la IgM. Esto se debe a la cualidad que tienen las cadenas m y a de unirse entre sí. Esta unión se realiza a través de la cadena J y mediante puentes disulfuro (Figura 3.). Las cadenas pesadas y ligeras están plegadas sobre si mismo, tal como se ha visto mediante análisis cristalográfico (Figura 3.). Cada uno de los dominios de las cadenas está constituido a modo de “cilindros” en los que se encuentran plegados en forma de sandwich dos grupos de cadenas proteicas, una con tres cadenas polipeptídicas y la otra con cuatro, que presentan estructuras secundarias es de hoja plegadab. Estas dos capas proteicas están alineadas paralelamente rodeando un espacio interior en el que predomina la presencia de aminoácidos hidrófobos (Figura 3) . La unión de esas dos capas se efectúa por puentes disulfuro. En las zonas constantes, las capas de cuatro segmentos están en el exterior de la molécula y las de tres en el interior, mientras que en las variables es al contrario; por lo demás, el modelo global de plegado guarda gran semejanza entre los dominios variables y constantes. Sin embargo, las regiones hipervariables constituyen tres bucles adicionales que no se someten al plegamiento del resto del dominio. SUBCLASES DE INMUNOGLOBULINAS. Se sabe que no todas las Inmunoglobulinas de una misma clase tienen idéntica estructura, sino que dentro de las clases se pueden establecer subclases considerando la secuencia de aminoácidos de la región constante de las cadenas H y el diferente número y situación de los puentes disulfuro intercatenarios establecidos entre las cadenas pesadas. Así, la IgG humana se divide en cuatro subclases (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) y la IgA e IgM en dos (IgA1 e IgA2; IgM1 e IgM2) respectivamente. En la tabla 3.4 se exponen las distintas propiedades biológicas de las subclases de inmunoglobulinas G. Las regiones constantes de las cadenas pesadas de estas diferentes clases y subclases de inmunoglobulinas se conocen, como veremos en el apartado siguiente, con el nombre de variantes isotípicas y son las mismas en todos los individuos normales de la misma especie. ALOTIPOS Las inmunoglobulinas, como proteínas que son, pueden actuar como antígenos. Esta propiedad se ha aprovechado para generar anticuerpos contra ellas, que posteriormente han sido utilizados como instrumentos para analizar su estructura y función. Mediante el uso de los anticuerpos generados contra las inmunoglobulinas se ha podido detectar la existencia de variaciones en las mismas. Si inmunizamos un animal con inmunoglobulinas de otro animal de la misma especie (Figura 3.) obtendremos antisueros homólogos. Estos antisueros homólogos pueden ir dirigidos contra las regiones constantes de las inmunoglobulinas, solo contra aquellas zonas que sean distintas entre ambos animales. Estas diferencias reflejan variaciones mínimas, a veces de un solo aminoácido debidas a diferencias en la secuencia de ADN de los genes que codifican para las inmunoglobulinas. Los genes que codifican para las inmunoglobulinas se heredan en forma de alelos mendelianos, por lo que a cada uno de este tipo de variante se le denomina variante alélica y al conjunto de variantes alélicas, se le denomina alotipo. Los determinantes alotípicos o simplemente alotipos, se sitúan como hemos dicho en la región constante de las cadenas pesadas y ligeras. En el hombre se han descrito tres tipos de alotipos: · ·

Gm en las cadenas g de las IgG. Am en las cadenas a de las IgA.

Km en las cadenas ligeras k que dan lugar a tres alotipos: Km (1’2), Km (1) y Km (3), cuyas diferencias estructurales se recogen en la tabla 3.5. IDIOTIPOS

Los antisueros homólogos que referíamos anteriormente que se producen al inmunizar animales con inmunoglobulinas de otro animal de la misma especie, también pueden ir dirigidos contra las regiones hipervariables de las cadenas H y/o L de las inmunoglobulinas. Todas las inmunoglobulinas que poseen los mismos determinantes antigénicos en sus regiones hipervariables se dice que pertenecen al mismo idiotipo, o que poseen los mismos determinantes idiotipicos. Los determinantes idiotípicos son exclusivos para las moléculas producidas por un clon determinado de células productoras de anticuerpos. Todos los animales tienen una representación de todas las regiones hipervariables posibles, generadas por recombinación genética (como veremos en el capitulo 5). Estas en condiciones normales, no dan lugar a una masiva producción de anticuerpos al encontrarse cada una en cantidades muy pequeñas, cuando experimentalmente inyectamos una cantidad suficiente de inmunoglobulinas de una especificidad determinada, se desarrollara una respuesta de anticuerpos contra el idiotipo de esa inmunoglobulina en particular (Figura 3.). Los idiotipos parecen tener importancia fisiológica en la regulación del sistema inmune. Según la teoría de la red de Jerne, frente a los idiotipos se formarían anticuerpos que al unirse a los mismos formarían un entramado (“red”) de anticuerpos unidos a otros anticuerpos que tendrían como acción final la regulación del proceso de síntesis de nuevas inmunoglobulinas. Como decíamos anteriormente, cada uno de los idiotipos se encuentra representado en tan pequeña cantidad que pasa desapercibido para el sistema inmune, sin embargo, cuando un determinado clon de células B reconoce su antígeno especifico, prolifera, se diferencia a célula plasmática y produce una gran cantidad de inmunoglobulinas de una misma especificidad, sus determinantes idiotipicos pasaran a encontrarse en mucha mayor cantidad y ahora sí darán lugar a una respuesta de anticuerpos contra ellos, anticuerpos anti-idiotipo, que podrán unirse a las inmunoglobulinas que ocasionaron su generación. La unión de los anticuerpos anti-idiotipo al idiotipo que los origino podrá dar lugar al bloqueo de las inmunoglobulinas solubles que compartan ese idiotipo o unirse a las inmunoglobulinas de membrana presentes en linfocitos B de la misma especificidad, o incluso a las regiones hipervariables del receptor para el antígeno de la célula T que reconocen ese mismo antígeno, con efectos en cada uno de los casos inhibidores o estimuladores. Los idiotipos se encontraron mediante estudios serológicos, al observarse que cuando en un conejo se inyectaban anticuerpos antisalmonella de otro conejo del mismo alotipo, producían anticuerpos que reaccionaban con el anticuerpo inyectado, incluso aunque los dos conejos fueran genéticamente idénticos. Estos anticuerpos anti-idiotipo, en la mayoría de los casos, están dirigidos contra la estructura exclusiva de la porción fijadora de antígeno y por tanto solo reconocen a inmunoglobulinas de la misma especificidad, sin embargo en algunos casos, los anticuerpos anti-idiotipo pueden estar dirigidos contra zonas de la región hipervariable distintas de la porción fijadora del antígeno y en este caso podrán unirse a inmunoglobulinas de varias especificidades distintas regulando la respuesta inmune frente a varios antígenos. DISTRIBUCIÓN DE LAS INMUNOGLOBULINAS. Las inmunoglobulinas se encuentran distribuidas en todos los fluidos orgánicos de la economía de los vertebrados y en las membranas de los linfocitos B y células plasmáticas. Las cantidades relativas de cada una de las clases de inmunoglobulinas en los diferentes compartimentos del organismo son muy diferentes. En el torrente sanguíneo predomina la IgG mientras que en las secreciones (saliva, lágrimas, secreción bronquial, así como en el líquido cefalorraquídeo y mucosas) la IgA es la predominante. Los niveles de inmunoglobulinas séricas fluctúan ampliamente en función de diversos aspectos, tales como el estado nutricional, la edad, etc. Los valores normales en suero de un hombre adulto (entre 20 y 40 años) se recogen en la tabla 3.6. Ontogénicamente se producen múltiples cambios en los niveles de inmunoglobulinas desde el nacimiento hasta los 8 ó 10 años, en que estos se estabilizan. En la figura 3.17 se expresan las concentraciones de inmunoglobulinas desde antes del nacimiento hasta los 5 años de edad. Los niveles de Ig G son muy altos en la vida fetal y en las primeras semanas de vida extrauterina, debido a que esta inmunoglobulina es la única que pasa de la madre al feto a través de la placenta. Durante la lactancia, descienden los niveles de IgG por catabolismo de esas moléculas que no son repuestas por carecer el niño aún de la capacidad de síntesis de las mismas. También en la edad fetal se sintetizan pequeñas cantidades de IgM (Figura 3.). Cuando las inmunoglobulinas se encuentran insertas en la membrana de los linfocitos (inmunoglobulinas de membrana), actúan como receptores de las señales de activación

antigénicas por su capacidad de reconocimiento del antígeno constituyendo el receptor para el antígeno del linfocito B. SUPERFAMILIA DE LAS INMUNOGLOBULINAS La estructura de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas posee ciertas similitudes entre sí (por ejemplo, la estructura en dominios equivalentes). Esto hizo pensar que ambas cadenas procedían de una molécula ancestral común. Idéntica similitud se ha observado con la b-2-microglobulina y con una gran cantidad de moléculas, todas ellas agrupadas, por tanto, bajo el mismo epígrafe de superfamilia de las inmunoglobulinas. Estas moléculas son: el receptor T para el antigeno, las moléculas de histocompatibilidad clase I y II, LFA-3, ICAM-1 y otras muchas que irán siendo estudiadas en diferentes capítulos de este libro, especialmente en el capítulo 8, donde se estudian las moléculas de adhesión (Figura 3.). FUNCIÓN DE LAS INMUNOGLOBULINAS. La función esencial de las inmunoglobulinas es la de unirse al antígeno. De esta manera las inmunoglobulinas actúan como receptoras de señales antigénicas o bien pueden colaborar en la destrucción antigénica. La primera función se presenta cuando las inmunoglobulinas se encuentran insertas en la membrana de los linfocitos B (inmunoglobulinas de membrana), y para la segunda requieren la colaboración del complemento, macrófagos, neutrófilos y células NK, que tienen la propiedad de unir las inmunoglobulinas por su extremo Fc. Unión antígeno anticuerpo. Los epítopos de un antígeno pueden estar formados por aminoácidos consecutivos en la secuencia de la proteína, como las proteínas se encuentran normalmente dobladas sobre si mismas según lo que llamamos estructura terciaria, en la mayoría de los casos los anticuerpos generados contra este tipo de epítopos solo reconocerán a la proteína desnaturalizada o “linearizada” y por ello se les llama epitopos lineales. En la mayoría de los casos los epítopos suelen estar formados por aminoácidos del antigeno que solo se encuentran suficientemente cerca unos de otros en la proteína nativa, es decir en la proteína que tiene estructura terciaria conservada, es decir una conformación adecuada, por lo que a estos epítopos se les llama epitopos conformacionales (Figura 3. ). Cuando inmunizamos un animal con una proteína, generaremos una serie de anticuerpos dirigidos contra los distintos epítopos de la misma, todos esos anticuerpos se encontraran circulando en el suero del animal al que, una vez extraido, llamaremos antisuero. El tipo de anticuerpos que compondrán ese antisuero dependerá en gran medida de la forma en que hayamos preparado la proteína para la inmunización, si la hemos preparado desnaturalizada, solo existirán epítopos lineales, mientras que si hemos inyectado la proteína en su estado nativo, coexistirán en el antisuero anticuerpos que reconozcan epítopos conformacionales con otros que reconozcan epítopos lineales. En el caso de anticuerpos monoclonales, todas los anticuerpos procederán de un clon de células plasmáticas y por tanto estarán dirigidos contra un solo epítopo que será de un tipo u otro. La importancia radica, en que dependiendo del tipo de epitopos que reconozcan los anticuerpos, las aplicaciones diagnosticas o de investigación serán distintas. En general, los anticuerpos que reconocen epitopos lineales serán útiles para técnicas de Western Blot (donde se analiza la proteína generalmente desnaturalizada) mientras los que reconocen epítopos conformacionales lo serán para técnicas de inmunofluoresencia, inmunoprecipitación, etc. Paratopo. Las inmunoglobulinas se unen a los epitopos de los antígenos por sus sitios activos, constituidos como se ha indicado anteriormente, por los segmentos variables de las cadenas pesadas y ligeras (Figura 3. ) y donde intervienen principalmente las regiones hipervariables. Esta zona de unión al epítopo se conoce con el nombre de paratopo. Fuerzas de unión Ag-Ac La unión del antígeno (Ag) con el anticuerpo (Ac) o inmunoglobulina es semejante a la que se establece entre la enzima y su substrato o entre proteínas que pertenecen a cualquier vía de señalización intracelular. Estas interacciones se deben a la formación de múltiples enlaces no

