• Author / Uploaded
• Roman Salazar

Citation preview

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 1

INFORME COMPONENTE PRÁCTICO BIOTECNOLOGÍA ALIMENTARIA FERMENTACION LACTICA

PRESENTADO POR: ROMAN YAMITH SALAZAR CUAICHAR COD: 1085293243

TUTOR: FEDRA LORENA ORTIZ

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA INGENIERIA DE ALIMENTOS NOVIEMBRE DEL 2019

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 2

NORMAS GENERALES DE HIGIENE Y SEGURIDAD

Componente Practico in situ – Laboratorio Biotecnología, Universidad Nacional Abierta y a Distancia – UNAD

Objetivo Conocer los principales equipos con los cuales se trabaja en el desarrollo de la practica dentro del laboratorio y conocer la aplicación de las normas de higiene y seguridad que se deben tener en cuenta en el desarrollo del componente práctico. Como paso preliminar al desarrollo del componente practico se adquiere la respectiva información por parte del docente de laboratorio en las medidas de Seguridad e Higiene con el propósito de informar sobre los distintos riesgos de accidentes y enfermedades profesionales que pueden presentarse en el ambiente de trabajo, y quien sugiere un conjunto de medidas preventivas para evitar o minimizar dichos riesgos. Las normas básicas de seguridad son un conjunto de medidas destinadas a proteger la salud de todos los implicados en el proceso de elaboración o fabricación de alimentos y están destinadas a prevenir accidentes y promover el cuidado y prevención de los equipos dentro del proceso de la planta de fabricación de los productos a realizar en la práctica de laboratorio

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 3

Normas de Higiene    

      

Mantener una limpieza personal y aplicar buenas prácticas higiénicas durante el desarrollo del componente practico Aplicar un lavado en las manos con agua y jabón, frotándolas cada vez que manipule sustancias corrosivas dentro del laboratorio Limpiar las uñas, antes de iniciar su jornada de trabajo, y mantenerlas cortas, limpias y sin esmaltes. Eliminar el uso del maquillaje (pintura de labios y ojos) mientras se encuentren el área de proceso ya que se utilizan tapabocas, los cuales deben permanecer blancos y limpios. No ingerir alimentos, ni beber, ni escupir, ni masticar chicles dentro de los baños y planta en horas laborables. Mantener su ropa de trabajo limpia y utilizarla correctamente. Mantener el cabello recogido y cubierto totalmente con el gorro. Mantener el delantal limpio y usarlo correctamente para evitar contaminación de la persona y del alimento, así como potenciales accidentes. Usar el tapabocas de manera correcta y permanente en el proceso. Mantener los guantes limpios, secos y en buen estado, para evitar enfermedades en las manos. El Personal masculino debe tener el cabello corto, usar su gorro respectivo y estar rasurado.

Normas de Seguridad       

No fumar en las áreas internas ni externas de las instalaciones de la planta. No usar prendas (anillos, relojes, cadenas,) durante el desarrollo del componente practico No trabajar bajo efectos de bebidas alcohólicas, ni ingerirlas en las instalaciones del laboratorio. Utilizar correctamente los implementos de seguridad. Cuidar los equipos y utensilios de trabajo. Así como las instalaciones del laboratorio, esto en beneficio de todos. Identificar los equipos relacionados en el transcurso del trabajo y de igual forma conocer y tener en cuenta las señalizaciones de peligro y prevención Desechar los residuos de agentes contaminantes en los recipientes adecuado y según indicaciones del docente o laboratorista del componente practico.

