• Author / Uploaded
• Tabitha

Citation preview

BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA 211619

ACTIVIDAD INFORME COMPONENTE PRÁCTICO

Presentado por: SHIRLY PAOLA CABRERA Cód. 23178904 ; Grupo 211619_14; CEAD José Acevedo y Gómez. ANGIE PAOLA VALBUENA Cód.; Grupo 211619_15; CEAD Fusagasugá. ANDRUS DAVID SIERRA RICAURTE Cód. 1105786184; Grupo 211619_11; CEAD José Acevedo y Gómez. OSCAR JAVIER BARRERA CASTRO Cód. 1030522684; Grupo 211619_11; CEAD José Acevedo y Gómez.

DIRECTOR / TUTOR YHON GLAEHTER FLOREZ

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS, TECNOLOGIA E INGENIERIA PROGRAMA INGENIERIA DE ALIMENTOS BOGOTA D.C. 04 DE DICIEMBRE DE 2013

TABLA DE CONTENIDO 1.

INTRODUCCIÓN...................................................................................................................... 4

2.

CINETICA Y CRECIMIENTO MICROBIANO ................................................................................ 5

3.

4.

5.

2.1.

RESUMEN ....................................................................................................................... 5

2.2.

OBJETIVOS ...................................................................................................................... 5

2.3.

DIAGRAMA DE FLUJO (METODOLOGÍA) .......................................................................... 5

2.4.

MATERIALES Y REACTIVOS .............................................................................................. 6

2.5.

RESULTADOS .................................................................................................................. 6

2.6.

DISCUSION DE RESULTADOS ........................................................................................... 7

2.7.

CONCLUSIONES .............................................................................................................. 7

EXTRACCIÓN DE ADN ............................................................................................................. 9 3.1.

RESUMEN ....................................................................................................................... 9

3.2.

OBJETIVOS ...................................................................................................................... 9

3.3.

METODOLOGÍA ............................................................................................................... 9

3.4.

MATERIALES Y REACTIVOS ............................................................................................ 13

3.5.

RESULTADOS ................................................................................................................ 13

3.6.

DISCUSION DE RESULTADOS ......................................................................................... 14

3.7.

CONCLUSIONES ............................................................................................................ 14

ELECTROFORESIS PROTEICA ................................................................................................. 15 4.1.

RESUMEN ..................................................................................................................... 15

4.2.

OBJETIVOS .................................................................................................................... 15

4.3.

JUSTIFICACIÓN.............................................................................................................. 15

4.4.

METODOLOGÍA ............................................................................................................. 16

4.5.

MATERIALES Y REACTIVOS ............................................................................................ 17

4.6.

RESULTADOS ................................................................................................................ 17

4.7.

DISCUSION DE RESULTADOS ......................................................................................... 18

4.8.

CONCLUSIONES ............................................................................................................ 18

CINETICA ENZIMATICA ......................................................................................................... 20 5.1.

RESUMEN ..................................................................................................................... 20

5.2.

OBJETIVOS .................................................................................................................... 20

5.3.

MATERIALES Y REACTIVOS ............................................................................................ 20

6.

5.4.

RESULTADOS ................................................................................................................ 21

5.5.

DISCUSION DE RESULTADOS ......................................................................................... 30

5.6.

CONCLUSIONES ............................................................................................................ 31

INMOVILIZACION ENZIMATICA Y CELULAR............................................................................ 32 6.1.

RESUMEN ..................................................................................................................... 32

6.2.

OBJETIVOS .................................................................................................................... 32

6.3.

PRINCIPIOS TEORICOS................................................................................................... 32

6.4.

METODOLOGÍA: ............................................................................................................ 32

6.5.

MATERIALES Y REACTIVOS ............................................................................................ 34

6.6.

RESULTADOS ................................................................................................................ 34

6.7.

DISCUSION DE RESULTADOS ......................................................................................... 34

6.8.

CONCLUSIONES ............................................................................................................ 35

1. INTRODUCCIÓN La Biotecnología Alimentaria se puede definir como: el desarrollo, producción y utilización racional de recursos biológicos destinados a la creación, modificación e implementación de procesos como alternativa a soluciones que repercutan en la seguridad y calidad de los recursos alimentarios. Estos objetivos se pueden realizar gracias a los avances en las últimas décadas en la manipulación de macromoléculas orgánicas como el ADN, ARN y proteínas; dando origen a campos de conocimiento como: la genética molecular 1, proteómica, metabolómica, citómica, entre otras; los conocimientos obtenidos por técnicas básicas como la cinética de crecimiento celular, determinación de actividad enzimática, aislamiento y cuantificación de ácidos nucleicos (a.n.), son determinantes para la comprensión, desarrollo y control de procesos en Biotecnología Alimentaria. El crecimiento bacteriano se define como un aumento en el número de células, en otras palabras, se refiere al crecimiento en población y no al crecimiento en tamaño. Existen diferentes métodos para medir el crecimiento bacteriano, en esta práctica solo nos enfocaremos a la técnica la Medida de la turbidez del cultivo. El fenómeno de electroforesis, se basa en el desplazamiento de partículas portadoras de carga a través de un medio líquido, bajo la influencia de un campo eléctrico aplicado. La aplicación de este fenómeno a la separación de los componentes de una mezcla compleja hace necesaria la existencia de diferentes velocidades de migración, que a su vez dependen del campo eléctrico aplicado. De aquí que se defina el concepto de movilidad electroforética (m) como la velocidad de migración para un campo eléctrico de gradiente potencial unidad. Las enzimas son proteínas con capacidad de catalizar reacciones biológicas. Igual que los catalizadores inorgánicos, aumentan la velocidad para alcanzar el equilibrio de la reacción. El mecanismo por el cual las enzimas incrementan la velocidad de la reacción es reduciendo la energía libre de activación requerida para la transformar un sustrato al producto correspondiente, sin afectar la constante de equilibrio. La inmovilización de células y enzimas se refiere a células y enzimas físicamente confinadas o localizadas en una cierta región definida en el espacio reteniendo sus propiedades y actividades catalíticas. Asimismo, dependiendo del tipo de inmovilización tanto las células como las enzimas pueden ser inmovilizadas de forma permanente o temporal para ser utilizadas repetida y continuamente en diversos proceso químicos.