covalentes (enlaces de hidrogeno, interacciones electrostáticas, de Van der Waals e hidrófobas), cada uno de los cuales por si solos son débiles. Sin embargo, como se establecen múltiples interacciones, la fuerza total de la unión puede ser muy elevada. Para que las interacciones mencionadas lleguen a ser efectivas, los grupos entre los que se establece deben estar situados a distancias muy cortas, y para que esto sea posible y se puedan producir un gran numero de interacciones, el epítopo y el paratopo deben encajar perfectamente, dependiendo de ello la “fuerza” de la interacción que conocemos con el nombre de afinidad. La afinidad esta interacción es de vital importancia, por cuanto de ello dependerá tanto la utilidad diagnósitca y de investigación de un anticuerpo como su importancia fisiopatológica. Para cuantificar la afinidad de una interacción, deberemos entender primero una serie de conceptos de los que nos ocuparemos a continuación. Al tratarse de uniones no covalentes, la unión Ag/Ac será reversible de modo que cuando el antígeno y el anticuerpo se mezclan en solución, se estarán formando y disociaciando complejos constantemente de acuerdo con la siguiente ecuación: KA Ag + Ac = == Ag-Ac KD donde ka representa la constante de velocidad y kd la de disociación. Llegara un momento en que la velocidades de asociación y disociación se igualen, es decir, que el numero de complejos Ag/Ac que se formen sea el mismo que el que se disocie, entonces decimos que se ha llegado a una situación de equilibrio dinámico. Una forma indirecta de medir la afinidad de la interacción de una pareja Ag/Ac, será medir la velocidad de asociación y disociación antes de que se llegue al equilibrio, lo cual puede realizarse actualmente mediante biosensores. Cuanto mayor sea la velocidad de asociación y menor la de disociación mayor será la afinidad de la interacción de esa pareja Ag/Ac. Otra forma complementaria y más directa de cuantificar la afinidad de la interacción Ag/Ac, es hacerlo una vez que se ha alcanzado el equilibrio y utilizando concentraciones bajas de anticuerpo. En estas condiciones la concentración de antígeno que permite que la mitad de los anticuerpos estén unidos a ellos y la otra mitad libre, medida en molaridad, se denomina constante de disociación (KD) y es una medida directa de la afinidad de la interacción. Cuanto menor sea la KD mayor será la afinidad puesto que indica que es necesaria una menor concentración de antígeno para que la mitad de los anticuerpos estén ocupados. La inversa de la KD es la constante de asociación (KA) cuyo valor es directamente proporcional a la afinidad de la interacción. Para determinar experimentalmente estas constantes tendremos que conocer las concentraciones de antígeno libre y unido, para lo cual existen varios métodos entre los que destacan análisis mediante dialisis de equilibrio (Figura 3.). Esta técnica se basa en la utilización de una membrana semipermeable de un poro tal, que permita el paso de un antígeno suficientemente pequeño (un hapteno) pero no del anticuerpo. A concentraciones bajas de antígeno, la concentración de anticuerpo libre ira bajando rápidamente hasta que se alcance el equilibrio, puesto que todo el antígeno que entre a través de la membrana semipermeable quedara retenido por el anticuerpo. Realizando el experimento anterior con varias concentraciones de antígeno, podremos encontrar aquella en la que la mitad del anticuerpo se encuentra unido al antígeno que como hemos dicho corresponde a la KD. La afinidad que hayamos calculado corresponderá exclusivamente a la de la interacción de esa pareja Ag/Ac. Un determinado anticuerpo podrá unirse a mas de un antígeno con afinidades distintas en cada caso. Avidez de la unión Ab-Ac Como apuntábamos anteriormente, el fenómeno de la unión Ag/Ac es en realidad mucho más complejo, pues cada uno de los antígenos poseen varios epítopos distintos, por lo que podrán unir mas de un anticuerpo. Cada molécula de anticuerpo, por su parte, podrá unir al menos dos moléculas de antigeno, una por cada Fab y en el caso de la IgM hasta diez moléculas (como se comento anteriormente las inmunoglobulinas IgM se ensamblan en unidades funcionales constituidas por cinco moléculas de anticuerpo). Finalmente en un antígeno, un determinado epítopo puede estar representado varias veces siendo capaz de unir varias moléculas del mismo anticuerpo. La fuerza total de la interacción que considera todas las interacciones epítopo/paratopo que tienen lugar entre antígenos y anticuerpos multivalentes (con varios sitios de unión), se denomina avidez y es mucho mayor que la suma de las afinidades puesto que las

distintas interacciones se estabilizan entre ellas. Estas interacciones multivalentes poseen una gran importancia fisiopatológica por cuanto cuando se encuentren Ag y Ac en solución, como es el caso del plasma o los tejidos, se formaran agregados constituidos por muchas moléculas que denominamos Inmunocomplejos. A concentraciones equivalentes de Ag y Ac estos inmunocomplejos serán de gran tamaño y podrán quedar atrapados en los tejidos, iniciando una respuesta inflamatoria y dando lugar a las llamadas enfermedades por deposito de inmunocomplejos. Especificidad de la unión Ag-Ac La unión entre el Ag y la Ig tiene una gran específicidad, de tal manera que una Ig se unirá fundamentalmente y con mayor avidez, a un antígeno determinado. En algunos casos la inmunoglobulina podrá unirse a antígenos con epítopos muy similares, aunque en este caso la afinidad de la unión es mucho menor (Tabla 3.7). También es posible que un mismo epítopo se encuentre con dos antígenos diferentes en cuyo caso el anticuerpo reaccionara con los dos antígenos, diciéndose entonces que existe una reactividad cruzada. La consecuencia final de la acción de las inmunoglobulinas es la de destruir al antígeno y/o neutralizar los efectos nocivos de los mismos. Para la consecución de estos objetivos todas las inmunoglobulinas poseen, como ya se ha indicado, una característica esencial y común, que es la de unirse específicamente al antígeno, caracteristica que depende como hemos dicho, de sus regiones hipervariables contenidas en el fragmento Fab. Sin embargo, tanto la neutralización como la destrucción del antígeno, lo consiguen de muy diversas formas, dependiendo del tipo y manera de encontrarse el antígeno y también del tipo de inmunoglobulina que interviene en cada caso utilizando para ello, las regiones constantes y concretamente sus extremos Fc. Tras la unión del antígeno y la inmunoglobulina, ésta puede anular la acción del antígeno por neutralización, precipitación o aglutinación del mismo. Así si la Ig es específica para una toxina bacteriana, cuando se produce la unión Ag-Ac (toxina-antitoxina), quedan neutralizados los efectos tóxicos de la toxina. De ahí que clásicamente, cuando no se conocía la estructura de las inmunoglobulinas, se las denominase antitoxinas, precipitinas o aglutininas, en función de la reacción que se detectaba en cada caso. Propiedades biológicas de las inmunoglobulinas. Los fenómenos de neutralización, precipitación y aglutinación de los antígenos no son suficientes por sí solos para la destrucción y total eliminación de éstos. Para ello, además de las inmunoglobulinas se requiere de la colaboración de otros muchos elementos, tales como el sistema del complemento, macrófagos, polimorfonucleares o células NK. Podemos decir que las inmunoglobulinas, al detectar los antígenos y producirse la subsiguiente unión a ellos, actúan como trans-ductores de la información de la presencia de los mismos que serían destruidos por el complemento, macrófagos, los polimorfonucleares o células NK a los que dan especificidad. Opsonización. Cuando se produce la unión de antígeno e inmunoglobulina G se producen una serie de cambios alostéricos en el extremo Fc de la IgG que hacen que se una a receptores que se encuentran en la membrana de macrófagos y polimorfonucleares. A este fenómeno se le denomina opsonización (Figura 3.). Al producirse esta unión, los macrófagos se activan, iniciándose el fenómeno de fagocitosis y subsiguiente destrucción de los complejos antígeno anticuerpo por los procesos líticos intracelulares, propios de la acción de los enzimas contenidos en los lisosomas de estas células. Estos receptores pueden ser de distinta naturaleza, conociendose en la actualidad tres de estos receptores: FcgRI, FcgRII y FcgRIII, conocidos en la actualidad como CD64, CD32 y CD16 respectivamente. Además de en los macrófagos estos receptores se encuentran en otras células como plaquetas, linfocitos B y NK (Tabla 3.8). Cuando se produce la unión a células NK estas se activan y lisan a las células portadoras del antígeno por un mecanismo conocido como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Cuando la inmunoglobulina que se une a un antígeno es de las clases IgM o IgG, en sus extremos Fc se producen ciertos cambios alostéricos gracias a los cuales éstas adquieren la propiedad de fijar y activar uno de los componentes del complemento. Las fracciones activas del

complemento poseen diferentes acciones muy importantes en la defensa del organismo, una de las cuales es la lisis celular. Este fenómeno se conoce con el nombre de citotoxicidad mediada por el complemento. Además de estas funciones, las inmunoglobulinas tienen la capacidad de ser esenciales en el fenómeno de reconocimiento del antígenos por parte de linfocitos B cuando se encuentran ligadas a la membrana celular de estas células como inmunoglobulinas de membrana constituyendo el receptor para el antígeno del linfocito B. Esta propiedad será estudiada extensamente en capítulos posteriores. En la actualidad y utilizando técnicas de Ingeniería Genética, podemos “construir” anticuerpos monoclonales que contengan una especificidad determinada y que sean del isotipo que deseemos para que predominen unas u otras funciones biológicas. Incluso podemos, con fines terapéuticos generar anticuerpos monoclonales de una determinada especificidad en ratones y posteriormente aislar el ADN que codifica para las regiones hipervariables que confieren la especificidad y fusionarlo con el ADN que codifica para las regiones constantes humanas, estos anticuerpos monoclonales “humanizados” tendrán indudables ventajas desde el punto de vista terapéutico al no ser considerados como extraños por el sistema inmune humano (ver capítulo 4). Propiedades y función de cada una de las inmunoglobulinas Aunque en los apartados anteriores se ha hecho mención a las propiedades y función de las inmunoglobulinas, a continuación estudiaremos brevemente y por separado las características funcionales más importantes de cada una de ellas (Figura 3.). Inmunoglobulina G. Son las inmunoglobulinas más abundantes y representan más del 70 % de las Igs séricas totales; las diferentes subclases se presentan en proporciones muy diferentes. La IgG 1 es la subclase más frecuente (más del 60 %), seguida de la IgG2 (aproximadamente un 18 %), mientras que IgG3 e IgG4 se encuentran en mucha menor proporción. Esta Ig posee capacidad neutralizante, precipitante, de fijar complemento, de unirse a células NK y a macrófagos (opsonización) y son capaces de atravesar activamente las membranas biológicas. La propiedad de atravesar activamente las membranas biológicas es de sumo interés por lo que, además de ejercer esta inmunoglobulina, su efecto en toda la “economía del organismo”, lo hace también en el feto al atravesar la placenta desde la madre, merced a la existencia de receptores para la porción Fc en el sincitiotrofoblasto. Como el feto sólo sintetiza pequeñas cantidades de inmunoglobulinas, adquiere de este modo la posibilidad de defensa, no solamente mientras se encuentra en el seno materno, sino incluso durante la lactancia, período en el cual todavía no ha desarrollado la capacidad total de síntesis de inmunoglobulinas. Sin embargo, este paso de IgG desde la madre al feto no siempre es beneficioso para el feto. De todos es sabido que cuando hay incompatibilidad del tipo Rh entre la madre y el feto, se puede desarrollar el síndrome de eritroblastosis fetal como consecuencia de la destrucción de glóbulos rojos fetales, de nefastas consecuencias si no se acude a tiempo. Esto no se presentaría si la IgG no pasase de la madre al feto La IgG se sintetiza tardíamente tras un primer contacto con el antígeno, sin embargo, tras un segundo contacto la mayoría de las Igs formadas pertenecen a esta clase (Respuesta Secundaria) ( Tabla 3.9). Inmunoglobulina M. Los anticuerpos del tipo IgM son los que mas rápidamente se forman en respuesta a un estímulo antigénico (Respuesta primaria). Esta Ig se caracteriza también por poseer capacidad neutralizante, precipitante, aglutinante, fijar complemento, activar la respuesta inmune, sin embargo no atraviesa activamente las membranas biológicas. Esta última propiedad hace que esta inmunoglobulina ejerza su acción normalmente en los espacios intravasculares. Representa del 5 al 10 % de las Igs séricas totales y junto a la IgD es la más frecuentemente encontrada en la superficie de los linfocitos B como inmunoglobulina de membrana. Inmunoglobulina A.