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 4

PRACTICA No. 2 – FERMENTACIÓN LÁCTICA Marco teórico Según el Instituto ecuatoriano de normalización(INEN), encargado de requisitos de elaboración de productos industriales Define qué: El yogurt es un producto coagulado obtenido por fermentación láctica de la leche o mezcla de esta con derivados lácteos, mediante la acción de bacterias lácticas, lactobacillus bulgaricus y streptococcus thermophilus, pudiendo estar acompañadas de otras bacterias ácido lácticas que por su actividad que le confiere las características al producto terminado; estas bacterias deben ser viables desde su inicio y durante toda la vida del producto. puede ser adicionado o no ingredientes y aditivos indicados en esta Norma. (INEN 2395:2009). Así mismo Gonzales, A. 2006. Define que El yogur es la leche fermentada por cepas bacterianas de Streptococcus salivarus ssp. thermophilus y Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Por medio del proceso de fermentación se desarrolla la acidez del yogur y otras sustancias que le dan las características a este producto. La acidez es uno de los atributos más importantes en la calidad del mismo. Según Mateos (2005), el cultivo para el yogur debe aportar a la leche las bacterias acido lácticas que son responsables del proceso de acidificación. La fermentación del yogur se debe al trabajo de dos microorganismos Streptococcus y Lactobacillus, que se desarrollan en simbiosis. Tanto el Streptococcus como el Lactobacillus pertenecen al grupo de las bacterias lácticas homofermentativas, es decir solo forman indicios de otras sustancias como diacetilos, acetaldehído, etc. junto con ácido láctico que representa del 90 al 97% de la lactosa fermentada. El método de control del cultivo es muy importante en la manufactura del yogur y es por esta razón que el cultivo madre debe ser mantenido en óptimas condiciones antes de ser inoculado a la leche (Mateos, 2005). La leche siendo la materia prima en especial debe ser de alta calidad, el fabricante debe utilizar pruebas de selección para evitar el uso de leches o de otros ingredientes que pueden contener antibióticos residuales u otros materiales bacteriostáticos a los cuales son extremadamente sensibles los cultivos de yogurt. La buena calidad del producto terminado demanda un control muy estricto de la composición de la mezcla. Donde la legislación lo permite, se pueden emplear estabilizadores, cuajo, gelatina, calcio (en forma de caseinatos, lactatos, gluconatos, etc.), carragenina y otros productos comestibles para dar más cuerpo. Después de estandarizar la composición de la mezcla, se clarifica, pasteuriza y homogeniza, adicionando a continuación el inoculo en una concentración que va del 2-2.5%, se incuba a 43-45°C durante un tiempo de 3-4 horas, enfriando finalmente a 5-8°C (el yogurt así preparado permanece en buenas condiciones durante 7-10 días en refrigeración. (Guía componente practico in situ, UNAD; 2019)

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 5

Materiales y métodos Lugar de ejecución El presente trabajo del desarrollo de componente practico se ejecutó en las instalaciones del laboratorio físico químico, Laboratorio especializado de la universidad de Nariño UDENAR con la asistencia de estudiantes de la Universidad Nacional Abierta y a Distancia – UNAD. Materiales 

Insumos



Leche entera



Leche en Polvo



Gelatina en polvo sin sabor



Inoculo – Fermento yogurt sin sabor Colacteos



Inoculo – Fermento Laboratorio – Sepa de Cacao

Equipos e instrumentos 

Bureta de 50 ml graduada de 0,1 ml



soporte para bureta



Pipeta de 10 ml.



Matraces de 50 ml



Termómetro.



Ollas de aluminio industrial



Tubos de ensayo estériles



Solución de NaOH 0.1%N.



Solución indicadora de fenolftaleína. 1%



Agitador de vidrio, estériles



Estufa.



Beaker de 100 ml, estériles



Beaker de 1000 ml, estériles

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 6

El trabajo Practico se desarrolló siguiendo el diagrama mostrado a continuación:

Diagrama de procedimiento PRACTICA No. 2 – FERMENTACIÓN LÁCTICA – Biotecnología alimentaria