2. CINETICA Y CRECIMIENTO MICROBIANO 2.1.

RESUMEN Mediante esta práctica pretendimos analizar la relación del crecimiento microbiano con respecto al tiempo. El método de lectura de crecimiento se hizo por Espectrofotometría (Absorbancia) (lectura a 600nm), donde la diferencia visual es la turbidez del medio de cultivo a medida que el microorganismo crece.

2.2.

OBJETIVOS Identificar y comparar las diversas fases de crecimiento del microorganismo E. coli, en diferentes medio de cultivo. Determinar las diferencias en el tiempo de duplicación y la velocidad específica de crecimiento del microorganismo en diferentes fuentes de carbono. Expresar la biomasa en unidades de concentración mediante la elaboración de una curva patrón.

2.3.

DIAGRAMA DE FLUJO (METODOLOGÍA)

2.4.

2.5.

MATERIALES Y REACTIVOS MATERIALES  Cepa de Escherichia coli 1  Espátula 1  Gradillas para tubos de ensayo 1  Pipetas estériles (5 y 10 ml) 2 de cada una  Pipeteador 1  Tubos de ensayo ( 10 ml) 12  Elenmeyer (250 ml) 14  Vaso de precipitado (250 ml) 2 EQUIPOS Y UTENSILIOS

REACTIVOS

    

 Baño termostatado o Shaker con agitación 1  Balanza analítica 1  Mechero bunsen 1 Vortex 1

Equipos Incubadora 1 Autoclave 1 Cronómetro 1 Espectrofotómetro (λ : 600 nm)

 Sacarosa 5 g  Glucosa 5 g  Lactosa 5 g  Maltosa 5 g  Hipoclorito de sodio NaClO, 500 p.p.m. 400 ml

RESULTADOS

Muestra

Hora

Tiempo

0

10:00

1

ABSORBANCIA (600NM) SEGÚN SUSTRATO GLUCOSA

MALTOSA

LACTOSA

SACAROSA

0

0,029

0,021

0,052

0,042

11:00

60

0,024

0,039

0,093

0,023

2

11:30

90

0,043

0,088

0,140

0,198

3

12:00

120

0,117

0,203

0,202

0,253

4

12:30

150

0,220

0,260

0,270

0,273

5

13:30

210

0,413

0,507

0,499

0,606

6

14:00

240

0,471

0,587

0,421

0,651

7

14:30

270

0,541

0,659

0,544

0,444

8

15:00

300

0,624

0,740

0,639

0,408

Tabla 1. Lectura de Absorbancia para determinación de Cinética de crecimiento microbiano

Grafico 1. Relación Tiempo y Absorbancia

2.6.

DISCUSION DE RESULTADOS El microorganismo trabajado en la práctica fue la E. Coli. El cual se comportó de una manera muy variable para cada uno de los sustratos empleados. Como podemos observar en la gráfica en el sustrato que reportó mayor absorbancia fue en la Maltosa. Ninguno de los medios una concentración demasiado elevada (cerca a 1.0), lo que sugiere que falto tiempo de incubación para analizar el punto máximo de concentración alcanzado por la bacteria. Según los datos recopilados y la gráfica 1, se puede analizar que con la Sacarosa la fase de adaptación es más rápida para la E. Coli, pero así mismo su metabolismo aumenta, es la única donde se puede evidenciar las fases de crecimiento exponencial y muerte. Para la glucosa, maltosa y lactosa a las 5 horas aún se evidencia crecimiento, lo que indica que aún hay sustrato que le puede asegurar un poco más de tiempo en la fase exponencial. Si se habla de etapas del crecimiento, podemos ver que la fase de latencia se dio para todos los sustratos durante la primera hora. Pues a partir de la segunda hora (Tiempo 1) el crecimiento fue aumentando de manera exponencial.

2.7.

CONCLUSIONES La E. coli, presentó en la practica una mejor adaptación al medio con Sacarosa como sustrato. Sin conocer la concentración con la que se trabajó, no podemos generalizar, pero si se puede ver que en esta práctica fue el sustrato en el cual se obtuvo un mayor crecimiento aparente.

En cuanto al desarrollo de la práctica, cabe destacar la importancia de factores y variables claves para el estudio del crecimiento microbiano. Temperatura, tiempo, concentración y tipo de sustrato; además la acción de la refrigeración dada al momento de finalizar la incubación, son claves en la definición de la “Adaptación” de la bacteria a los diferentes medios. Para esta prueba la sacarosa fue el sustrato con mayor explosión en el crecimiento de microorganismos, sin embargo se consumió tan rápido que para asegurar un proceso biológico por mayor tiempo se requiere aplicar el sustrato en mucha más concentración.

3. EXTRACCIÓN DE ADN 3.1.

RESUMEN Para el desarrollo de esta práctica se tomó una muestra del medio de cultivo de E. Coli y mediante centrifugación se obtuvo cierta cantidad de Biomasa. A la Biomasa se le hizo un tratamiento químico con el fin de romper las células bacterianas y obtener una muestra compuesta por ácidos nucleicos y otras sustancias proteicas.

3.2.

OBJETIVOS Comprender y analizar la metodología establecida para la extracción y purificación de ácidos. Conocer el fundamento fisicoquímico de la extracción de ácidos nucleicos, la electroforesis de estas macromoléculas y su importancia como herramienta analítica.

3.3.

METODOLOGÍA

Propagar un cultivo de E. coli en 50 ml de medio LB en un matraz de 250 ml, durante toda la noche (14 -16 h) a 37°C con agitación orbital constante (>150 rpm aproximadamente).

Transfiera 15 ml de la suspensión de células a un tubo plástico de centrífuga (polipropileno) de 40 a 50 ml de capacidad con tapa rosca.

Centrifugar en refrigeración durante 5 min. a 6000 g.