Esta inmunoglobulina posee capacidad neutralizante y precipitante, mientras que su capacidad de fijar complemento y de opsonización son muy débiles, limitándose su efecto a neutrófilos y no a macrófagos. La propiedad más importante de esta inmunoglobulina viene determinada por su capacidad de unirse por el extremo Fc a la pieza secretora, gracias a la cual puede ser secretada por las mucosas y glándulas exocrinas, ejerciendo su acción más importante en la superficie de mucosas y líquidos biológicos (sobre todo IgA2), tales como el liquido cefaloraquideo, secreción bronquial, lágrima, saliva, etc. Esto es importante porque así protegen precisamente los puntos más vulnerables del organismo, esto es, las puertas de entrada al mismo, como son ojos, boca, aparato digestivo, sistema respiratorio, vagina, etc. No olvidemos que, por ejemplo, si desplegamos la mucosa del aparato respiratorio, la superficie que cubriríamos es de unos 300 2 m , superficie que se encuentra en contacto directo con el exterior a través del aire que se respira. Se deduce de ello que, sin duda, deben ser importantes los mecanismos de defensa local entre los cuales la IgA tiene un papel esencial. Esta inmunoglobulina se encuentra también en la leche materna. Los niveles de todas las inmunoglobulinas, a excepción de la IgG en recién nacidos son muy bajos, siendo por tanto de gran significación el hecho de que la IgA se transfiera desde la madre al lactante a través de la secreción láctea. De ahí que tengamos que insistir en que los lactantes se amamanten en el mayor grado posible directamente por las madres y no con leche de otros orígenes, a lo que actualmente existe excesiva tendencia. La IgA recibida de la madre ejerce un importante papel de defensa a nivel de todo el aparato digestivo. En ello parece que influyen las especiales características de pH gástrico del lactante que es menos ácido que en el adulto y una especial resistencia de esta inmunoglobulina frente al mismo, por lo que no se destruye a su paso por el estómago. Inmunoglobulina D. . La concentración de esta inmunoglobulina en suero es muy baja. Hasta fechas muy recientes no se había demostrado que esta inmunoglobulina poseía capacidad de unirse a antígenos, por lo que se dudaba de que actuase con función de anticuerpo. Sin embargo, aunque actualmente se ha demostrado su acción de anticuerpo, no se conoce con precisión cuáles son sus funciones específicas, aunque se piensa que colabora de forma importante en la activación de linfocitos B al actuar como receptor en la superficie de los mismos. Inmunoglobulina E. En muchos individuos alérgicos esta inmunoglobulina se presenta en grandes cantidades. El estímulo para su síntesis puede proceder de una gran variedad de antígenos, a los que en este caso se conocen como alergenos. Estos alergenos pueden penetrar en el organismo a través de la piel o de las mucosas respiratoria, ocular, del aparato digestivo, etc., así como por inyectables, como es el caso de la penicilina u otros medicamentos. La vida media de la IgE en sangre periférica es de 24-48 horas. No tiene capacidad de atravesar la placenta, por lo tanto, las reacciones de hipersensibilidad inmediata no pueden transferirse de manera pasiva de la madre al feto. Sin embargo, puede existir una predisposición de tipo familiar a padecer enfermedades de naturaleza alérgica. Esta predisposición parece estar relacionada con una tendencia a producir anticuerpos de tipo IgE en la respuesta secundaria frente a antígenos, en lugar de IgG que seria la respuesta normal en individuos no alérgicos. La IgE se encuentra en forma libre en sangre (Tabla 3.10) en donde se observa que los niveles cambian a lo largo de la edad. También la IgE se encuentra en otros líquidos biológicos así como unida a basófilos y células cebadas, gracias a la propiedad que tiene esta inmunoglobulina de unirse por su extremo Fc a receptores de superficie presentes en dichas células. Estas células se caracterizan por encontrarse en la piel y mucosas y por contener abundantes gránulos citoplasmáticos, ricos en sustancias vasoactivas que liberan una vez se activan.

GENETICA INMUNOGLOBULINAS INTRODUCCION. Los linfocitos B, al reconocer un determinado antígeno mediante las inmunoglobulinas de superficie, se activan, proliferan y diferencian hasta células plasmáticas que poseen la propiedad de sintetizar y secretar inmunoglobulinas en grandes cantidades. La síntesis de inmunoglobulinas, como glicoproteínas que son, se efectúa en los ribosomas de las células plasmáticas, donde tiene lugar la traducción de RNA mensajero correspondiente a las cuatro cadenas peptídicas. Posteriormente se producirá el proceso de la glicosilación de dichas cadenas y la secreción de las mismas. El conocimiento de la heterogeneidad de las inmunoglobulinas debida a su diversidad de clases y a la gran variabilidad estructural derivada de la parte variable de las mismas, ha producido, a su vez, una gran inquietud por conocer a nivel genético el proceso de regulación y síntesis de estas moléculas. Hoy ya conocemos los mecanismos más relevantes por los cuales el organismo es capaz de sintetizar millones de moléculas de inmunoglobulinas diferentes con una cantidad de material genético limitado. GENES IMPLICADOS EN LA SÍNTESIS DE INMUNOGLOBULINAS. A partir de los estudios de Tonegawa en 1976, aparece un acumulo de conocimientos por los que se sabe que la síntesis de las cadenas ligeras y pesadas se regula por genes que se encuentran en cromosomas distintos (Figura 4.1). Esto fue puesto de manifiesto empleando técnicas de digestión enzimática del DNA de células B y posterior hibridación con sondas de DNA complementario (cDNA), mediante la técnica de Southern Blot (ver capitulo Métodos). Mediante esta técnica, se pudo observar que usando un cDNA marcado radioactivamente como sonda correspondiente a parte de una cadena pesada, éste se unía a segmentos de DNA de líneas celulares de ratón que contenían el cromosoma 12. Por otra parte, empleando igualmente sondas de cDNA marcadas radioactivamente frente al DNA de cadenas ligerasde tipo k, éstas se unen a células que contienen el cromosoma 6, mientras que las sondas para DNA de cadenas ligeras l lo hacen al cromosoma 16. En la tabla 4.1 se especifica, tanto en humano como en ratón, el cromosoma donde se encuentran estos segmentos de genes. Segmentos de genes y síntesis de inmunoglobulinas. Otra característica importante de la formación de inmunoglobulinas es que, en la síntesis de cada una de las cadenas de inmunoglobulinas participan varios segmentos de genes de cuyas combinaciones resultan los diversos genes funcionales, responsables directos de la codificación de cada una de las cadenas de inmunoglobulinas. Esto explica las múltiples posibilidades de formación del gran número de inmunoglobulinas partiendo de un limitado material genético. La codificación multigénica de las inmunoglobulinas fue demostrada también por Tonegawa analizando DNA de células embrionarias de ratón y de un mieloma también de ratón. Tipos de segmentos génicos Estos segmentos codifican por separado la parte variable, la parte constante y las partes por las que ambas regiones se unen, esto es, las regiones bisagra. Los segmentos que codifican la parte variable son de dos tipos, segmentos V y segmentos D, responsables de la variabilidad y diversidad de las inmunoglobulinas respectivamente. Le siguen los segmentos J o de unión, responsables de unir los fragmentos anteriores con los segmentos C que codifican para la

parte constante. El número de segmentos responsables de la codificación de la parte constante es muy limitado en relación con el número de segmentos que codifican la parte variable de las inmunoglobulinas (Figura 4.2). En las células embrionarias los segmentos de una misma clase se encuentran separados del resto de tal forma que, por una parte, se encuentran los segmentos V, por otra los D, los J y los C. Estos segmentos están contenidos en los exones, que son aquellos fragmentos de DNA que serán transcritos para dar lugar a la síntesis de proteínas, y que se encuentran separados entre sí por fragmentos de DNA no codificadores de proteínas denominados intrones. En consecuencia se puede concluir que: La síntesis de las cadenas ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas está regulada por cromosomas distintos. En esta síntesis participan varios segmentos de genes que combinados dan lugar a los genes funcionales responsables de la codificación de las cadenas de las inmunoglobulinas. REORDENAMIENTO DE LOS SEGMENTOS GENICOS DE LAS INMUNOGLOBULINAS. Las observaciones anteriores se interpretaron como que a lo largo del proceso madurativo de los linfocitos B, se produce un reagrupamiento de segmentos de genes para la iniciación de la síntesis de las cadenas ligeras y pesadas. A este fenómeno se denomina recombinación intracromosómica. A medida que se produce el proceso madurativo de los linfocitos B, los segmentos V, D y J cambian de sitio en el cromosoma de tal manera que se colocan juntos. Posteriormente este conjunto V/D/J se reagrupa con el segmento C correspondiente quedando constituido en consecuencia un gen con toda la información de la cadena. Cuando el linfocito B es maduro posee ya reagrupados los genes correspondientes a sus cadenas ligeras y pesadas y sólo podrá producir un determinado tipo de anticuerpo. Reordenamiento de genes de cadenas ligeras En la síntesis de cadenas ligeras participan los segmentos V, J y C (es decir, no hay genes D para la cadena ligera). Así pues, en el proceso de recombinación de genes de cadenas ligeras se acopla un segmento V con un segmento J y el conjunto V/J se recombina con el segmento correspondiente a la parte constante C. El proceso de transcripción se hace de tal manera que el RNA mensajero contiene información secuenciada V, J y C. En la Figura 4.3 se esquematiza el proceso de recombinación y trascripción ocurridos en la línea celular B conducente a la síntesis de cadenas k. Reordenamiento de genes de cadenas pesadas A su vez, un proceso similar, si bien esta vez en dos etapas, ocurre para la formación de una cadena pesada. En este caso participan los segmentos V, D, J, y C. Primero se produce la recombinación entre un segmento D y un segmento J. En la segunda fase, este conjunto D/J se recombina con un segmento V. El complejo V/D/J se puede por último recombinar con cada uno de los segmentos que codifican las regiones constantes, según la inmunoglobulina a formar. El proceso de recombinación con los genes C tiene lugar a nivel de RNA. Vamos a encontrar en este momento el siguiente orden: el segmento líder; un fragmento V/D/J reordenado y unido y a continuación cada uno de los genes que codifican para las regiones constantes (Cm; Cd; Ct, etc) separados entre sí por los correspondientes intrones y a su vez precedidos por sus respectivos promotores. Se piensa que el gen C m es el situado en primer lugar en la secuencia de genes C, seguido de Cd. En células B en reposo, el único y largo tránscrito primario de RNA va a contener la información del complejo V/D/J más la correspondiente a los genes Cm y Cd. Mediante mecanismos de procesamiento del RNA que analizaremos posteriormente, se va a proceder a la escisión en el tránscrito primario de la información correspondiente a Cm o bien a Cd. Se da lugar de esta manera a una

inmunoglobulina de tipo IgM o IgD, y este mecanismo es además el responsable de que en las células B en reposo se encuentre la expresión simultánea de ambas inmunoglobulinas. En la Figura 4.4 se esquematiza el proceso de recombinación y transcripción ocurrido en la línea celular B concerniente a la síntesis de cadenas pesadas en este caso del tipo m3. En este caso la recombinación se ha producido entre VH3, D1, JH2, responsables de la parte variable de la cadena pesada que se ha recombinado con la parte constante del segmento del gen Cg3, que originará la cadena pesada correspondiente a la IgG3. En el caso de los genes V de las cadenas pesadas, al igual que hemos visto para las cadenas ligeras, junto a su segmento génico se encuentran las estructuraslider y cerca de las mismas se sitúan las secuencias promotoras. Segmentos lider y promotores. Asociados a los segmentos V y situados en dirección 5' de los mismos, existen otros segmentos génicos conocidos como segmentos líder (L). Estos segmentos génicos codifican un péptido pequeño que servirá de guía tanto para las cadenas ligeras como pesadas a su paso por el retículo endoplásmico pero que se separa de estas cadenas antes de que las mismas se unan entre sí para formar la molécula completa de inmunoglobulina. Junto a estos segmentos génicos se sitúan otros conocidos como segmentos promotores y que son responsables de iniciar la señal del proceso de transcripción del mRNA. La secuencia promotora comienza normalmente a una distancia de alrededor de 25 pares de bases antes del lugar de inicio de la transcripción y continúa alejándose del mismo en dirección 5', aunque su localización y longitud no son siempre las mismas. El lugar preciso de la iniciación de la transcripción es reconocido por la combinación conservada de cuatro bases en las que se alternan timina y adenina, para formar lo que se conoce como caja "TATA", siendo continuada por el triplete de bases que codifica el aminoácido metionina, que suele ser el primero codificado de manera casi constante en la mayoría de los genes eucarióticos. Dentro de las secuencias promotoras, vamos a encontrar los denominados motivos de secuencias, esto es, secuencias del DNA a las que se van a unir de manera específica ciertas proteínas nucleares que son las que van a regular su función. En definitiva, las proteínas que van a unirse a estos motivos en el DNA van a regular, en última instancia, la transcripción del DNA, por lo que también estos factores o proteínas de unión son conocidos como factores transcripcionales. En el caso de los genes de las inmunoglobulinas, encontramos en la región promotora la presencia conservada de un octámero (secuencia de ocho bases) en la región 5' no traducida de los genes Vk, mientras que la secuencia complementaria pero invertida de este octámero es encontrada en los genes VH. La presencia de este octámero se ha revelado de gran importancia en el control genético de la síntesis de inmunoglobulinas, en tanto que confieren a las regiones promotoras de los genes de las inmunoglobulinas contenidos en las células B no sólo de especificidad tisular (esto es, sólo las células B producen inmunoglobulinas), sino que además es necesaria para la adecuada función del promotor. Esto parece alcanzarse mediante la unión específica de varios factores transcripcionales, entre los que señalamos los conocidos como Oct-1, Oct-2 y Oct-3. De manera general, los promotores eucarióticos pueden contener varias regiones de unión específicas para cada uno de los factores de transcripción que regulan su función. Regulación del proceso de reordenación de las inmunoglobulinas. Este complejo proceso de recombinación que hemos estudiado hasta ahora ha de tener, necesariamente, un mecanismo de regulación muy estricto. Este mecanismo está constituido por, al menos, los genes RAG-1 y RAG-2 (genes actividores de la recombinación 1 y 2).