Procedimiento Selección de leche Como paso preliminar a la práctica se realiza la respectiva selección de la leche fresca, dentro de ese punto se realiza un análisis organoléptico del producto, dicha leche a trabajar cumple con características adecuadas en cuanto a color, olor, sabor. Se toman 200 ml que corresponden al 100% en porcentaje a trabajar, dicha cantidad se selecciona en el Baker de 1000 ml. Adición de leche en polvo A la leche fresca previamente seleccionada se adiciona 12 gr de la leche en polvo (6%), con ayuda de materiales y equipos del laboratorio anteriormente nombrados (olla, agitador de vidrio, estufa y termómetro) se somete la mezcla a calentamiento a 82-85°C durante 30 minutos. En este punto fue importante tener el respectivo control de temperatura de pasteurización como una variable clave de control en el proceso de elaboración del yogurt. Adición de gelatina al 1 % Dentro del proceso de evolución de la temperatura de la mezcla Se agrega gelatina al 1% previamente disuelta en un mínimo de agua caliente y se mezcla

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 7

perfectamente bien, en este paso fue importante la mezcla y dilución de la gelatina sin sabor ya que al ser sometida a tto térmico y al no estar disuelta se pueden generar grumos y cristales en el producto. Enfriamiento Una vez la mezcla cumple con el parámetro de tiempo y temperatura de pasteurización esta mezcla así preparada se enfría hasta 45°C, un factor importante en este tratamiento térmico de la leche es importante porque controla el grado de desnaturalización de las proteínas del suero, lo cual afecta la estructura del gel del yogurt esto además estimula el crecimiento de microorganismos indicadores. Inoculación La leche enfriada a 45 °C es inoculada con 20% de cultivo iniciador láctico. Debemos tener en cuenta que en este procedimiento se utilizaron dos indicadores (fermento yogurt sin sabor Colacteos y Fermento Laboratorio – cepa de Cacao) en cada fermento se utilizó el 2% (20 ml – con ayuda de la pipeta) en porcentaje al peso inicial de la leche fresca. Incubación por 4 Horas Cada una de Las mezclas inoculadas se vierten al recipiente (frasco estéril de 1 litro) para incubar a 43-45°C durante 4 horas o bien hasta que la mezcla haya alcanzado un pH de 4,6 (equivalente a una acidez de 0.9% expresada como ácido láctico) dicho proceso se lleva a cabo con la ayuda de la incubadora del laboratorio. Lectura de Acidez Cada hora Con el propósito de establecer la curva de acidificación para la determinación de la acidez del yogur en el transcurso del proceso se tomaron una serie de datos tomando en cuenta el tiempo, la temperatura y determinando la acidez expresada como porcentaje de ácido láctico; Con intervalos de una hora tome alícuota de 2 ml para titular acidez, adicione 50 micro litros de fenolftaleína. Y se procede a realizar la Titulación con NaOH 0.1N hasta una coloración rosada muy tenue que persista de 15 a 30 segundos posterior a esto se registran los datos el volumen empleado en cada titulación

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 8

Resultados y Discusión Análisis organoléptico inicial Análisis organoléptico - muestra de leche

Color Blanco, más o menos amarillento según.

Aspecto Viscoso, opaco, mate.

Olor Poco acentuado, pero característico del animal.

Sabor Ligeramente azucarado, sensación en boca agradable.

Observaciones: Leche que cumple con características óptimas para realizar el proceso de practica dentro del laboratorio

Determinación y Lectura de Acidez mediante titulación Muestra 1 Determinación de Acidez muestra 1 Hora NaOH ° Dornic Gastado Inicial 17 ml 15.3 ° Hora 1

38 ml

34.2 °

Hora 2

56 ml

50.4 °

Hora 3

82 ml

73.8 °

Hora 4

109 ml

98.1 °

Cuadro de resultados – Análisis de acidez expresada en °Dornic mediante Titulación muestra 1 Fermento yogurt sin sabor Colacteos

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 9

Muestra 2 - Fermento Laboratorio Cepa Cacao Determinación de Acidez muestra 1 Hora NaOH ° Dornic Gastado Inicial 17 ml 15.3 ° Hora 1

25 ml

22.5 °

Hora 2

36 ml

32.4 °

Hora 3

49 ml

44.1 °

Hora 4

61 ml

54.9 °

Cuadro de resultados – Análisis de acidez expresada en °Dornic mediante Titulación muestra 2 fermento cacao