Descartar el sobrenadante, resuspenda las células en 5 ml de solución SSE en frio agitando periódicamente. Recolecte las células por centrifugación (refrigeración, 5 min. a 6000 g), descarte el sobrenadante y resuspenda homogéneamente en 1200 μl de solución SSE; subdivida en dos micro tubos de 1,5 ml. Adicione a cada tubo 300 μl de solución SDS al 10%, mezcle suavemente en vortex e incube en un baño en agua a 60°C durante 10 min. o hasta que se observe un cambio significativo de la viscosidad; deje enfriar a temperatura ambiente. Mientras se enfría la suspensión de células lisadas, prepare un capilar para colectar el ADN. Con ayuda del mechero bunsen y pinzas metálicas, cierre uno de los extremos del capilar y doble la punta tratando de hacer pequeño el triángulo.

Localice la punta doblada del capilar en la interface, gire el capilar en remolinos hacia abajo y recoja el precipitado que se va formando a medida que se mezclan las dos fases. Este paso deberá hacerse rápidamente para evitar que se precipite ARN. Drene el exceso del liquido, presionando la punta del capilar en la pared interna del tubo. Traslade cada capilar a un tubo microcentrífuga de 2 ml que contiene 200 μl de etanol al 70%. Este ADN es llamado ADN crudo.

Disuelva el ADN en 700 μl de buffer TE con muy suave agitación. (Si se desea obtener ADN cromosomal altamente polimerizado es mejor permitir que el ADN se disperse libremente, incubando durante varias horas a 4 °C). Adicione 20 μl de NaCl 4M para ajustar la fuerza iónica, antes de extraer con fenol y solventes orgánicos.

Purificación de ADN (Extracción fenólica): 15. A los 700 μl de ADN disuelto en TE, adicione igual volumen de fenol saturado, mezcle invirtiendo el tubo suavemente (evitando el fraccionamiento excesivo del ADN) varias veces durante 5 minutos. 16. Centrifugue a temperatura ambiente durante 5 minutos a 16800 g (10000 r.p.m aprox) para separar las fases. 17. Transfiera el mayor volumen posible de la fase superior acuosa a un nuevo tubo, evitando transferir material de la interfase. 18. Adicione a la fase acuosa 500 μl de una mezcla: Alcohol isoamílico; mezcle invirtiendo el tubo suavemente varias veces durante 5 minutos; centrifugue a temperatura ambiente durante 5 minutos a 16800 g para separar las fases. 19. Transfiera la fase acuosa a un nuevo microtubo de ensayo y adicione 500 μl de una mezcla cloroformo-isoamílico, mezcle invirtiendo el tubo suavemente varias veces durante 5 minutos; centrifugue a temperatura ambiente durante 5 minutos a 16800 g para separar las fases. 20. Transfiera la fase superior a un nuevo microtubo de ensayo. Concentración del ADN por precipitación: 21. Adicione 600 μl de etanol absoluto frio (utilice etanol almacenado a -10 oC evitando la hidratación de este producto). 22. Mezcle invirtiendo el tubo dos o tres veces e incube en hielo durante 10 minutos. 23. Centrifugue a 23500 g (14000 aprox.) durante 15 minutos en refrigeración. 24. Elimine con cuidado el sobrenadante evitando desprender el pellet de ADN. 25. Invierta el tubo sobre un papel absorbente para retirar el exceso de alcohol, deje invertido para que se evapore los residuos de etanol.

26. Disuelva el ADN en 500 μl de buffer TE y prepare diluciones para evaluación electroforética y espectrofotométrica. Conserve la solución en refrigeración. Recuerde marcar el tubo apropiadamente.

3.4.

MATERIALES Y REACTIVOS REACTIVOS     

Acrilamida Bis-acrilamida (N.N´-metilenobisacrilamida) Tris (2-hidroximetil-2-metil-1,3 propanodiol) Sodio dodecilo sulfato (SDS) TEMED (N,N,N´,N´-tetrametilenoetilenodiamina)  Persulfato de amonio (PSA)

       

2-mercaptoetanol Glicerol Azul de bromofenol Glicina Ácido Clorhídrico (HCl) Azul de Coomassie R-250 Metanol - CH3OH Ácido acético glacial - CH3COOH

EQUIPOS Y UTENSILIOS  Cámara de electroforesis Bio-Rad Mini Preotean III  Fuente de poder (capacidad 300 V, 400 mA)  Beaker con agua para ebullición (92 ºC)  Flotador para microtubos

3.5.

RESULTADOS RESULTADOS CUALITATIVOS

 Centrífuga eppendorf  Contenedores de plástico o de vidrio (12x16x3 cm)  Tubos eppendorf  Vortex

3.6.

DISCUSION DE RESULTADOS Todos los tipos de macromoléculas biológicas tienen una característica en común que va a permitir el desarrollo de un método de separación específico para ellas. Estos métodos deben ser completamente biocompatibles para que puedan ser posteriormente útiles al investigador y, al mismo tiempo, lo suficientemente potentes para permitir el aislamiento de la molécula deseada de entre un mezcla compleja de multicomponentes que hacen las veces de “contaminantes” de nuestra molécula en cuestión.En el proceso de extracción de Ácidos Nucleicos requiere de precisión en cada uno de sus pasos evitando en lo posible pérdidas o mermas teniendo en cuenta las pequeñas cantidades de masa; especialmente las re-suspensiones en donde los riesgos de perdida son mayores, por un deficiente centrifugado o por perdidas en la eliminación del sobrenadante. El rompimiento de las células (membranas celulares) se hace por medio químico, la dosificación y la eficiencia del agente activo debe ser la adecuada garantizando la mayor cantidad de células fraccionadas, pues de este paso depende la cantidad de ácidos nucleicos a extraer. La extracción de los ácidos nucleicos crudos se hace de manera manual, así pues se pudo observar que la cantidad de material nucleicos extraído depende en un gran porcentaje de la habilidad del operario.

3.7.