Genes RAG-1 y RAG-2 Estos genes fueron descubiertos en el laboratorio de David Baltimore en 1990. El descubrimiento previo de que cada uno de los genes V, D y J era precedido de una corta secuencia única de DNA cuya función es la de servir de señal para los procesos de recombinación, y que es conocida comosecuencia de señal de recombinación (SSR) permitió la identificación de estos genes. Utilizando un sistema experimental de transfección en diversas células de vectores retrovirales conteniendo genes de resistencia al ácido micofenólico como indicador de actividad, y que contenían los genes germinales de V k y Jk junto con sus SSR, estos investigadores comprobaron que sólo las líneas pre-B y pre-T tenían capacidad de recombinación, lo que indicaba un mecanismo de regulación común a ambas estirpes. Este sistema experimental permitió la posterior identificación de RAG-1, seguido del descubrimiento de un segundo gen (RAG-2) muy ligado al anterior tanto en su localización como en su estructura, y que actuaba de una manera sinérgica con RAG-1 facilitando los procesos de recombinación. El papel in vivo que cada uno de estos genes juega en el desarrollo ontogénico del sistema inmune es crítico. Para demostrarlo, se generaron mediante un proceso de ingeniería genética, conocido como gene targeting, ratones que carecían específicamente de RAG-1 o de RAG-2. El análisis de estos ratones demuestra que no se producen fenómenos de recombinación en ninguno de los dos casos, y que como consecuencia, no se encuentran presentes en la periferia ni linfocitos B ni T maduros. Esto indica que los procesos de recombinación génica tanto de los genes del TCR y de las inmunoglobulinas van a estar sometidos a mecanismos comunes de regulación. Aún más importante, se ha encontrado recientemente un grupo de pacientes que tienen mutaciones en RAG-1 o RAG-2, dando como resultado la aparición de una inmunodeficiencia combinada severa por bloqueo en los procesos de recombinación tanto de linfocitos B como T. Fenómenos de aproximación de regiones El proceso de reordenamiento génico, además de juntar los segmentos de genes que formarán la estructura de las futuras cadenas ligeras y pesadas, aproxima las regiones promotoras a las regiones amplificadoras (regiones enhancer), lo cual facilitará posteriormente la regulación y control del inicio así como la adecuada transcripcion del RNA mensajero correspondiente. Las regiones amplificadoras se localizan normalmente a miles de pares de bases de distancia de las regiones promotoras, en tanto que las regiones amplificadoras pueden encontrarse, según el gen, después de los segmentos J y antes de los segmentos C. Por tanto, este acercamiento implica la formación de un bucle en la estructura espacial del DNA, de manera que la aproximación entre ambas regiones no es lineal, sino espacial. Al igual que en el caso de los segmentos promotores, las regiones enhancer van a contener motivos de unión que van a interactuar con los factores transcripcionales. Uno de los primeros factores en ser descubierto y más relevante funcionalmente es el factor de transcripción NF-kB, que se une a la región amplificadora del gen k. En la Figura 4.5 se muestra un esquema del proceso por el cual se eliminan los segmentos de genes que no se van transcribir. Unión de segmentos de genes Otro mecanismo importante en la regulación del reordenamiento de los genes de las inmunoglobulinas es el que controla las uniones entre los genes V, D y J. Es decir, cuales son las señales que hacen que un gen D identifique, dentro del cromosoma, la secuencia de un gen J con el que puede unirse, y, a su vez, el gen V identifique la secuencia del complejo DJ ya formado. Los reconocimientos y uniones de unos genes con otros están controlados por combinaciones de secuencias de DNA que se encuentran conservadas y son únicas de los genes de las inmunoglobulinas. Estas secuencias están formadas por un heptámero palindrómico, un espaciador variable de 23 pares de bases y un nonámero palindrómico (Figura 4.6). Este motivo va a reconocer otro formado por un nonámero de secuencia igual pero invertida al anterior, continuado por un espaciador variable de 12 pares de bases y un

heptámero cuya secuencia es, otra vez, igual pero invertida al heptámero anterior. La longitud conservada de los espaciadores no es casual, en tanto que se ha sugerido que 12 pares corresponde a una vuelta de la hélice de DNA, y 23 a dos. Así, los segmentos que contienen un espaciador de 12 bases sólo se pueden unir a otro de 23. Esto asegura, en el caso de las cadenas pesadas, que los genes se reordenen en el orden correcto. El mecansimo exacto por el que estas secuencias conservadas regulan la unión de los genes de las inmunoglobulinas no se conoce todavía con exactitud. Los modelos actualmente considerados para explicar este fenómeno implican la formación de un bucle en el DNA, lo que conlleva la aproximación de las secuencias reguladoras entre sí. Al ser los heptámeros y nonámeros de secuencia igual pero invertida, ello hace que al formarse el bucle cada uno de ellos se encuentre con su complementario, permitiendo de esta manera la unión del DNA. Se especula que las recombinasas (que pudieran ser codificadas por RAG-1 y/o RAG-2) tengan a estas estructuras como diana de su mecanismo de acción. Aunque, como ya hemos señalado, no podemos excluir que la actividad recombinasa a este nivel sea modulada por otros genes todavía no descubiertos. CAMBIO DE ISOTIPO DE LAS INMUNOGLOBULINAS. Cuando las células B reconocen al antígeno, una población de las mismas secretarán IgM llevando a cabo la respuesta primaria, mientras que, en menor medida, otras células van a comenzar a producir IgG, IgA e IgE. Esto quiere decir que las células B tienen la propiedad de cambiar la subclase o isotipode las inmunoglobulinas que producen Por tanto, en respuesta a un mismo antígeno se van a generar anticuerpos que van a mantener su parte variable, pero van a ser diferentes en los segmentos constantes que van a ensamblar. Se cree que el cambio de isotipo se produce por dos mecanismos. El primer mecanismo implica que las células B cambian su isotipo tiene lugar esta vez a nivel de DNA, así una célula que ha sido comprometida a producir anticuerpos de un determinado isotipo, va a sufrir una delección de todos los genes C a excepción del correspondiente a la subclase que va a ser producida (Figura 4.7). El segundo mecanismo es conocido como splicing alternativo (Figura 4.8). Este proceso molecular genera polimorfismo proteico debido a la transcripción alternativa de los exones Estos fenómenos pueden ser influenciados por ciertas citocinas. Así por ejemplo, la IL-4 induce el cambio de isotipo de IgM a IgG1 o bien a IgE. CAUSAS DE LA DIVERSIDAD DE LAS INMUNOGLOBULINAS. La diversidad de las inmunoglobulinas deriva de la variabilidad de las cadenas ligeras y pesadas, por una parte, y por otra de las diversas posibilidades de unirse entre sí estas cadenas. La variabilidad de cadenas, tanto L como H, que un mismo organismo es capaz de producir, se debe al alto número de segmentos V existentes, a las diversas regiones J y D también existentes y a la multiplicidad de formas de combinación de V/J, en las cadenas ligeras, y V/J y J/D, en las cadenas pesadas. Es decir, el primer mecanismo de generación de diversidad procede de las diferentes posibilidadaes combinatorias de cada uno de los genes entre sí. Así, si consideramos que para la cadena pesada de las inmunoglobulinas del ratón existen unos 300 genes VH (aunque éstos pueden llegar hasta 1000), 12 genes D H y 4 genes JH, las 4 posibilidades de combinación diferentes son como mínimo de 1.4x10 (300x12x4). A esto hay que añadir las provenientes de las cadenas ligeras. La cadena k tiene 300 genes V k y 4 Jk, mientras que la l sólo tiene 2 genes Vl (aunque en humanos contiene muchos más) y 3 J l. Las 3 posibilidades combinatorias son por tanto de 1.2x10 en el primer caso y de 6 en el segundo. Al necesitarse la unión de cadenas pesada y ligera, las posibilidades combinatorias son las resultantes de multiplicar cada una de ellas (Tabla 4.2).

Un segundo mecanismo generador de diversidad se debe a la imprecisión de las uniones de los segmentos V, D y J debido posiblemente a desequilibrios en la unión entre los intrones y exones correspondientes, y que se traduce en un pequeño cambio en la estructura primaria de la cadena peptídica. Al parecer este mecanismo desempeña un importante papel en la maduración de la afinidad de los anticuerpos, de tal manera que a medida que progresa la respuesta frente a un antígeno, los anticuerpos formados presentan cada vez mayor grado de afinidad por los epitopos del antígeno. Este mecanismo multiplica por, al menos, nueve las posibilidades combinatorias de los genes de la cadena pesada y por tres las posibilidades de los genes de las cadenas ligeras, en tanto que por término medio se producen tres reordenamientos por cada unión. Además, toda la diversidad generada por los dos mecanismos ya mencionados, puede verse amplificada por la aparición de mutaciones puntuales en el gen responsable de una determinada cadena de inmunoglobulinas. La ocurrencia de hipermutaciones somáticas como vía de generación de diversidad se han demostrado al encontrarse cadenas de inmunoglobulinas que, obtenidas del mismo tipo de mieloma, poseían secuencias de aminoácidos ligeramente diferentes a pesar de estar codificadas por un mismo gen. Estas mutaciones somáticas son de gran importancia en los procesos de incremento de la afinidad del anticuerpo. Sabemos que conforme se produce en el tiempo la respuesta de inmunoglobulinas, esta no sólo incrementa el número de moléculas producidas, sino que igualmente lo hace la afinidad de las mismas. También, hay que indicar que a la diversidad de las cadenas ligeras y pesadas en sí mismo, hay que añadir la diversidad derivada de las diferentes formas de unión de las cadenas ligeras con las pesadas. EXCLUSION ALÉLICA EN LA SINTESIS DE INMUNOGLOBULINAS. Normalmente cada célula productora de anticuerpos sólo expresa un tipo de cadena pesada y otro de cadena ligera. Este fenómeno se produce a pesar de que los genes que codifican estas cadenas se encuentran presentes en los dos cromosomas, uno de origen paterno y otro de origen materno, en tanto que las células productoras de inmunoglobulinas son diploides. Es decir, a pesar de que existan dos copias para cada uno de los segmentos génicos V, D, J y parte constante de las cadenas pesadas y ligeras, sólo una es expresada. De no ser así se generaría un serio problema en el individuo que generaría anticuerpos por una misma célula con especificidades diferentes. Se piensa que este fenómeno, conocido como exclusión alélica, se debe a que sólo los genes de un cromosoma sufren los procesos de reagrupamiento antes indicados de manera que sólo la información del cromomosoma no reorganizado es abortada y no se expresa. Esto implica que una vez que se ha producido una unión productiva V/D/J, los procesos de recombinación son bruscamente detenidos en el otro cromosoma, de manera que no se puede dar lugar a un segundo anticuerpo maduro. El mecanismo exacto por el que se produce la exclusión alélica no está completamente definido. No obstante, se piensa que una vez producido un reordenamiento efectivo de los genes de las inmunoglobulinas, la proteína madura va a enviar una señal negativa de manera que la célula no produzca nuevos reordenamientos. Así, la presencia de un reordenamiento completo de la cadena pesada va suponer el envío de una señal que inhiba nuevos reordenamientos de otras cadenas pesadas, por un lado, y por el otro va a hacer que se inicien los reordenamientos correspondientes a las cadenas ligeras, comenzando por las cadenas k. Si no se produjeran reordenamientos productivos de k, entonces se permitiría el reordenamiento de l. El ensamblaje final de las cadenas pesadas y ligeras impediría nuevos reordenamientos, como ya hemos discutido, mientras que si no se consiguieran reordenamientos productivos en ninguno de los dos alelos de k y l, entonces la célula B entraría en un fenómeno de muerte celular programada, cesando su maduración y siendo posteriormente eliminada. El proceso de exclusión alélica tiene como fin asegurar que