Cuadro comparativo muestra 1 y 2 Acidez expresada en °Dornic Hora de análisis Muestra 1 Muestra 2 Inicial 15.3 ° 15.3 ° Hora 1 34.2 ° 22.5 ° Hora 2 50.4 ° 32.4 ° Hora 3 73.8 ° 44.1 ° Hora 4 98.1 ° 54.9 ° Cuadro comparativo de análisis muestra 1 y 2 ° Acidez

Graficas

Grafico comparativo de la curva de fermentación de análisis muestra 1 y 2 ° Acidez

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 10

Grafico comparativo de la curva de fermentación de análisis muestra 1 y 2 ° Acidez

Anexos fotográficos

Registros Fotográficos - Practica Biotecnología Alimentaria Fermentación Láctica: Elaboración De Yogurt

En primera instancia es importante conocer e identificar la leche que fue sometida al proceso de practica en el laboratorio cumplió con los parámetros organolépticos lo que nos da un indicio clave para realizar lo concerniente al proceso de elaboración del yogurt y poder someter las dos muestras analizadas al proceso de fermentación con los dos tipos de fermento. Dentro de este análisis se obtuvo parámetros organolépticos como (color, olor, aspecto y sabor) Aunque dentro de esta práctica la leche no se la sometió a un análisis físico químico se pudo identificar que dicha leche no presento una contaminación por antibióticos o agentes químicos ya que al ser sometida al proceso de fermentación no hubo inhibición en el proceso de fermentación Como anteriormente se lo plasmo en el documento hemos trabajado con dos tipos de fermento (fermento yogurt sin sabor Colacteos y Fermento Laboratorio – cepa de Cacao)

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 11

Como se puede evidenciar en las gráficas plasmadas en el análisis, la muestra #1(fermento yogurt sin sabor Colacteos) presento una mejor curva de fermentación en comparación a la Muestra #2(Fermento Laboratorio – cepa de Cacao) por lo que en primera medida podemos concluir que es el fermento optimo en la elaboración del Yogur en comparación al fermento de la muestra 2 (Cacao). Como lo establece Gonzales, A. 2006 La acidez es uno de los atributos más importantes en cuanto al proceso de elaboración y producto final en el yogurt haciendo énfasis a calidad del producto final, es por eso importante tener en cuenta que las dos muestras fueron sometidas al análisis de acidez teniendo en cuenta los mismos parámetros o variables de control como lo son: Tiempo y temperatura de incubación que fue entre 42 – 45°. Y cada análisis de acidez fue registrada cada hora durante 4 horas en total Variables que son de gran importancia. De acuerdo con el análisis se identifica que existe una relación directamente proporcional entre el tiempo de incubación y la acidificación del producto en las dos muestras, los datos muestran un coeficiente de correlación positiva; es decir que a mayor tiempo de incubación mayor acidez a alcanzar. Por otro lado, se observa que la covariable, temperatura, tiene efecto sobre la acidificación y se estableció la curva de acidificación en las 2 muestras. Se puede concluir que se realizó un proceso optimo en cuanto a la variable de temperatura de incubación ya que como lo menciona Manat et al. (2004), La temperatura debe elegirse próxima a la temperatura Optima de desarrollo del S. thermophilus, es decir entre los 42 - 45ºC temperatura que está dentro del rango utilizado en nuestro proceso de práctica. Como bien se puede plasmar en el análisis grafico la muestra 2 (Fermento Laboratorio – cepa de Cacao) tuvo un crecimiento considerable pero reducido en comparación a la muestra 1; pueden existir múltiples causas por las que dicho fermento no obtuvo un crecimiento similar, una de ellas puede ser que él fermento de cacao no fue mantenido en óptimas condiciones de refrigeración o fue un fermento manipulado constantemente lo que podría ser un factor a considerar. Según Mahaut et al. (2004), algunos de los defectos en aspecto relacionados con la acidez son: temperatura excesiva de refrigeración del fermento o periodos largos de refrigeración siendo este también un factor o parámetro a tener en cuenta.