CONCLUSIONES No hay una eficiencia del 100% en la extracción o separación de ácidos nucleicos, esto se deduce una vez se han fraccionado las células ya que la etapa es demasiado artesanal. Los Ácidos Nucleicos Crudos extraídos de la E. Coli se identifican como una sustancia translucida y viscosa.

4. ELECTROFORESIS PROTEICA 4.1.

RESUMEN La electroforesis se aplica para el análisis de ADN y de proteínas, esta nos permite separar estas moléculas de acuerdo con su tamaño. El principio de esta técnica es muy simple: si sometemos una molécula con carga electrostática a la acción de un campo eléctrico, las moléculas tenderán a moverse: las de carga negativa hacia el electrodo negativo. La velocidad a la que se mueva dependerá de la carga que tengan y del tamaño que sean. Además, se puede mejorar la separación poniendo obstáculos en su camino. Aquí las moléculas más pequeñas se podrán mover más ágil y rápidamente que las grandes. En la actualidad se utiliza varios polímeros que forman tales enrejados o mallas y además impiden la difusión o pérdida de resolución de la separación. Estos polímeros forman geles, especie de gelatinas que permiten mantener un registro estable de las moléculas que se mueven dentro de ellos. En forma rutinaria, las moléculas de ADN se analizan mediante electroforesis en gel. El gel es una red compleja de moléculas poliméricas y la distancia que el ADN migra a través del gel refleja su tamaño, el cual se puede estimar usando fragmentos de ADN marcador como referencia. La agarosa se usa en el análisis de moléculas de varios cientos hasta 20 000 pares de bases. El ADN se observa usando luz UV después de teñirlo con bromuro se etidio.

4.2.

OBJETIVOS Establecer el peso molecular de algunas proteínas y la metodología para lograrlo. Comprender las diferencias conceptuales de las diversas electroforesis, su variación, utilidad y limitación. Ensayar la separación de ADN por medio de electroforesis en gel de agarosa. Ensayar la revelación de un gel de agarosa con bromuro de etilio. Aislar ADN de la bacteria Escherichia Coli

4.3.

JUSTIFICACIÓN La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del análisis delos ácidos nucleicos y proteínas. La electroforesis nos ayuda a observar los ácidos nucleicos y proteínas al final del procedimiento .El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de un gel, La agarosa que es un polisacárido, cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semisólido al enfriarse. Este gel está constituido por una matriz otrama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de mediolíquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar

moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos, en el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular. Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la matriz y establecer un patrón de fragmentos, las moléculas deberán ser teñidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualización de las moléculas a manera de simples bandas las cuales serán posteriormente analizada se interpretadas. La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizada para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Además, si en dicha electroforesis se aplican marcadores de peso molecular (fragmentos de DNA de tamaño conocido) se puede calcular el tamaño aproximado del DNA en estudio. En biología molecular, la mayoría de los estudios básicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis; sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas, mientras que en la electroforesis horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. 4.4.

METODOLOGÍA Para la muestra del ADN se utiliza E. colli. (Ver practica: Extraccion de ADN) Preparación del gel. Se utilizó una cámara de electroforesis horizontal disponible en el laboratorio.  Preparar 100 mL de solución de agarosa al 0,8% en un Erlenmeyer:  Pesar 0,8g de agarosa  Agregar 100mL de buffer TBE 10X  Calentar hasta que la agarosa este disuelta, mezclar constantemente, no dejar hervir.  Dejar gelificar la agarosa y retirar los peines.  Colocar los peines en la cámara de electroforesis para hacer las separaciones (pozos).  Verter la solución tibia, lentamente por uno de los extremos de la bandeja de la cámara de electroforesis.  Llenar el tanque de la cámara de electroforesis con buffer de carga con pH 8,2  Dejar gelificar la agarosa y retirar los peines.  Colocar los peines en la cámara de electroforesis para hacer las separaciones (pozos).  Verter la solución tibia, lentamente por uno de los extremos de la bandeja de la cámara de electroforesis.  Llenar el tanque de la cámara de electroforesis con buffer de carga con pH 8,2.

4.5.

MATERIALES Y REACTIVOS MATERIALES  Cámara de electroforesis Bio-Rad Mini Preotean III  Fuente de poder (capacidad 300 V, 400 mA)  Beaker con agua para ebullición (92 ºC)  Flotador para microtubos  Centrífuga eppendorf  Contenedores de plástico o de vidrio (12x16x3 cm)  Tubos eppendorf  Vortex

4.6.

RESULTADOS

REACTIVOS  Tris (2-hidroximetil-2-metil-1,3 propanodiol)  Sódio dodecilo sulfato (SDS)  TEMED (N,N,N´,N´-tetrametilenoetilenodiamina)  Persulfato de amonio (PSA)  2-mercaptoetanol  Glicerol  Azul de bromofenol  Glicina  Azul de Coomassie R-250  Metanol - CH3OH

RESULTADOS CUALITATIVOS

4.7.

DISCUSION DE RESULTADOS La preparación de los Buffer se puede considerar como la etapa más importante del proceso de separación por electroforesis, a través de la práctica se observa que, de la preparación y de las características de los mismos depende el éxito de la separación de los sectores. El voltaje marca la rapidez de transición de cada fragmento del ácido nucleico a través del buffer de corrido, un voltaje alto hará una separación rápida pero ineficiente asi que es importante controlar esta variable. Las celdas de carga se utilizan de acuerdo al objetivo de la separación, dependiendo de las características del ácido se puede utilizar las grandes o las pequeñas; para efectos de la práctica se usaron las celdas grandes y las pequeñas, fue más fácil observar la separación en las celdas de carga grandes.

4.8.

CONCLUSIONES Los tres componentes del sistema deben estar en óptimas condiciones para un funcionamiento adecuado, hallar el balance entre ellos permite una separación más clara al final de la electroforesis.