cada una de las células B produce un único tipo de anticuerpo, a fin de evitar el reconocimiento de más de un epítopo mediante la producción de anticuerpos multireactivos. FASES FINALES DE LA SINTESIS DE INMUNOGLOBULINAS. El RNA mensajero correspondiente al péptido a sintetizar se forma mediante la transcripción de los segmentos V, D, J y C ya reagrupados, de manera que la información de estas regiones se transcribe en un solo mRNA al que se añade la cola de poliadenilación (poli-A). También se transcribe el segmento L (Figura 4.9). Las partes del RNAm correspondientes a los segmentos intrónicos es eliminada. Esta eliminación implica los procesos de corte del RNAm y posterior unión de los extremos exónicos restantes. Después, el RNAm abandonará el núcleo para alcanzar los ribosomas en donde se producirá la síntesis de los péptidos mediante el proceso de traducción. En el proceso de traducción en el ribosoma se sintetizan los péptidos. Una vez formados los péptidos de una Ig se produce la glicosilación de los mismos en el propio retículo endoplásmico, así como su ensamblaje para la formación de la Ig completa, antes de ser secretada por la célula. El proceso de ensamblaje parece desarrollarse en las siguientes fases: H+H àH2+LàH2L+LàH2L2. En el caso de la IgM, parece que por el contrario se unen primero una cadena pesada con una ligera, uniendose esta media molécula a su otra media independientemente formada. Una vez que se ha producido el ensamblaje de la inmunoglobulina, esta molécula tiene dos opciones funcionales. Una primera es la de permanecer en la membrana de las células B, convirtiendose de esta forma en el receptor de las células B para el antígeno. La segunda opción es la de ser secretada al medio, con la función de interaccionar directamente con el antígeno y conseguir su destrucción. La única diferencia entre ambas es que las formas de Igs de membrana tienen en la región carboxi-terminal de la cadena pesada un fragmento añadido de 19 aminoácidos. La decisión de optar entre una forma u otra es tomada a nivel de transcripción del RNA, una vez más mediante un proceso de splicing. En el caso que nos ocupa, el proceso conlleva la transcripción adicional de dos exones (M1 y M2) situados en la región 3' del gen CH, lo que a su vez da como resultado que se genere el fragmento de 19 aminoácidos que origina una región transmembrana hidrofílica continuada por una muy corta región intracitoplasmática. Si esto ocurre así, se origina el anclaje de la molécula a la superficie celular, dando por tanto lugar a una inmunoglobulina de superficie, mientras que si estos dos exones no son transcritos, la hidrofobicidad conferida a la inmunoglobulina hace que la molécula no pueda anclarse a la superficie y sea secretada. ANTICUERPOS MONOCLONALES PRODUCIDOS POR HIBRIDOMAS Cuando se realiza una inmunización con el objeto de producir anticuerpos frente a un antígeno, se produce una gran variabilidad de inmunoglobulinas que poseen función de anticuerpo frente a los diferentes epitopos del antígeno. Esta produción de inmunoglobulinas es de tipo policlonal debido a que son muchos y muy diversos clonos linfocitarios los que se activan y diferencian para la producción de anticuerpos (Figura 4.10). Este fenómeno es de gran utilidad biológica por cuanto ofrecen una amplia barrera de protección del organismo al formarse una gran variabilidad de anticuerpos. Sin embargo, los antisueros así obtenidos, aunque se han utilizado ampliamente y han sido de gran interés en el conocimiento de la biología y la bioquímica de las inmunoglobulinas (inmunoprecipitaciones e inmunoblotting), ofrecen serias dificultades para su uso, por ejemplo, en la identificación de sustancias u otros fines análogos, debido a la gran heterogeneidad estructural y funcional que poseen.

Este problema se ha obviado desde que Georges Kholer y Cesar Milstein en 1975 (Figura 4.11)consiguieron la producción de anticuerpos monoespecíficos, conocidos como anticuerpos monoclonales(AcMo). Con ello se abrió un amplio campo en la Inmunología y la Biología Molecular en general puesto que estos anticuerpos son de una gran utilidad por cuanto tienen la capacidad de reaccionar frente a un solo epítopo del antígeno y son entre si homogéneos. Fundamentos de la producción de anticuerpos monoclonales. El método seguido para la producción de estos anticuerpos consiste en la unión (fusión) de una célula B productora de anticuerpos , con una célula de gran capacidad de crecimiento (células de mieloma) con lo cual se forma un híbrido (hibridoma) que posee la información genética necesaria para la síntesis del anticuerpo deseado, que le es aportada por la célula B, y una activa capacidad de síntesis proteica al tiempo que puede multiplicarse tanto in vivo como in vitro indefinidamente, propiedades estas últimas que son aportadas por la célula mielomatosa (Figura 4.12). De esta manera, se pueden producir innumerables tipos de hibridomas de acuerdo con el tipo de anticuerpo que interesa. Al ser cada uno de los anticuerpos así producidos homogéneos, ofrecen patrones de reacción de gran especificidad con los antígenos utilizados en la inmunización.Kholer y Milstein para la puesta a punto de esta técnica escogieron eritrocitos de oveja como inmunógenos, ya que el anticuerpo contra tales células se detectaba fácilmente mediante la técnica de placas hemolíticas de Jerne. Esta técnica se basa en la detección de la formación de anticuerpos frente a glóbulos rojos de carnero, comprobando la capacidad lítica de los glóbulos frente al complemento. Así, mezclando células de mieloma de ratón con células de bazo procedentes de ratones inmunizados con glóbulos rojos de carnero en presencia de un agente promotor de la fusión celular, identificaron con éxito las células híbridas en un medio selectivo y observaron que segregaban inmunoglobulinas de ambos progenitores. Algunas segregaban anticuerpos contra los eritrocitos. Habían logrado por tanto, aislar clones que segregaban una sola especie molecular de anticuerpo y que, además, podían mantenerse en cultivo. Por primera vez se habían desarrollado cultivos continuos de células híbridas que segregaban un anticuerpo monoclonal de especificidad predefinida. Una vez seleccionado el hibridoma adecuado, éste puede conservarse largo tiempo congelado. En cualquier momento el clon puede hacerse crecer para la producción de anticuerpos por inyección a ratones o siembra en cultivo. Generalmente el clon se inyecta intraperitonealmente generándose ascitis extraordinariamente ricas en anticuerpos, de donde son fácilmente purificables. Cuando el clon se ha cultivado in vitro el anticuerpo se recolecta a partir del sobrenadante del cultivo. Tecnología de la obtención de AcMo. Generalmente se comienza por inmunizar a ratones de la cepa BALB/C con el antígeno frente al cuale se desea obtener el anticuerpo. El protocolo de inmunización suele ajustarse a tres dosis del material antigénico que se administran intraperitonealmente, con intervalos de unas dos semanas. Aproximadamente a los veinte días de la primera dosis, se comprueba la presencia de anticuerpos dirigidos frente al antígeno en el suero del ratón. Comprobada la presencia de anticuerpos se procede al aislamiento de las células B productoras de los mismos del bazo de los animales, en condiciones de esterilidad. Las células así obtenidas serán utilizadas para su fusión con células mielomatosas, generalmente del tipo NSI. La línea mielomatosa NSI procede de un mieloma inducido en la cepa BALB/C que ha perdido la capacidad de secretar inmunoglobulinas, por lo que no interferirá en la producción de anticuerpos con los hibridomas que se obtengan. Mientras los linfocitos B, sensibilizados frente al antígeno correspondiente aportan al híbrido los genes que codifican las cadenas ligeras y

pesadas de las inmunoglobulinas, la línea mielomatosa dota al híbrido de la capacidad de crecimiento ilimitado propia de las células tumorales y, por tanto, de la posibilidad de desarrollarse tanto in vitro como in vivo. Esta línea mielomatosa se ha hecho resistente a la 8- azaguanina porque carece de la enzima HGPRT (hipoxantin-guanidin- fosforibosil-transferasa). La síntesis de su DNA la tiene que realizar a través de la vía de novo que obtiene nucleótidos a partir de aminoácidos y azúcares. La aminopterina bloquea la síntesis de novo de nucleótidos, por lo que las células de la línea NSI no sobrevivirán en presencia de este fármaco. Esta característica permitirá eliminar las células NSI que no se han podido fusionar en el medio rico en aminopterina. Las células NSI no fusionadas morirán, mientras que los híbridos podrán seguir creciendo porque poseen la enzima HGPRT, aportada por los esplenocitos. La fusión celular entre los esplenocitos del ratón inmunizado y la línea mielomatosa NSI se realiza en el medio de cultivo adecuado que contiene, además de los nutrientes necesarios para un cultivo celular, polietilen glicol (PEG) que es un detergente capaz de disolver parte de la membrana celular permitiendo así la formación de células que contienen dos núcleos (fusión celular).Posteriormente se procede a la selección de los híbridos que se inicia a partir de las 24 horas después de la fusión. Para ello se añade medio de cultivo con HAT (mezcla de hipoxantina aminopterina y timidina), a cada uno de los pocillos de las placas en donde se encontraban las células en cultivo. Hacia la tercera semana, se retira la aminopterina de los cultivos añandiéndose medio HT (hipoxantina-timidina) y, por último, durante la cuarta semana las células se mantienen sólo en medio de cultivo. Terminado este proceso se estudian los sobrenadantes de los híbridos para determinar si producen anticuerpos. Los hibridomas productores de anticuerpos se expanden y si siguen siendo positivos se clonan cuando se estabilizan en cultivo. La clonación tiene como objetivo aislar el hibridoma productor del anticuerpo deseado y que todas las células que lo constituyen procedan de la misma célula progenitora, dado que los hibridomas productores de anticuerpos se encuentran mezclados en cultivo con otros hibridomas que, o bien no son productores o sintetizan anticuerpos que no interesan. Utilidad de los anticuerpos monoclonales. Un anticuerpo monoclonal es un reactivo biológico homogéneo en su actividad, en contraste con los antisueros convencionales que son una mezcla variable de inmunoglobulinas. El uso más generalizado de los AcMo se centra: 

En la caracterización y cuantificación de sustancias de interés biológico que se encuentran en cantidades muy pequeñas, tales como hormonas, enzimas, interferones, etc. (Tabla 4.3).

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En la identificación de antígenos presentes en las membranas celulares, tales como las moléculas CD3, CD4, CD8 y otras muchas. Esto ha permitido no sólamente la cuantificación de subpoblaciones celulares, sino también su fraccionamiento y aislamiento. En este sentido cabe destacar el empleo de equipos conocidos como clasificadores de células activados por fluorescencia" (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorter)

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En trasplantes de órganos y enfermedades autoinmunes en donde los AcMo dirigidos contra los linfocitos T se utilizan frecuentemente en casos de amenaza de rechazo agudo.

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En oncología para la localización de células tumorales y/o su destrucción. Para ello los anticuerpos específicos frente a antígenos tumorales tales como el antígeno carcinoembrionario pueden ser 111 99 marcados con sustancias radioactivas, como por ejemplo In o Tc , y así localizar su situación en el organismo mediante una gammacamara especial cuando son administrados a individuos afectos de tumores. También los AcMo pueden ser utilizados en la destrucción de células tumorales en oncología, para lo cual los anticuerpos son marcados con drogas citostáticas y citotóxicas.