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 12

Conclusiones El tiempo y temperatura juegan un papel clave e importante en el proceso de fermentación del yogurt, dentro de la industria alimentaria se deben tener en cuenta estos parámetros para la optimización de procesos de elaboración de productos fermentados en la industria láctea. Las curvas de fermentación que se analizaron en el presente trabajo permiten comprender puntos clave en cada sepa analizada; Es importante tener en cuenta el cuidado del fermento (tiempo, refrigeración, entre otros) con el fin de optimizar el análisis y control de las sepas a analizar y obtener un resultado óptimo y concreto de cada fermento Dentro del proceso de análisis es importante tener en cuenta el registro de datos en los tiempos estipulados con el fin de obtener un análisis conciso de cada producto o sepa que se somete al análisis.

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 13

INFORME COMPONENTE PRÁCTICO BIOTECNOLOGÍA ALIMENTARIA EXTRACCION DE ADN BACTERIANO

PRESENTADO POR: MARTHA MARIBEL GRIJALBA COD: 59792550

TUTOR: FEDRA LORENA ORTIZ

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA INGENIERIA DE ALIMENTOS NOVIEMBRE DEL 2019

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 14

MARCO TEORICO

EXTRACCION DE ADN MICROBIANO En la actualidad, el estudio de la variación genética entre individuos, poblaciones y especies para explicar patrones y procesos ecológico-evolutivos se aborda mediante marcadores moleculares, segmentos de ADN con o sin función conocida que proporcionan inform ación sobre la variación alélica y permiten distinguir individuos (Schlötterer 2004). Estos marcadores se obtienen con técnicas como la PCR (por las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction) y secuenciación, que hacen posible analizar la variación en la molécula del ADN con un detalle sin precedentes (Schlöttlerer 2004; Hudson 2008). Los datos moleculares han permitido estudiar con mayor precisión los patrones de diversidad genética y su distribución; el comportamiento; la selección natural; las interacciones biológicas; la composición, funcionamiento y dinámica de comunidades microbianas; las relaciones filogenéticas, entre otros (Sunnucks 2000; Schlötterer 2004; Hudson 2008) La aplicación de técnicas moleculares inicia con la extracción de ADN y la obtención exitosa de datos confiables y reproducibles depende, en gran medida, de la extracción de ADN íntegro y puro. La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula. El ADN está constituido por dos cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Los nucleótidos están integrados por un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o citosina). La unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante enlaces fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la molécula. Las bases de cadenasopuestas se unen mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal (Figura 1). Los grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al ADN una carga neta negativa y lo hace altamente polar, características que son aprovechadas para su extracción. Los grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite disolver al ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molécula. Pero, en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y quedan expuestos los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unión con cationes como Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y permiten que el ADN precipite (Sambrook et al. 1989). Por otro lado, la carga neta negativa del ADN le permite unirse a moléculas y matrices inorgánicas cargadas positivamente (Nasón 1965, Travaglini 1973, Sambrook et al. 1989, Sinden 1994).

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 15

A lo largo del tiempo se han diseñado distintos protocolos con la finalidad de obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, así como garantizar la eliminación de inhibidores potenciales que dificulten el tratamiento posterior de la molécula. Los métodos tradicionales, desarrollados en los años 50, utilizan solventes orgánicos para separar a las proteínas del ADN y, una vez suspendido en la fase acuosa, aislarlo por precipitación con etanol. Estos métodos requieren preparar soluciones y la extracción puede tomar desde unas horas hasta varios días por los numerosos pasos que deben realizarse. En general, los protocolos tradicionales consisten de cinco etapas principales: homogeneización del tejido, lisis celular, separación de proteínas y lípidos, precipitación y redisolución del ADN.

Figura 1. Estructura del ADN. En la estructura helicoidal del ADN, las cadenas se unen por puentes de hidrógeno dos entre adenina y timina, tres entre guanina y citosina. El enlace fosfodiéster que une a cada nucleótido, se forma entre el fosfato (H3PO4) que se encuentra en el carbono 5 y el grupo hidróxilo (–OH) del carbono 3 de la desoxirribosa. Los grupos fosfato son la parte hidrofílica del ADN y tienen carga negativa.