El principio del método radica en la atracción de cargas eléctricas, la separación por filtrado (poros) y la estabilidad de un medio heterogéneo por diferencia en densidades. Pudimos realizar el corrimiento electroforético de ácidos nucleicos extraídos y purificados de la bacteria E. coli. Y los colocamos en el revelador, en este caso bromuro de etidio y dejamos los geles aproximadamente 5 minutos. Precaución: El bromuro de etidio es u n carcinógeno y debe manejarse con cuidado. Hay que evitar que se derrame la solución o tener contacto directo con esta. Po último examinamos el gel bajo la lámpara de luz ultravioleta para determinar la posición de las bandas en el gel.

5. CINETICA ENZIMATICA 5.1.

RESUMEN La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especificidad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La velocidad de la reacción catalizada enzimáticamente, es directamente proporcional a la concentración de sustrato, hasta cierto punto. Cuando la concentración del sustrato es baja, una parte de las moléculas enzimáticas tienen su sitio activo libre. Si aumentamos la cantidad de sustrato, estos sitios activos libres se unirán a él, acelerando la velocidad de la reacción sustrato a productos. Si continuamos aumentado la cantidad de sustrato, llegará un momento en donde ya no habrá más sitios activos libres, entonces la velocidad de la reacción ya no puede aumentar más. Cuando se llega a este punto se dice que la enzima está saturada.

5.2.

OBJETIVOS Comprender y analizar la metodología establecida para la determinación de la actividad enzimática de la glucosa oxidasa. Analizar la relación entre la concentración de sustrato y su influencia en la actividad enzimática. Conocer el procedimiento experimental para la obtención de los parámetros cinéticos de la glucosa oxidasa. Determinar el tipo de inhibición enzimática presentada y su fundamento bioquímico según los modelos matemáticos establecidos.

5.3.

MATERIALES Y REACTIVOS MATERIALES    

Espátula 1 Gradillas para tubos de ensayo 1 Pipetas (5 y 10 ml) 2 de cada una Pipeteador 1

 Balón aforado 25 ml 1  Tubos de ensayo ( 10 ml) 12  Vaso de precipitado (50 ml)

EQUIPOS Y UTENSILIOS

REACTIVOS

   

 Reactivo para la determinación de glucosa (GOD POD) 1  Glucosa 1 g  Agua destilada

Espectrofotómetro (λ : 510 nm) 1 Balanza analítica 1 Micropipetas 200 μl y 1000 μl 1 de cada una Puntas para micropipetas

5.4.

RESULTADOS Datos y Cálculos Iniciales: En la tabla 1 se muestran los cálculos de la concentración real de las soluciones teniendo en cuenta la cantidad mezclada con la enzima: Tabla.1 Cantidad de Sln Total Cantidda de Enzima

1100 ul 100 ul CONCENTRACIONES

SOLUCION [S] Teorica mg/ml [S] Real mg/ml

1 40 3,636364

2 20 1,818182

3 10 0,909091

4 5 0,454545

5 2,5 0,227273

6 1,25 0,113636

7 0,62 0,056364

A partir de los datos de la tabla 2 se realizan los cálculos para las tablas y gráficos que se encuentran posteriormente para cada una de las soluciones: Tabla 2. PARAMETROS

Valor

Unidades

Absorbancia a 510um Concentracion a 510 um PM Glucosa PM Acido Gluconico

0,322 0,1 180,1 196,16

mg/ml g/mol g/mol

Prueba Solución Nº 1. Los datos tomados en el espectrofotómetro inician en un tiempo cero (cero seg) hasta estabilizar lectura de absorbancia: Tabla 3. Datos para la muestra [40 mg/mL] SOLUCION 1 Tiempo (s)

Absorbancia

[ ] Glucosa (mg/mL)

0,0 4,0 6,5 9,1 14,7 19,6 26,7

0 0,206 0,400 0,600 0,740 0,810 0,868

0 0,06397516 0,12422360 0,18633540 0,22981366 0,25155280 0,26956522

mol glucosa mol Acido 0 0,000355 0,000690 0,001035 0,001276 0,001397 0,001497

0 0,000355 0,000690 0,001035 0,001276 0,001397 0,001497

[ ] Acido 0 0,0696800 0,1353010 0,2029514 0,2503068 0,2739844 0,2936031

37,4 48,6 57,6 60,0

0,882 0,885 0,885 0,885

0,27391304 0,27484472 0,27484472 0,27484472

0,001521 0,001526 0,001526 0,001526

0,001521 0,001526 0,001526 0,001526

0,2983386 0,2993534 0,2993534 0,2993534

Para determinar la concentración de la glucosa [mg/mL], se utilizó la siguiente ecuación: (510 ) ∗ = ó (510 ) ó Para determinar la cantidad de moles de la glucosa, se utilizó la siguiente ecuación: ó =

Para determinar la concentración de Ácido Gluconico, se utilizó la siguiente ecuación: ∗ = ó “NOTA: Se sabe que las moles de ácido gluónico son equivalentes a las moles de glucosa”. Una vez calculados cada uno de los ítems antes mencionados, se procede a graficar la concentración del ácido gluconico vs el tiempo. (Ver Gráfica No. 1) Gráfica 1. Solución 1: Concentración Acido vs. Tiempo

Prueba Solución Nº 2. Los datos tomados en el espectrofotómetro inician en un tiempo cero (cero seg) hasta estabilizar lectura de absorbancia:

Tabla 4. Datos para la muestra [20 mg/mL] SOLUCION 2 Tiempo (s) 0,0 0,5 5,0 8,9 11,8 15,7 20,2 25,3 29,8 36,4 42,8 54,6

Absorbancia 0 0,077 0,257 0,548 0,684 0,781 0,873 0,911 0,927 0,936 0,938 0,939

[ ] Glucosa (mg/mL) 0 0,02391304 0,07981366 0,17018634 0,21242236 0,24254658 0,27111801 0,28291925 0,28788820 0,29068323 0,29130435 0,29161491

mol glucosa mol Acido 0 0 0,000133 0,000133 0,000443 0,000443 0,000945 0,000945 0,001179 0,001179 0,001347 0,001347 0,001505 0,001505 0,001571 0,001571 0,001598 0,001598 0,001614 0,001614 0,001617 0,001617 0,001619 0,001619