En esta panorámica general de la utilización de los anticuerpos monoclonales, asistimos hoy a una impresionante dispersión hacia otros muchos campos, lo cual permite vislumbrar esperanzadores horizontes a partir de una técnica que en principio surgió simplemente de la pretensión de desvelar la organización y expresión genética de las inmunologlobulinas, lo que acabo constituyendo un verdadero hito en la historia de la medicina y las ciencias biológicas. Así pues, paulatinamente, los anticuerpos monoclonales van sustituyendo a los antisueros convencionales en base a las ventajas que su uso conlleva y en tanto que pueden producirse industrialmente. Se expone un esquema del procedimiento seguido para la producción de AcMo para su posterior utilización tanto en el laboratorio como en la clínica como medio terapéutico y diagnostico(Figura 4.13). Sin embargo, sería deseable que, para su aplicación terapeútica, los anticuerpos procedieran de linfocitos humanos y no de ratón o rata. Contrariamente a lo que se esperaba en un comienzo, la utilización de linfocitos humanos ha resultado difícil, en tanto que los intentos de inmortalizar hibridomas humanos mediante su fusión con células mielómicas de ratón o rata, han sido, hasta la fecha, decepcionantes. El problema reside en que, cuando se fusionan células humanas con células animales, hay una rápida pérdida preferencial de los cromososmas humanos en las células híbridas interespecies resultantes. En la actualidad se comienza a producir AcMo humanos empleando linfocitos B a los que se transforma en tumorales mediante su infección con el virus de Ebstein Barr, obteniéndose así linfocitos B productores de AcMo que pueden ser clonados y, por consiguiente, anticuerpos monoclonales homogéneos en su composición y especificidad. AcMo quiméricos humanizados. Como se ha comentado con anterioridad, uno de los problemas del uso de AcMo en medicina es que al ser en su mayoría de origen murino, cuando son administrados a individuos, éstos producen anticuerpos frente a los mismos que disminuyen su eficacia o bien pueden presentar problemas de tipo alérgico cuando se usan reiteradamente. Para evitar este problema se estan ya obteniendo mediante técnicas de ingeniería genética anticuerpos humanizados de tipo quimérico. Estos anticuerpos se preparan mediante la creación de una molécula híbrida en la que se mantienen las partes del anticuerpo monoclonal de ratón que le confieren la especificidad (regiones V, D y J), y sustituir la región constante del anticuerpo de ratón por una región igualmente constante del mismo isotipo pero de procedencia humana. Para ello, es necesario disponer previamente del cDNA que codifica la inmunoglobulina de ratón de nuestro interés. Las regiones del DNA de ratón que contienen la especificidad del anticuerpo han de ser unidos a otro cDNA de humano que codifica para la región constante de una inmunoglobulina del mismo isotipo. Una vez que se han ligado las

diferentes regiones de DNA de ratón y humano, esta construcción ha de ser subclonada en un vector apropiado y transfectada a una célula B a fin de que ésta produzca el anticuerpo humanizado, y que este posea una adecuada glicosilación. De acuerdo con esto, es posible eliminar de un anticuerpo de ratón (al menos parcialmente) sus regiones más inmunógenas, de manera que no sea reconocido como extraño por la persona que es inyectada el organismo humano (Figura 4.14). Un paso más adelante en la humanización de los anticuerpos monoclonales producidos en ratón ha sido ya dado mediante la realización de los llamados anticuerpos hiperquiméricos. En este caso se rediseña la parte variable del anticuerpo, de manera que los aminoácidos correspondientes a la secuencia del anticuerpo de ratón que codifican las partes hipervariables para el sitio de unión se introducen en el contructor que codificará la parte variable dentro del marco de la región variable de un anticuerpo humano. Es decir, el anticuerpo humano va a servir únicamente como vehículo o vector de las regiones de determinantes complementarios (CDR) murinas, que son en realidad las responsables de la unión específica del anticuerpo con el antígeno.

MOLECULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD

NTRODUCCION Las moléculas de histocompatibilidad fueron inicialmente descubiertas por ser las principales responsables de las reacciones de rechazo de tejidos trasplantados entre individuos de la misma especie. Los loci genéticos reguladores de la síntesis de estos antígenos se agrupan en una región denominada Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) y se heredan de acuerdo con las leyes de Mendel. Una de las principales características de estas moléculas es su extraordinario polimorfismo. Hoy día se considera que las moléculas de histocompatibilidad tienen como función principal recoger péptidos del interior de la célula, transportarlos a la superficie celular y allí presentarlos a las células T. Las moléculas de histocompatibilidad se localizan en la superficie de las células de las distintas especies animales. En el ratón se denominan antígenos H-2 y los genes que las codifican se localizan en el cromosoma 17. En el humano se denominan antígenos HLA(Human Leucocyte Antigens) y están codificadas por genes ubicados en el brazo corto del cromosoma 6. Los primeros trabajos sobre los antígenos H-2 fueron realizados por Gorer (1936) en cepas murinas endogámicas (inbred), obtenidas por el cruce entre animales hermanos de forma continuada durante al menos 20 generaciones. El rechazo de trasplantes entre animales de distintas cepas endogámicas y la obtención de aloantisueros mediante inmunización de animales de una cepa con células de otra, permitieron una primera definición de este sistema genético. En el caso humano, el primer antígeno de histocompatibilidad descrito fue Mac (en la actualidad definido como HLA-A2), descubierto por Jean Dausset en 1958 (Figura 5.1). Pronto se vio que existía una relación entre estos antígenos y la supervivencia de riñones trasplantados. En la actualidad, son ya centenares los antígenos de este tipo que se han definido gracias a las intensas colaboraciones establecidas entre los laboratorios que trabajan en histocompatibilidad, a través de los Workshops Internacionales de Histocompatibilidad que desde 1964 se celebran periódicamente.

En este capítulo estudiaremos la estructura de estas moléculas y la organización de los genes que las codifican. Su función en el procesamiento y presentación de péptidos se estudiará en el capítulo siguiente. ESTRUCTURA DE LAS MOLÉCULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD Según su estructura las moléculas de histocompatibilidad se dividen en dos grandes grupos: moléculas de clase I y moléculas de clase IIque se encuentran codificadas por regiones genéticas distintas dentro del MHC y desempeñan distintas funciones inmunológicas (Figura 5.2). Las principales moléculas de histocompatibilidad humanas quedan reflejadas en la tabla 5.1. Estructura de las moléculas HLA de clase I. Las moléculas de los antígenos de histocompatibilidad de clase I (Figura 5.3), tanto en el sistema HLA como en el H-2, se hallan constituidas por 2 cadenas polipeptídicas: una cadena pesada, glicosilada, de mayor tamaño, con un peso molecular de 45 kD, que se encuentra asociada, mediante interacciones no covalentes a una cadena ligera, la beta-2-microglobulina que tiene un peso molecular aproximado de 12.5 kD. La beta-2-microglobulina, polipéptido idéntico al componente sérico normal, es idéntica en todos los individuos de la misma especie y los genes que la codifican no se encuentran en el MHC, situándose en el cromosoma 16, en el hombre y en el cromosoma 2 en el ratón. El análisis estructural de la beta-2-microglubulina revela que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas, con una notoria homología con el tercer dominio constante de la cadena pesada de las inmunoglobulinas. La cadena pesada, por el contrario, es altamente variable entre individuos de la misma especie, siendo la responsable del polimorfismo antigénico de las moléculas de histocompatibilidad clase I(Figura 5.4). Se distinguen tres zonas bien definidas, una zona extracelular de mayor tamaño en la que se encuentran los determinantes antigénicos de la molécula, una pequeña región transmembrana, hidrófoba, y finalmente una región intracitoplasmática de unos 35 aminoácidos. La zona extracelular se halla organizada en tres dominios de aproximadamente unos 90 residuos cada uno, denominados alfa-1, alfa-2 y alfa-3 mantenidos por la existencia de puentes intracatenarios. Los residuos glucídicos se encuentran unidos a la asparagina en la posición 86 del dominio alfa-1. Los dominios alfa-1 y alfa-2 constituyen regiones de contenido variable en aminoácidos, es decir son las zonas donde radica la variabilidad de la molécula. Por el contrario el dominio alfa-3 es bastante constante, pertenece a la superfamilia de las Igs y por tanto muestra una notable homología con la región constante de las inmunoglobulinas y con la beta-2-microglobulina Estructura de las moléculas HLA clase II. Las moléculas de clase II son glicoproteínas que se encuentran en la superficie celular. Están formadas por dos cadenas, ambas con un dominio transmembrana, denominadas cadena a o pesada y cadena b o ligera, asociadas entre sí mediante interacciones de naturaleza no covalente. Tanto la cadena a como la cadena b se encuentran codificadas por genes situados en el MHC. La cadena a tiene un peso molecular aproximado de 33kD y la cadena b de 29 kD. Ambas cadenas tienen una organización semejante. Están constituidas por dos dominios extracelulares y se conocen con las denominaciones de a-1 y a-2 en la cadena pesada y b-1 y b-2 en la cadena ligera. Cada uno de estos dominios consta de 90-96 aminoácidos. El dominio a-1 es abierto mientras que los dominios alfa-2, beta-1 y beta-2 se pliegan mediante un puente disulfuro cada uno de ellos. Cuando se analizan los aminoácidos de las cadenas ligeras, se observa que los dominios a-2 y b-2 pertenecen a la superfamilia de las Igs, mientras que los

a-1 y b-1, que son los que presentan mayor diversidad presentan homología con los dominios alfa-1 y alfa-2 de los antígenos clase I. Se aprecian tres zonas donde es más frecuente la variabilidad. Un tercer dominio corresponde a la región de cada cadena que atraviesa la membrana celular, contiene unos 30 aminoácidos y es de naturaleza hidrofóbica. Finalmente, el cuarto dominio, corresponde a la parte citoplasmática de la molécula, es de naturaleza hidrofílica y contiene de 10 a 16 aminoácidos.. Estructura tridimensional. El análisis de la estructura tridimensional de los antígenos de histocompatibilidad de clase I y clase II, determinada mediante cristalografía, demuestra que los dominios están estructurados de forma diferente. Así, dentro de los antígenos clase I, el dominio alfa-3 y labeta-2-microglobulina están organizados en estructura de hoja plegada b. Por el contrario los dominios a1 y a2 constan cada uno de ellos de una sola zona formada por cuatro fragmentos en estructura de hoja plegada b seguido de otro segmento organizado en forma de a-hélice. Esta organización delimita una hendidura denominada sitio de unión al péptido (peptide binding groove) en el que los residuos más polimórficos se encuentran en el suelo y las paredes de la hendidura. En esa hendidura se localiza un péptido que no pertenece a la molécula y de aproximadamente 8-10 aminoácidos. Ese péptido procede de proteínas endógenas, como veremos en el capítulo siguiente e interacciona con las moléculas de histocompatibilidad mediante fuerzas no covalentes entre sitios concretos de ambas estructuras. Un determinado antígeno de histocompatibilidad puede unirse a péptidos diferentes siempre que éstos posean uno o varios motivos que interaccionen con zonas de la molécula cuya estructura suele estar condicionada por residuos polimórficos. La estructura tridimensional de los antígenos de clase II también ha sido determinada por cristalografía y es semejante a la de los antígenos de clase I. Los dos dominios proximales (a2 y b2) son los equivalentes al dominio alfa-3 y a la beta-2-microglobulina de los antígenos clase I, mientras que los dos dominios distales (alfa-1 y beta-1) de los antígenos clase II se corresponden con los dominios alfa-1 y alfa-2 de la molécula clase I. La hendidura donde se ubica el péptido se forma entre los dominios alfa-1 y beta-1 de las moléculas clase II. Distribución tisular de las moléculas clase I y II. Las moléculas de clase I se encuentran presentes en la mayoría de las células nucleares del organismo pero no en todas, dado que, en algunas localizaciones, su expresión es mínima o incluso nula, como sucede en el endotelio, glándulas de Brunner duodenales, trofoblasto velloso o neuronas del sistema nervioso central. La expresión de las moléculas de clase II se encuentra fundamentalmente restringida a macrófagos, monocitos, linfocitos B y cuando están activados también en linfocitos T y NK. Igualmente se encuentra expresado en alta densidad en otras células que actúan como presentadoras de antígenos, tales como células dendríticas del bazo, epidérmicas de Langerhans o células endoteliales. También se encuentran en progenitores hematopoyéticos, células leucémicas y células de diferentes tipos de tumores. Esta distribución diferencial de las moléculas de histocompatibilidad de clase I y II se encuentra directamente relacionada con la diferente función de cada tipo de moléculas. Los niveles relativos de las moléculas HLA en diferentes órganos y tejidos es muy variado (Figura 5.5). Otras moléculas de histocompatibilidad Existen otras moléculas de histocompatibilidad entre las que destacan de manera más significativa: HLA-G, HLA-E y HLA-F, que presentan una gran homología con las moléculas clásicas de MHC de clase I (HLA-A, -B y -C).

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HLA-E: La estructura tridimensional de la molécula de HLA-E, es muy

similar a la de las moléculas clásicas HLA-A, B y C presentando sitios de unión conservados para la b-2-microglobulina y al CD8. Esta molécula, cuando presenta el péptido adecuado, se une a los receptores CD94/NKG2A que inhiben la actividad citotóxica de las NK y ciertos linfocitos T. En la actualidad se ha descubierto que la proteína UL40 presente en los citomegalovirus, es capaz de unirse ella, y provocar una cascada de inhibición en las células NK. 

HLA- F: Se sabe que esta molécula se expresa principalmente en

amígdalas, bazo y timo. La localización de la proteína es intracelular. Además, está descrito que los tetrámeros de HLA-F se unen a los receptores ILTR2 (LIR1) y ILTR4 (LIR2) que son receptores inhibidores de leucocitos. 

HLA-G: La molécula HLA-G pertenece a la familia de moléculas de

histocompatibilidad no clásicas y se caracterizan por un limitado polimorfismo y una distribución celular y tisular restringida al trofoblasto fetal y células del epitelio tímico. Esta molécula puede presentarse en siete isoformas distintas, codificadas por splicing alternativo, cuatro de ellas son proteínas unidas a membrana (HLA-G1, G2, G3 Y G4), y otras tres isoformas que son proteínas solubles (HLA-G5, G6 Y G7). Otras características de esta molécula son:

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Es reconocida por ciertos receptores inhibidores, tales como KIR2DL4, ILT-2 y ILT-4 y, en consecuencia posee, capacidad de inhibir la lisis mediada por células NK y ciertas células T.