A partir de los años 90 se introdujeron al mercado combos o kits de extracción que utilizan matrices inorgánicas compactas cargadas positivamente capaces de retener varios microgramos de ADN y separarlos del resto de las biomoléculas, permitiendo obtener un extracto libre de inhibidores. Los combos se venden en presentación de membranas de sílice o perlas magnéticas, las primeras están formadas por una resina y las segundas

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 16

consisten de un centro de hierro recubierto por resina (Guinn 1966, Dundass et al. 2008). La membrana está insertada dentro de un microtubo de polipropileno y las microesferas se encuentran suspendidas en una solución amortiguadora. Durante la extracción, el ADN cargado negativamente se adsorbe o une a la matriz selectiva de manera reversible y se mantiene unido a ésta durante la remoción de lípidos, proteínas y metabolitos secundarios, posteriormente la molécula se libera de la matriz.

Los combos también incluyen soluciones de lisis, unión y lavado que no contienen fenol ni cloroformo para extraer proteínas, tampoco requieren etanol para precipitar al ADN (Qiagen 2005, Invitrogen 2005). Los kits comerciales disminuyen la extracción a unas cuantas horas porque reducen el número de pasos del procedimiento y, utilizados bajo las recomendaciones de cada proveedor, garantizan una extracción de alta pureza ya que tanto la recuperación del ADN como la eliminación de contaminantes son muy eficientes (Qiagen 2005, Invitrogen 2005). La selección del método de extracción es un paso fundamental en las técnicas moleculares y depende del organismo bajo estudio, el tejido disponible y su estado de

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 17

conservación, la técnica que se aplicará posteriormente, así como la infraestructura de los laboratorios, los recursos económicos y tiempo para obtener resultados. Independientemente del método seleccionado es recomendable encontrar un equilibrio entre pureza y rendimiento de acuerdo a la aplicación posterior.

Materiales y métodos Lugar de ejecución El presente trabajo del desarrollo de componente practico se ejecutó en las instalaciones del laboratorio físico químico, Laboratorio especializado de la universidad de Nariño UDENAR con la asistencia de estudiantes de la Universidad Nacional Abierta y a Distancia – UNAD. Materiales: Reactivos



Sódiododecilo sulfato (SDS) al 10%



Solución salina EDTA (SSE)



Etanol 70% 10 ml



Alcohol isoamílico (grado analítico, 99.5%)

5 ml



Medio de cultivo: caldo LB (Luria Bertani)

100 ml



Solución de NaCl al 4M

100 ml

50 ml

Material microbiológico



Cepa de Escherichiacoli cultivo ONb

Equipos



Incubadora



Autoclave

5 ml

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 18



Centrifuga y microcentrifuga



Espectrofotómetro (λ : 600 nm)



Baño termostatado o Shaker con agitación



Balanza analítica



Mechero bunsen



Vortex



Baño de agua a 60 oC



Micropipetas 200 μl y 1000 μl



Puntas para micropipetas

Material de vidrio



Espátula



Gradillas para tubos de ensayo



2 Pipetas estériles (5 y 10 ml)



Pipeteador



4 Tubos de ensayo cónicos para centrifuga de 20 ml



12 Tubos de ensayo ( 10 ml)



14 Elenmeyer (250 ml)



Capilares de vidrio



2 Vaso de precipitado (250 ml)

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 19

Metodología:

En esta práctica se desarrolló la metodología para la extracción de ácidos nucleicos del microrganismo Escherichia coli; este procedimiento se basa en el rompimiento químico celular (lisis), utilizando dodecilo sulfato de sodio (SDS) y su purificación parcial con alcohol isoamílico. La purificación se realizará por el método fenol – cloroformo en el cual se retirarán la mayoría de contaminantes (mayoritariamente proteína). Los pasos necesarios para una correcta extracción del ADN mediante un procedimiento químico son: Paso uno (1): Lisis de las células: Las sales caotrópicas ayudan a romper la estructura tridimensional de macromoléculas como las proteínas consiguiendo su desnaturalización. La adición de un detergente como el SDS se requiere a menudo para eliminar las membranas. Paso dos (2): Degradación de la fracción proteica asociada al ADN: Se consigue mediante la adición de una proteasa o su precipitación con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sódico.