[ ] Acido 0 0,0260454 0,0869309 0,1853623 0,2313646 0,2641751 0,2952943 0,3081479 0,3135600 0,3166042 0,3172807 0,3176190

Una vez calculados cada uno de los ítems antes mencionados, se procede a graficar la concentración del ácido gluconico vs el tiempo. (Ver Gráfica No. 2) Gráfica 2. Solución 2: Concentración Acido vs. Tiempo

Prueba Solución Nº 3. Los datos tomados en el espectrofotómetro inician en un tiempo cero (cero seg) hasta estabilizar lectura de absorbancia:

Tabla 5. Datos para la muestra [10 mg/mL] SOLUCION 3 Tiempo (s) 0,0 1,2 4,5 7,3 10,2 13,0 15,6 19,2 23,4 28,6 33,4 39,9 50,3 59,0 70,0

Absorbancia 0 0,068 0,155 0,296 0,442 0,583 0,668 0,810 0,902 0,962 0,989 0,999 1,003 1,003 1,003

[ ] Glucosa (mg/mL) 0 0,02111801 0,04813665 0,09192547 0,13726708 0,18105590 0,20745342 0,25155280 0,28012422 0,29875776 0,30714286 0,31024845 0,31149068 0,31149068 0,31149068

mol glucosa mol Acido 0 0 0,000117 0,000117 0,000267 0,000267 0,000510 0,000510 0,000762 0,000762 0,001005 0,001005 0,001152 0,001152 0,001397 0,001397 0,001555 0,001555 0,001659 0,001659 0,001705 0,001705 0,001723 0,001723 0,001730 0,001730 0,001730 0,001730 0,001730 0,001730

[ ] Acido 0 0,0230012 0,0524291 0,1001227 0,1495076 0,1972011 0,2259526 0,2739844 0,3051037 0,3253988 0,3345316 0,3379141 0,3392671 0,3392671 0,3392671

Una vez calculados cada uno de los ítems antes mencionados, se procede a graficar la concentración del ácido gluconico vs el tiempo. (Ver Gráfica No. 3) Gráfica 3. Solución 3: Concentración Acido vs. Tiempo

Prueba Solución Nº 4. Los datos tomados en el espectrofotómetro inician en un tiempo cero (cero seg) hasta estabilizar lectura de absorbancia:

Tabla 6. Datos para la muestra [5 mg/mL] SOLUCION 4 Tiempo (s) 0,0 1,3 3,2 6,7 9,8 12,5 16,0 19,1 24,4 28,5 33,1 38,9 43,0 49,8 64,0 72,0

Absorbancia 0 0,010 0,084 0,172 0,267 0,366 0,464 0,593 0,716 0,851 0,937 1,007 1,041 1,061 1,068 1,069

[ ] Glucosa (mg/mL) 0 0,00310559 0,02608696 0,05341615 0,08291925 0,11366460 0,14409938 0,18416149 0,22236025 0,26428571 0,29099379 0,31273292 0,32329193 0,32950311 0,33167702 0,33198758

mol glucosa mol Acido 0 0 0,000017 0,000017 0,000145 0,000145 0,000297 0,000297 0,000460 0,000460 0,000631 0,000631 0,000800 0,000800 0,001023 0,001023 0,001235 0,001235 0,001467 0,001467 0,001616 0,001616 0,001736 0,001736 0,001795 0,001795 0,001830 0,001830 0,001842 0,001842 0,001843 0,001843

[ ] Acido 0 0,0033825 0,0284132 0,0581794 0,0903134 0,1238004 0,1569491 0,2005837 0,2421887 0,2878528 0,3169425 0,3406202 0,3521207 0,3588858 0,3612535 0,3615918

Una vez calculados cada uno de los ítems antes mencionados, se procede a graficar la concentración del ácido gluconico vs el tiempo. (Ver Gráfica No. 4) Gráfica 4. Solución 4: Concentración Acido vs. Tiempo

Prueba Solución Nº 5. Los datos tomados en el espectrofotómetro inician en un tiempo cero (cero seg) hasta estabilizar lectura de absorbancia:

Tabla 7. Datos para la muestra [2,5 mg/mL] SOLUCION 5 Tiempo (s) 0,0 2,6 5,9 9,4 12,2 17,6 21,0 29,0 35,2 41,6 48,0 54,1 63,0 90,0 113,0

Absorbancia 0 0,033 0,078 0,129 0,200 0,291 0,365 0,489 0,593 0,700 0,800 0,900 1,000 1,094 1,096

[ ] Glucosa (mg/mL) 0 0,01024845 0,02422360 0,04006211 0,06211180 0,09037267 0,11335404 0,15186335 0,18416149 0,21739130 0,24844720 0,27950311 0,31055901 0,33975155 0,34037267

mol glucosa mol Acido 0 0 0,000057 0,000057 0,000135 0,000135 0,000222 0,000222 0,000345 0,000345 0,000502 0,000502 0,000629 0,000629 0,000843 0,000843 0,001023 0,001023 0,001207 0,001207 0,001379 0,001379 0,001552 0,001552 0,001724 0,001724 0,001886 0,001886 0,001890 0,001890

[ ] Acido 0 0,0111623 0,0263837 0,0436346 0,0676505 0,0984314 0,1234621 0,1654054 0,2005837 0,2367767 0,2706019 0,3044271 0,3382524 0,3700481 0,3707246

Una vez calculados cada uno de los ítems antes mencionados, se procede a graficar la concentración del ácido gluconico vs el tiempo. (Ver Gráfica No. 5) Gráfica 5. Solución 5: Concentración Acido vs. Tiempo

Prueba Solución Nº 6. Los datos tomados en el espectrofotómetro inician en un tiempo cero (cero seg) hasta estabilizar lectura de absorbancia: Tabla 8. Datos para la muestra [1,25 mg/mL] SOLUCION 6 Tiempo (s) 0,0 9,2 16,2 19,0 31,1 39,6 44,5 48,8 57,8 75,0 80,0 87,0 104,0 112,0 121,0 140,0 160,0 199,0 213,0