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Está relacionada con la inducción de tolerancia materno-fetal. Se ha demostrado que la molécula HLA-G es capaz de inhibir la actividad de las células NK de los leucocitos de la decídua sobre los trofoblastos durante el primer trimestre de gestación



Parece participar en la vigilancia del sistema inmune frente a tumores y se ha descubierto un aumento en el nivel de la expresión de esta molécula en la superficie de las células infectadas por el HIV, que podría ser una forma del virus de escapar de la destrucción por el sistema inmune.

Familia de moléculas CD1. Los antígenos CD1 son glicoproteínas no polimórficas constituídos por una cadena pesada de 43-49 kDa que, en muchos casos, se asocia con la beta-2microglobulina (beta-2-m). Se ha definido como una molécula presentadora de antígeno presente en la mayoría de los mamíferos encontrándose tanto en las células dendríticas como en timocitos. Mientras que en ratones las moléculas CD1 pueden presentar péptidos y moléculas no peptídicas como glicolípidos a células T, en humanos sólo hay evidencia de presentación de antígenos no peptídicos de origen microbiano, generalmente a células T de

TCR restringido Las células T implicadas en el reconocimiento de antígeno presentado por CD1 son denominadas NKT. En humanos la familia de los genes de CD1 contiene 5 miembros: CD1A, CD1B, CD1C, CD1D y CD1E, que se agrupan en dos grupos en base a la similitud de la secuencia de aminoácidos entre ellas y entre especies. En general, las moléculas de CD1 se expresan predominantemente en timocitos y en algunas APCs derivadas de médula ósea como las células dendríticas. Se ha descrito que las células del epitelio intestinal expresan las moléculas de CD1d. GENÉTICA DEL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Como ya se ha dicho, los genes que codifican las moléculas cuya estructura y función hemos estudiado, se encuentran agrupados en el genoma formando el Complejo Mayor de Histocompatibilidad que se extiende aproximadamente 2-3 centimorgans (aproximadamente 6 4x10 pares de bases) y en el humano contiene al menos 50 genes distintos. Este grupo de genes se encuentra organizado de forma diferente en las distintas especies, conociéndose con precisión la organización genética del MHC en el hombre, sistema HLA, y el ratón, sistema H-2. Recientemente se ha propuesto una nueva taxonomía para clasificar los distintos genes que codifican las moléculas de histocompatibidad,(Tabla 5.2) Complejo Mayor de Histocompatibilidad en el hombre. El Complejo Mayor de Histocompatibilidad en el hombre está constituido por un grupo de genes situado en el brazo corto del cromosoma 6. El complejo mayor de histocompatibilidad humano es donde se codifican los loci que de los distintos antígenos HLA clase I y II (Figura 5.6). Entre los de clase I se encuentran los genes que codifican las cadenas a de los antígenos HLA-A, HLA-B y HLA-C y entre los de clase II se encuentran los pares de genes que codifican las cadenas alfa y beta de los antígenos HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. Este grupo de genes se heredan de acuerdo con las leyes de Mendel, como caracteres codominantes simples. La región genética de un cromosoma que contiene todos los genes HLA (a excepción de los que codifican la beta-2-microglobulina) se denomina haplotipo HLA(Figura 5.7). Así pues un haplotipo HLA incluye los genes clase I: HLA-A, HLA-B y HLA-C y los genes clase II: HLA-DR, HLA-DQ y HLA- DP. y otros loci que codifican moléculas implicadas en el procesamiento de péptidos como son los genes TAP cuyos productos están implicados en la transferencia de péptidos del citosol al retículo endoplásmico y los genes LMP que codifican componentes del proteosoma responsable de transformar proteínas en péptidos que posteriormente serán presentados en la superficie celular. Asimismo en esta región se encuentran los genes que codifican algunos factores del complemento, la enzima 21-hidroxilasa, la citocina TNF-alfa y otros genes y pseudogenes con homología estructural con los genes clase I y clase II con limitado polimorfismo y cuya función aun se encuentra insuficientemente aclarada (Figura 5.8). . La existencia de estos diferentes loci fue demostrada inicialmente por la aparición espontánea de recombinaciones entre los mismos o la existencia de líneas celulares mutantes, con pérdidas de uno o varios loci y ha sido confirmada a lo largo de los últimos años por el empleo de técnicas de biología molecular que han permitido aislar y secuenciar estos genes. Gracias a estas técnicas de biología molecular se ha descubierto la existencia en esta región de numerosos genes y pseudogenes pero solamente una minoría tienen estructura clase I o clase II mientras que la mayoría no están relacionados estructuralmente. Cada célula del organismo, (excepto las células germinales), poseen un haplotipo procedente del padre y otro de la madre. La mayoría de los genes del MHC son altamente polimórficos, es

decir pueden ser estructuralmente diferentes entre individuos de la misma especie. No obstante, como se vio al hablar de la estructura, existen zonas muy conservadas, prácticamente idénticas en todos los individuos y zonas altamente variables. Cada especificidad definida en la superficie celular representaría un alelo diferente a nivel genómico. Como se muestra en la tabla 5.3, se han descrito numerosos alelos para los diferentes loci HLA. Dado que cada individuo posee dos de cada uno de estos alelos, el número de combinaciones teóricas posibles en la población considerada en su conjunto es muy alto. A menudo se describen nuevas especificidades asociadas a otras previamente establecidas. Estas nuevas especificidades se suelen denominar especificidades subtípicas que aparecen por división de otras anteriores y a las antiguas especificidades supertípicas. Así por ejemplo, las especificidades HLA-B51 y HLA-B52 se consideran como productos de la división del antígeno HLA-B5. De hecho la secuenciación de los genes HLA ha demostrado que el polimorfismo que es detectado a nivel serológico es sólo una parte del que se encuentra a nivel genómico. Así por ejemplo existen numerosos subtipos de HLA-A2 y numerosos subtipos de HLA-B27. Ello ha hecho que se establezca un nuevo sistema de nomenclatura para los diferentes alelos HLA que utiliza la letra del loci seguida de 4 dígitos tal como se muestra en el Apéndice. Los dos primeros dígitos serían los de la especificidad serológica y los otros dos indicarían la especificidad detectada por secuenciación. Los haplotipos heredados de cada padre van a determinar el genotipo del hijo, es decir, el genotipo de éste será la suma de un haplotipo procedente de padre y otro procedente de la madre. En la Figura 5.9 se ilustra gráficamente todo lo anteriormente expuesto. En una familia determinada en la que el padre tiene los haplotipos (a) = A2, B8, Cw1, DR1 y (b) = A3, B7, Cw3, DR4 y la madre los haplotipos (c) = A2, B7, Cw2, DR2 y (d) = A11, B13, Cw3, DR5 los hijos podrán heredar cuatro combinaciones distintas de estos haplotipos, siendo (a,b), (b,c) y (b,d) los posibles genotipos resultantes. Tras la secuenciación completa del Complejo Mayor de Histocompatibilidad en el 1999 se conoce que esta región la forman más de 200 loci, muchos de los cuales aún son funcionalmente desconocidos, aunque posiblemente la mitad juegue un papel en la función del sistema inmune. Probablemente el estudio del polimorfismo de esta región ayudará a comprender por qué unas personas desarrollan unas enfermedades y otras no, en todo caso este avance será una importante herramienta para el estudio filogenético, la biología y la evolución de las familias de multigenes, las poblaciones y la enfermedad. Loci HLA-A, B, C. La región que codifica las moléculas de clase I está dividida en tres loci, conocidos como A, B y C, que codifican tres tipos de cadenas pesadas para las distintas moléculas de clase I. Algunos de estos genes han sido estudiados mediante técnicas de hibridación de DNA y se ha demostrado que se encuentran divididos en exones e intrones, encontrándose una estructuración homóloga a los genes que codifican la b-2 microglobulina, las inmunoglobulinas y otros tipos de proteínas. El prototipo de gen que codifica moléculas de clase I, se encuentra dividido en 8 exones, cada uno de los cuales, se corresponde a cada dominio estructural de la molécula. Si bien se conoce con precisión la función de estas tres familias de antígenos de histocompatibilidad de clase I expresados en la superficie celular, se ha demostrado la existencia de otros genes que también codifican otros antígenos HLA de clase I con menor polimorfismo y cuya expresión es variable, tanto en su distribución tisular como en la densidad en la membrana celular. Entre estos genes se incluyen: HLA-E, HLA-F y HLA-G.

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Gen HLA-E: Este gen presenta una secuencia parecida a la molécula Qa1 murina, que une péptidos hidrofílicos de la secuencia leader de las moléculas MHC clásicas. Se expresa en pequeñas cantidades en la superficie de la célula, y su expresión está regulada por la presencia de las otras moléculas de histocompatibilidad

presentadas

en

la

superficie

celular

y

es

TAP

dependiente. 

Gen HLA- F: Este gen es muy similar en estructura y secuencia a los genes de las moléculas clásicas. Se trancribe en una gran variedad de células y tejidos presentando un polimorfismo limitado.

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Gen HLA-G: Este gen presenta la estructura típica de la HLA clase I y su expresión parece estar restringida a la placenta y se asocia con funciones de caracter tolerogénico..

Región HLA-D En la región D se localizan los genes que codifican las moléculas HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. Su análisis bioquímico demuestra que se trata de moléculas de clase II compuestas, como ya hemos indicado, por una cadena a y otra b. Las moléculas HLA-DR y HLA-DQ se estudiaron por serología y los antígenos HLA-DP fueron inicialmente definidos por estudios funcionales, mediante estimulación secundaria de linfocitos previamente sensibilizados (PLT). El empleo de técnicas de biología molecular han permitido el aislamiento y secuenciación de los genes de esta región, de manera que hoy se conoce con precisión que la región D posee un elevado número de genes. Los genes de la familia DR comprenden un gen DRA que codifica la cadena DRalfa y posee escaso polimorfismo y al menos cuatro genes DRB (DRB1, 3, 4, 5) que codifican cadenas DRbeta que contienen gran polimorfismo. Se han descrito otra serie de pseudogenes DRB (DRB2, 6, 8) sin conocerse aún su función y expresión. La cadena proteica DRalfa puede combinarse (Figura 5.10). con las diferentes cadenas beta codificadas por los genes DRB dando origen a las moléculas de clase II portadoras de las especificidades HLA-DR (la unión de los productos de los genes HLA-DRA y HLA-DRB1 y las especificidades HLA-DRw51, 52 y 53 (la unión de los productos de los genes HLA-DRA y HLA-DRB5, DRB3 o DRB4, respectivamente). Tanto las familias DQ como DP contienen dos pares de genes, es decir dos genes a y dos genes b, próximos entre sí y todos polimórficos. Sólo uno de estos pares, DQA1 y DQB1 y DPA1 y DPB1, codifican las cadenas a y b de las moléculas de clase II HLA-DQ y HLA-DP respectivamente. Los otros 2 pares de genes DQA2, DQB2 y DQB3 (pseudogen) y DPA2 y DPB2 poseen un limitado polimorfismo y no se encuentran expresados en la superficie celular. Además existe otra subregión que contiene un gen a, denominado DNA, y un gen beta, DOB, que podrían codificar un nuevo tipo de moléculas clase II.

Por otra parte también se han localizado una nueva pareja de genes, HLA-DM, no polimórficos, que se encuentran implicados en el proceso de procesamiento y presentación de antígeno como se expone en el próximo capítulo. Cada uno de estos genes esta estructurado en secuencias de intrones y exones relacionados con los dominios estructurales de la proteína codificada por ellos. Tipaje HLA. Se denomina tipaje HLA, al análisis llevado a cabo en el laboratorio para conocer los alelos HLA de un determinado individuo mediante métodos serológicos, análisis de genes por biología molecular (Figura 5.11). y métodos celulares. El tipaje HLA tiene especial interés en las siguientes situaciones: 

Estudio de la asociación con distintas formas clínicas de una enfermedad. Por ejemplo la diabetes insulino-dependiente está asociada a DR3 y DR4 y

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En trasplantes de órganos y medula ósea y

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Estudios de filiación familiar.