EXTRACCION DE ADN – PRACTICA LABORATORIO

1- Tomamos pipetas de micro litros de 1,5 ml con el mismo número de pares todos los tubos tienen el mismo valor y centrifugar

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 20

2-Se envasa el cultivo bacteriano en los tubos adicionando el líquido buffer y descartamos sobrante.

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 21

3-Adicionar 567 micro litros al sobrenadante más SPS Y detergente al 110%

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 22

2- Secar sin mezclar agregar 567 de TIX color blanco

3- Agregar 30 mm de SDS MAS PROTEINA K -9 Y homogenizar

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 23

4- Llevar a baño maría 65°C x 1 hora empieza de 9:3 hasta 10: 3 sacar enfriar luego adicionar cloruro de sodio llevar al CETAP 65% baño maría

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 24

5- Enfriar adicionar 700 mm de alcohol cloroformo más 150 mm de metilo mezcla y homogenizar centrifugar por 25 minutos a 1000 RPM revoluciones por minuto.

6- Mezclar homogenizar centrifugar x 25 minutos a 1000 rpm, revoluciones por minuto

CONCLUSIONES

Debemos realizar varios métodos para obtener la mayor cantidad de ADN bacteriano y de la mayor calidad para que el análisis de resultados sea el correcto. Las prácticas en laboratorio nos permiten visualizar de primera mano los procesos que se llevan a cabo en la aplicación de la biotecnología en los alimentos para poder afrontar nuevos retos en nuestras profesiones. Cabe recalcar que el desarrollo del protocolo para laboratorios nos permite lograr a plenitud los resultados esperados, es decir se deben aplicar antecedentes científicos para obtener resultados en nuestras investigaciones.

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIAS E INGENIERIAS 25

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Marulanda Olier, M., & Granados Conde, C. D. (2012). Elaboración y evaluación de una bebida tipo yogurth a base de lactosuero dulce fermentada con estreptococcus salivarus ssp. Thermophilus y lactobacillus casel ssp. Casel (Doctoral dissertation, Universidad de Cartagena). Marulanda Olier, M., & Granados Conde, C. D. (2012). Elaboración y evaluación de una bebida tipo yogurth a base de lactosuero dulce fermentada con estreptococcus salivarus ssp. Thermophilus y lactobacillus casel ssp. Casel (Doctoral dissertation, Universidad de Cartagena). Trujillo, M., Suárez, F., & Gallego, D. (1998). Fermentación láctica en contínuo a partir de suero dulce de leche desproteinizado. Revista Colombiana de Biotecnología, 1(1), 45-50. Quicazán, M. C., Sandoval, A., & Padilla, G. (2001). Evaluación de la fermentación de bebida de soya con un cultivo láctico. Revista Colombiana de Biotecnología, 3(2), 9299. Castañeda, Alexandra. (et. al.) 2004. Evaluación de varias técnicas de extracción de ADN de Cryptococcusspp. a partir de muestras ambientales. En “Biomédica” 24:324-331. Bogotá. 2004 Fraga Nodarse, Jorge. (et. al). Comparación entre 5 métodos para la extracción de ADN de triatomíneos: su utilización en la técnica de ADN polimórfico amplificado al azar. En Rev. cubana MedTrop 56 (3):208-213. 2004. MICORBIAL. La extracción y purificación del ADN para el análisis por PCR. Mitos y realidades, Núm. 3. Enero ‐ febrero de 2009. Muñoz, A. (2007). Microbiología. Madrid: Editorial Paraninfo. Palomino-Camargo C, González-Muñoz Y. Técnicas moleculares para la detección e identificación de patógenos en alimentos: Ventajas y limitaciones. Rev. Peru Med Exp Salud Publica. 2014;31(3):535–46.