Absorbancia 0 0,018 0,080 0,100 0,200 0,250 0,300 0,325 0,400 0,500 0,550 0,600 0,700 0,750 0,800 0,900 1,000 1,100 1,107

[ ] Glucosa (mg/mL) 0 0,00559006 0,02484472 0,03105590 0,06211180 0,07763975 0,09316770 0,10093168 0,12422360 0,15527950 0,17080745 0,18633540 0,21739130 0,23291925 0,24844720 0,27950311 0,31055901 0,34161491 0,34378882

mol glucosa mol Acido 0 0 0,000031 0,000031 0,000138 0,000138 0,000172 0,000172 0,000345 0,000345 0,000431 0,000431 0,000517 0,000517 0,000560 0,000560 0,000690 0,000690 0,000862 0,000862 0,000948 0,000948 0,001035 0,001035 0,001207 0,001207 0,001293 0,001293 0,001379 0,001379 0,001552 0,001552 0,001724 0,001724 0,001897 0,001897 0,001909 0,001909

Gráfica 6. Solución 6: Concentración Acido vs. Tiempo

[ ] Acido 0 0,0060885 0,0270602 0,0338252 0,0676505 0,0845631 0,1014757 0,1099320 0,1353010 0,1691262 0,1860388 0,2029514 0,2367767 0,2536893 0,2706019 0,3044271 0,3382524 0,3720776 0,3744454

Prueba Solución Nº 7. Los datos tomados en el espectrofotómetro inician en un tiempo cero (cero seg) hasta estabilizar lectura de absorbancia: Tabla 9. Datos para la muestra [1,25 mg/mL] SOLUCION 6 Tiempo (s) 0,0 8,6 14,2 19,0 23,6 28,5 39,2 51,2 65,0 77,0 92,0 105,0 121,0 137,0 155,0 173,0 213,0 238,0 260,0

Absorbancia 0 0,010 0,030 0,060 0,080 0,100 0,150 0,200 0,225 0,300 0,350 0,400 0,450 0,500 0,550 0,600 0,700 0,750 0,800

[ ] Glucosa (mg/mL) 0 0,00310559 0,00931677 0,01863354 0,02484472 0,03105590 0,04658385 0,06211180 0,06987578 0,09316770 0,10869565 0,12422360 0,13975155 0,15527950 0,17080745 0,18633540 0,21739130 0,23291925 0,24844720

mol glucosa mol Acido 0 0 0,000017 0,000017 0,000052 0,000052 0,000103 0,000103 0,000138 0,000138 0,000172 0,000172 0,000259 0,000259 0,000345 0,000345 0,000388 0,000388 0,000517 0,000517 0,000604 0,000604 0,000690 0,000690 0,000776 0,000776 0,000862 0,000862 0,000948 0,000948 0,001035 0,001035 0,001207 0,001207 0,001293 0,001293 0,001379 0,001379

Gráfica 7. Solución 7: Concentración Acido vs. Tiempo

[ ] Acido 0 0,0033825 0,0101476 0,0202951 0,0270602 0,0338252 0,0507379 0,0676505 0,0761068 0,1014757 0,1183883 0,1353010 0,1522136 0,1691262 0,1860388 0,2029514 0,2367767 0,2536893 0,2706019

CINETICA ENZIMATICA Para la construcción de la siguiente tabla se tomaran los cálculos de las concentraciones reales de la Tabla 1, así como cada una de las pendientes calculadas en las gráficas (graficas del 1 al 7). Tabla 10. Cinética enzimática [S] Teórica mg/ml [S] Real mg/ml [U] Actividad

1/[S]

1/U

40

3,636363636

0,0035

0,275

285,714

20

1,818181818

0,0052

0,550

192,308

10

0,909090909

0,0045

1,100

222,222

5

0,454545455

0,0053

2,200

188,679

2,5

0,227272727

0,0035

4,400

285,714

1,25

0,113636364

0,0018

8,800

555,556

0,62

0,056363636

0,0010

17,742

1000,0

NOTA: como es una reacción enzimática linealizada se debe calcular el inverso de la concentración del sustrato y de la actividad para cada una de las pruebas.

A través de la gráfica No.8, se obtiene la ecuación que nos permite determinar la velocidad de reacción y posteriormente la cinética enzimática. Gráfica 8. Sustrato vs. Actividad

Ecuación obtenida de la gráfica: 1

= 45,618 1

+ 161,5

Por lo tanto la velocidad máxima que se puede dar es: 1 = 161,5 = 0,00619 Así la cinética enzimática es: =

5.5.

∗ 45,618 = 0,282

DISCUSION DE RESULTADOS En las siete concentraciones evaluadas se observan graficas con un comportamiento similar en cuanto a la actividad enzimática, en todas hay un aumento del contenido de ácido glucónico, así pues queda demostrado que hay actividad enzimática en los ocho ensayos. Una vez se analizan los gráficos obtenidos, se establece que la mayoría de ellos se pueden considerar como curvas de actividad enzimática de tipo Micheliano en donde la etapa de actividad de la enzima es proporcional y así mismo lo es la producción del acido glucónico, dando como resultado que el punto de Km se logra en un periodo de tiempo más corto. Una vez se efectúan todas las lecturas en el espectrofotómetro, se realizan los cálculos a partir de las absorbancias generadas por el equipo y que al final permite correlacionar la cantidad de glucosa con la cantidad de ácido glucónico generado, de acuerdo a las tablas se observa que a la concentración de 1.25 mg/ml se logra tener una mayor actividad enzimática pues el valor de ácido glucónico producido al final del tiempo es mayor (0.374 mg/ml) que el del resto de concentraciones de glucosa, aunque requiera de mayor tiempo para hacerlo. La muestra con mayor actividad en el tiempo es la solución con una concentración de 40mg/ml, se pudo establecer que a los 4 segundos ya llega a reportar absorbancias por encima de 0.2. Según la tabla y la gráfica 10, la actividad enzimática para este ensayo se da de manera lineal, la enzima utilizada (kit enzimático) Glucosa Oxidasa y Peroxidasa mantiene una actividad constante a través del tiempo. Las unidades de actividad enzimática calculadas son directamente proporcionales al tiempo transcurrido en el proceso.