La mayoría de los genes del HLA son altamente polimórficos, como ya se explicó en el apartado anterior, y cada especificidad definida en la superficie celular representaría un alelo diferente a nivel genómico. Así se han descrito numerosos alelos para los diferentes loci HLA. Método Serológico. El método serológico más comúnmente utilizado es el test de microlinfocitotoxicidad, que se realiza enfrentando una población de linfocitos a una batería de sueros o anticuerpos monoclonales que son específicos para cada uno de los antígenos posibles. Posteriormente se añade complemento de tal manera que en los pocillos en los que se encuentre el antisuero específico para los antígenos de un individuo determinado, se producirá la lisis celular que podrá ser visualizada al microscopio. Para visualizar la lisis, actualmente se usan una técnica fluorescente con una mezcla de anaranjado de acridina y bromuro de etidio. El bromuro de etidio se fija al ADN de las células muertas (que aparecen de color rojo) y desplaza al anaranjado de acridina que tiñe a las células vivas de color verde brillante. Los cultivos se incuban y se hacen las lecturas de viabilidad celular (Figura 5.12). . Para llevar a cabo la tipificación de los antígenos de clase II se utilizan poblaciones purificadas de linfocitos B, ya que en estas células los antígenos de clase II se expresan más abundantemente que en los linfocitos T (de hecho, las células T expresan cantidades significativas de moléculas MHC de clase II sólo cuando están activadas). Los linfocitos B se separan haciendo pasar suspensiones de linfocitos totales a través de una columna empaquetada con fibra de nylon. Por sus propiedades adherentes, las células B se retienen en el nylon y posteriormente se despegan por manipulación mecánica de la columna de la que previamente se han eliminado, por lavado, las células no adherentes. Existe a su vez, otro método más utilizado y menos perjudicial para la separación de las células B que consiste en el uso de microesferas magnéticas acopladas a anticuerpos contra antígenos específicos de estas células (el antígeno CD19, por ejemplo). La sangre se mezcla con las esferas y luego éstas se separan en un campo magnético (con un imán) y se lavan para proceder a su tipificación por serología. Métodos de Biología Molecular: Las técnicas de biología molecular más usadas (no las únicas) para detectar polimorfismos en el ADN utilizan los métodos de:

a. Secuenciación directa del ADN. b. Análisis del tamaño de los fragmentos de restricción del (RFLP restriction fragment lenght polymorphism). c. Reacción en cadena de la ADN polimerasa (PCR, polymerase chain reaction).

ADN

La secuenciación directa del ADN no es práctica para su uso rutinario. Actualmente son utilizadas técnicas de PCR-SBT en la que se secuencian los fragmentos amplificados mediante PCR. La técnica de RFLP incluye la fragmentación del ADN con enzimas de restricción, la separación electroforética de los fragmentos, la transferencia de los fragmentos separados a membranas de nylon, la hibridación con sondas, de secuencias conocidas, marcadas con isótopos radiactivos o con enzimas y la detección del producto por autorradiografía, quimioluminescencia o colorimetría. La técnica de PCR permite amplificar segmentos particulares de ADN en pocas horas (ver capitulo sobre métodos inmunológicos). Las técnicas que actualmente más se utilizan para realizar tipaje HLA son PCR-SSO y PCRSSP. La PCR-SSO (Figura 5.13). que se basa en: amplificación de la zona polimórfica del ADN por PCR, hibridación con oligonucleótidos específicos de secuencia (SSO) fijados a membranas de nylon. Con la técnica de PCR-SSP (Primers específicos de secuencia) sólo se consigue amplificación en aquellas muestras en las que los primers reconozcan el alelo para los que son específicos por lo tanto lo único que se hace es probar la existencia o no de los productos amplificados. Métodos Celulares También existe la posibilidad de detectar los antígenos de histocompatibilidad por métodos celulares mediante el cultivo de mezclas de linfocitos, del donante y del receptor. Esta reacción que se conoce como CML (cultivo mixto de linfocitos), se basa en la propiedad que tienen los linfocitos de proliferar cuando se incuban en presencia de linfocitos portadores de antígenos HLA diferentes. Los linfocitos con antígenos idénticos no estimulan las respuestas proliferativas entre ellos. La proliferación celular se puede cuantificar utilizando diferentes técnicas, aunque 3 la más común mide la incorporación de timidina tritiada ( HT) por las células proliferantes. En una variante de la reacción, denominada CML unidireccional, las células estimuladoras se tratan previamente con mitomicina C para inhibir su capacidad de división celular, sin modificar su viabilidad (la mitomicina se combina con los husos cromáticos evitando la segregación cromosómica y la mitosis) y así las células sólo funcionan como antígeno. Los cultivos de células mezcladas se mantienen de 72 a 96 h antes de adicionar la timidina radiactiva. De 4 a 18 horas después las células se colectan, se lavan y se procesan para determinar la cantidad 3 de radiactividad incorporada. La incorporación de HT se establece midiendo la emisión de radiación beta en un contador de centelleo y los resultados se expresan como cuentas por minuto (cpm). Regulación de la expresión de los genes del MHC En la parte 5' no traducida de los genes se encuentran las áreas reguladoras (llamadas elementos cis) constituidas por el promotor (área estrictamente necesaria) y los aumentadores e inhibidores que modulan la expresión basal de los genes. El promotor suele estar situado a una distancia de unas 300 bases desde el inicio de la transcripción, mientras que los aumentadores o inhibidores se encuentran a distancias variables. Sobre estas áreas cis se fijan unas proteínas llamadas factores de transcripción (elementos trans) que son necesarios para que se active la polimerasa II, enzima que inicia la transcripción. En muchos casos, la inducción de la expresión de los genes se debe a modificaciones post-

transtraducionales de estas proteínas como son la fosforilación o la glicosilación. Hasta ahora no se conoce el mecanismo exacto de la expresión de los genes de clase I y II aunque se han descrito algunos de sus elementos cis y trans. Los genes de clase I y beta-2-microglobulina tienen regiones cis muy parecidas y su expresión esta coordinada. Se han detectado tres regiones cis en el promotor a las que se unen factores de transcripción y que se llaman aumentadores A y B y entre ellos el IRE (elemento de respuesta al interferón) (Figura 5.14). Además, existen dos inhibidores en dos regiones a unas -700 y -400 bases. Sobre las áreas cis se unen factores de transcripción que no son específicos del promotor de clase I, sino que regulan muchos genes. En la región I del aumentador A se une RXRb que es un elemento de la familia de los receptores de la hormona tiroidea y del ácido retinoico y que se une a AP-1 (Proteína Activadora 1) que es un complejo de los oncogenes jun y fos originando un heterodímero que aumenta su afinidad por el DNA. En la región II del aumentador A se une el NF-kB (Nuclear Factor-kB). En la región IRF se unen proteínas que se inducen por efecto del interferón y que se fosforilan por una tirosina quinasa. Por último, en el aumentador B parece que se unen proteínas del grupo AP-1 que responde a la inducción con AMP cíclico. En el promotor de todos los genes de clase II y de todas la especies descritas, existen tres áreas con secuencias que tienen una gran homología entre los genes y que se denomina X, Y y W separadas entre si por unas 20 bases. Estas áreas son esenciales para la transcripción (elementos cis) y sobre ellas se unen una serie de factores de transcripción. La caja Y contiene una secuencia CCAAT sobre la que se une el NFY (Nuclear Factor Y) compuesto por dos proteínas A y B, ambas se requieren para una unión eficiente al DNA. Sobre la caja W se une un factor no caracterizado hasta ahora y sobre la caja X, dependiendo del extremo 5'(X 1) se han descrito proteínas RF-X y NF-X y sobre el extremo 3'(X2) se unen hXBP y el complejo AP-1 (fos-jun) aunque estas interacciones con el DNA no están muy claras. La distancia crítica que separa estas cajas sugiere que los factores de transcripción que se unen a ellas interaccionan dando lugar a que se inicie la transcripción. Sin embargo, no sabemos que es lo que hace que se induzca clase II por efecto del gamma-interferón o porque en algunos casos la inducción de clase II sea constitutiva. Otros genes del sistema HLA. Situados en el complejo HLA se encuentran un grupo de genes que codifican tanto el componente Bf de la cascada alternativa del complemento, como los componentes de la vía clásica C2 y C4 que se estudian en el capítulo dedicado al complemtno. Otros genes de esta región y de interés en la respuesta inmune son los genes que codifican 1. las formas alfa y beta del factor de necrosis tumoral (TNF-alfa). 2. HSP (Heat Shock Protein). 3. lmp que codifican los componentes del proteosoma y 4. TAP1 y 2 que son proteínas transportadoras. Estas estructuras como veremos en el capítulo 6, poseen una gran importancia en la función de procesamiento antigénico asociada a las moléculas del MHC. También dentro del sistema HLA e íntimamente relacionado con los genes anteriores, se encuentran los genes que codifican la enzima 21-hidroxilasa, que participa en el metabolismo de ciertas hormonas sexuales. Complejo Mayor de Histocompatibilidad en el ratón. El complejo mayor de histocompatibilidad en el ratón (sistema H-2) se ha llegado a conocer después de diversos procesos de recombinación genética de ratones hasta la obtención de cepas recombiantes (Figura 5.15). Se localiza en el brazo corto del cromosoma 17 e incluye varios loci, entre ellos los K, IA, IE, S y D. Como en el humano, cada locus contiene uno de

varios genes alternativos. Los genes K y D codifican para los antígenos de clase- I (K y D), equivalentes a los humanos HLA- A y HLA-B. Los loci IA e IE (análogos a los antígenos D en el humano) contienen a los genes Aa/Ab y Ea/Eb que codifican a los antígenos MHC de clase III (Ia e Ie). Dentro del complejo H-2 también está insertada una región S donde se encuentran los genes correspondientes a los antígenos de clase III (C2 y C4). Como en el humano, los genes H-2 se heredan en bloque (como haplotipos), son codominantes y se segregan siguiendo las leyes de Mendel (Figura 5.16). En la tabla 5.4 se muestran los distintos haplotipos H-2 de las cepas murinas mas comunes y en la figura 5.17. se compara la organización del complejo de histocompatibilidad murino con los de las diferentes especies. MECANISMOS DE GENERACION DEL POLIMORFISMO El polimorfismo del MHC es el resultado de un largo proceso de evolución a lo largo de miles de millones de años como consecuencia de la presión evolutiva ejercida por los agentes infecciosos. Para la generación de este elevado polimorfismo el MHC ha utilizado diferentes mecanismos que han contribuido de diferente forma a la creación de nuevos alelos. Así, algunos son el resultado de mutaciones puntuales mientras que otros proceden de la combinación de secuencias completas entre diferentes alelos, bien mediante un proceso derecombinación génica o bien mediante el proceso denominado conversión génica, según el cual una secuencia es reemplazada por otra semejante de un gen homólogo. La recombinación entre alelos del mismo locus parece ser el mecanismo más frecuentemente utilizado para la creación del polimorfismo y así muchos alelos diferentes pueden proceder de procesos de recombinación repetidos a partir de un pequeño número de genes ancestrales. La existencia de este proceso evolutivo apoya que el polimorfismo es esencial para la función de los antígenos de histocompatibilidad. FUNCION MOLECULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD Las moléculas de histocompatibilidad presentes en las células del organismo son marcadores para las células del sistema inmunitario de "lo propio" (el yo inmunológico) e intervienen de manera fundamental en la educación tímica de los linfocitos T (Tabla 5.5). La función biológica de las moléculas de histocompatibilidad es la de presentar péptidos antigénicos para la activación de los linfocitos T. Los linfocitos T que reconocen moléculas HLA clase I y su péptido pertenecen a la subpoblación citotóxica. Las células T que reconocen moléculas HLA clase II en su la mayoría tienen función reguladora produciendo citocinas. Las moléculas de histocompatibilidad de un individuo son antigénicas para otro y por lo tanto activan el sistema inmune (rechazo de trasplantes). HLA Y ENFERMEDAD Desde hace varias décadas se sabe que el padecimiento de ciertas enfermedades se asocia con el incremento en la frecuencia de un determinado alelo HLA. Esta asociación cuando tiene un valor estadísticamente significativo, se viene considerando como un factor de susceptibilidad o un marcador de riesgo a padecer la enfermedad, que puede cifrarse estadísticamente como “riesgo relativo” (RR) y da una idea de la mayor o menor probabilidad que tiene un sujeto a padecer una determinada enfermedad si presenta dicho marcador o alelo HLA con respecto a aquellos individuos que no lo tienen. Efectivamente, a pesar del gran polimorfismo de las moléculas HLA y de la ampliación del número de subtipos alélicos de clase I y de clase II, hoy se conocen múltiples enfermedades que están asociadas a clase I y otras a clase II (Tabla 5.6). El número de enfermedades asociadas a alelos de clase I es menor que el de las asociadas a clase II.

Las causas de esta asociación HLA y enfermedad no es conocida completamente. Por ejemplo en espondilitis anquilopoyética (EA), enfermedad invalidante y que afecta a las articulaciones de la columna principalmente, y en la que se ha descrito una fuerte asociación con HLA-B27, se ha podido observar que ciertos péptidos antigénicos de origen articular serian capaces de formar un complejo con HLA-B27 específicamente que induciría fenómenos de autoinmunidad, bien por generar en la molécula B-27 modificaciones conformacionales que la harían no ser reconocida como propia, bien por generar complejos HLA-péptido con cierta similitud con antígenos bacterianos que provocarían reacciones cruzadas autoagresivas en individuos HLAB27, previamente sensibilizados a tales antígenos bacterianos. En el caso de la diabetes mellitus insulin dependiente (DMID), enfermedad que cursa con una destrucción selectiva de los islotes de Langerhans del páncreas, con infiltración linfocitaria, se considera que es el resultado de una respuesta autoagresiva frente a antígenos presentes en la membrana celular mediada por linfocitos T.