5.6.

CONCLUSIONES En general el proceso enzimático con la glucosa es exitoso, en la mayoría de concentraciones se evidencia actividad de las enzimas evaluadas Glucosa Oxidasa y Peroxidasa (Kit enzimático). Las gráficas obtenidas para cada concentración se describen con un comportamiento Micheliano, en donde el aumento del es producto progresivo para la mayoría de concentraciones. La actividad enzimática de la Glucosa Oxidasa y Peroxidasa es lineal, las unidades de actividad enzimática crecen de manera proporcional al tiempo que dure el proceso (producción de ácido glucónico y agua).

6. INMOVILIZACION ENZIMATICA Y CELULAR 6.1.

RESUMEN El principal objetivo de esta práctica es la inmovilización de una enzima, referida como el confinamiento de la enzima en un material inerte, insoluble, para separarla y retener su actividad catalítica y reutilizarla posteriormente.

6.2.

OBJETIVOS Inmovilizar una enzima libre en alginato de sodio por atrapamiento. Inmovilizar células de levadura en alginato de sodio por atrapamiento.

6.3.

PRINCIPIOS TEORICOS El método de atrapamiento está basado en la localización de una enzima dentro de un enrejado de una matriz polimérica o membrana de tal forma que previene la liberación de proteína mientras permite la penetración de substrato. Este método es de los más utilizados, es recomendable procurar que la inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplié el intervalo de pH óptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Ventajas de las enzimas inmovilizadas: Enzimas estables. Reutilización, por ende disminuyen los costos. Desventajas de las enzimas inmovilizadas: Posible modificación en la conformación de la enzima, frente a su estado natural. Puede haber una pérdida de actividad de la enzima durante la inmovilización.

6.4.

METODOLOGÍA: Procedimiento Con Invertasa A. Preparar 100 ml de disolución de Alginato de Sodio al 3.0%. Para lograr la disolución completa se debe calentar la mezcla a temperatura aproximadamente 80°C con agitación constante y luego enfriar la disolución a una temperatura de 30°C. B. Agregar a la disolución de alginato, con agitación constante, 1 ml de la disolución de acuosa de la enzima invertasa 0,1 g/L. C. Extruir la mezcla anterior a través de una jeringa, ésta se debe llevar a cabo gota a gota y en forma continua. D. Recoger la mezcla extruida en un vaso precipitado de 250 ml que contenga una disolución de Cloruro de Calcio, con un sistema de agitación constante. Por la acción del

ión del calcio las gotas se gelifican espontáneamente formando perlas de alginato de calcio con la enzima invertasa atrapada dentro de la estructura gelificada. E. Lavar la perlas gelificadas con agua y colocarlas luego en una solución de Sacarosa al 4% y llevarlo a una temperatura de 40°C. F. Medir una alícuota de la disolución de Sacarosa y colocarlos en dos microtubos marcados. Procedimiento Con Levadura: A. Preparar 100 ml de disolución de Alginato de Sodio al 3.0%. Para lograr la disolución completa se debe calentar la mezcla a temperatura aproximadamente 80°C con agitación constante y luego enfriar la disolución a una temperatura de 30°C. B. Agregar a la disolución de alginato, con agitación constante, 2 ml de la disolución de acuosa de la enzima levadura 0,1 g/L. C. Extruir la mezcla anterior a través de una jeringa, ésta se debe llevar a cabo gota a gota y en forma continua. D. Recoger la mezcla extruida en un vaso precipitado de 250 ml que contenga una disolución de Cloruro de Calcio, con un sistema de agitación constante. Por la acción del ión del calcio las gotas se gelifican espontáneamente formando perlas de alginato de calcio con la enzima levadura atrapada dentro de la estructura gelificada. E. Lavar la perlas gelificadas con agua y colocarlas luego en una solución de Glucosa al 1% y llevarlo a una temperatura de 40°C. F. Medir una alícuota de la disolución de glucosa y colocarlos en dos microtubos marcados.

6.5.

MATERIALES Y REACTIVOS MATERIALES       

Balanza analítica 1 Micropipetas 200 μl y 1000 μl Puntas para micropipetas Espátula 1 Gradillas para tubos de ensayo 1 Pipetas estériles (5 y 10 ml) 2 de cada una Pipeteador 1

 Tubos de ensayo cónicos para centrifuga de 20 ml 4  Tubos de ensayo (10 ml) 12  Elenmeyer (250 ml) 14  Vidrio de Reloj  Vaso de precipitado (250 ml)

REACTIVOS  Alginato de Calcio  Cloruro de Calcio  Invertasa

6.6.

 Levadura  Sacarosa  Agua destilada

RESULTADOS RESULTADOS CUALITATIVOS

6.7.

DISCUSION DE RESULTADOS Como producto del avance de la biotecnología y su aplicación en procesos industriales para la obtención de productos químicos, farmacéuticos o alimentarios se ha recurrido al uso de enzimas. Éstas presentan grandes ventajas sobre catalizadores no biológicos, entre ellas gran actividad catalítica, a temperatura ambiente y presión atmosférica, y gran especificidad de sustrato. La inestabilidad que presentan en los procesos químicos industriales y la dificultad de poder separarse de sustratos y productos, todos solubles en agua, hacen que las enzimas no se puedan reutilizar. Como alternativa se ideó el método de inmovilizarlas a un soporte inerte para hacer factible que un proceso biotecnológico sea rentable

6.8.

CONCLUSIONES No es posible observar la actividad enzimática de la Invertasa, el tiempo en el que el jarabe de sacarosa estuvo en contacto con las capsulas fue muy corto y con una temperatura algo baja. Respecto a la reacción de la levadura no se observa generación de gas carbónico en la reacción con la solución azucarada, se requiere mejorar las condiciones ambientales y mayor tiempo para asegurar una reacción mas efectiva.