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INFORME DE LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA

INTEGRANTES: DIANA LORENA FLOREZ GOMEZ - COD: 29683329 GRUPO: 211619_3 RONI MARIE CORTES NOGUERA- COD: 1.113.628.912 GRUPO: 211619_12 JUAN CARLOS MAZO - CODIGO: 16.886.390 GRUPO: 211619_ 2 MIGUEL ANGEL MARIN – CODIGO: GRUPO:

TUTOR PRESENCIAL: MARIA DEL CARMEN GONGORA

TUTOR VIRTUAL: GLAEHTER YHON FLOREZ

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIA E INGENIERIAS INGENIERÍA DE ALIMENTOS

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MAYO DE 2014

INTRODUCCION

La biotecnología se puede definir como un conjunto de técnicas en que se utilizan organismos vivos, partes de ellos o moléculas derivadas de organismos vivos para fabricar o modificar productos. Además, comprende aquellas técnicas de modificación genética de variedades de plantas, animales o microorganismos para su utilización con un propósito específico. La ingeniería genética es un conjunto de técnicas que permite manipular los genes. El descubrimiento de las enzimas de restricción fue clave para poder desarrollar estos procedimientos. En el siguiente informe que es el resultado de las practicas de la Cinetica de crecimiento microbiano donde observamos diversas fases de crecimiento del microorganismo E coli y cinetica enzimatica analizamos la metodologia establecida para la determinacion de la actividad enzimatica de la glucosa oxidasa.

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PRACTICA 1: CINETICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

MARCO TEORICO Actividad enzimática: Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto. La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml). Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como 1 mol son 106 µmoles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x 106 U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submúltiplos como el microkatal (µkat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat). Cuando se conoce el peso molecular del enzima puro y el número de centros activos por molécula de enzima, las medidas de actividad enzimática permiten calcular el número de recambio del enzima, o sea, el número de reacciones elementales que realiza el enzima por cada centro activo y por unidad de tiempo. La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parámetro cinético importante pór múltiples razones: 

KM es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. En efecto, si KM = [S], la ecuación de Michaelis-Menten se reduce a: v = Vmax/2.



El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: A menor KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor KM, menor afinidad. Este hecho tiene fácil explicación si tenemos en cuenta que KM se define como (k2+k3/k1), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el complejo ES, mientras que la reacción 1 lo forma. Así, si KM es grande, el complejo ES es inestable pues predomina la tendencia a destruirlo (poca afinidad hacia el sustrato), y si KM es pequeña, el complejo ES es estable, ya que predomina la tendencia a formarlo (gran afinidad hacia el sustrato).

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

La KM del sustrato natural es menor que la de los sustratos análogos. Si dos sustratos del mismo enzima tienen distinta KM, el que presente mayor KM tiene menor afinidad por el enzima, y la reacción transcurre siempre a menor velocidad que con el sustrato de menor KM, salvo a concentraciones saturantes de sustrato, donde la v = Vmax.



Los valores de KM de muchos enzimas son próximos a los de la concentración fisiológica de sus sustratos, de forma que pequeñas variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metabólica.

CINÉTICA ENZIMÁTICA

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La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especifidad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos. Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción, o simplemente, la cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción (Figura de la derecha). Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero (Figura de la derecha). De esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad

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.

Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una gráfica como la de la Figura de la derecha. Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y

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la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reacción e 1s de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax).1

1

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MATERIALES Y EQUIPOS

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METODOLOGIA

Inoculación y cinética enzimática 1. Agitar y tomar en un tubo de ensayo, una alícuota de 2 ml en condiciones asépticas (utilizando un mechero) de cada medio de cultivo, el cual se utilizará Como blanco, marcar como “B”.

2. Inocular en condiciones asépticas 5 ml del inóculo a cada medio de cultivo (medios del 1, 2, 3, 8, 9,10), agitar y tomar 2 ml de muestra en un tubo de ensayo marcado como tiempo cero “0”. Agitar el medio e incubar a 37 °C; tanto los tubos marcados como blanco (B), cero (0) y las demás muestras posteriores, deben ser almacenarlos rápidamente a 4 °C para evitar el crecimiento del microorganismo en los mismos.

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3. Repetir la toma de muestra en tubos de ensayo (ítem 2) en los tiempos: 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270 y 300 min, cada tubo debidamente marcado con su respectivo tiempo, almacenarlos en la gradilla a 4 °C hasta el final del crecimiento (minuto 300).

4. Luego de la última toma (al minuto 300), agitar y leer cada muestra en un espectrofotómetro a una longitud de onda de: 600 nm, utilizando como blanco el tubo marcado como B, para cada medio. Luego de su medición, las muestras deben ser desechadas en una solución de hipoclorito de sodio.

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TABLAS Y GRAFICAS DE RESULTADOS

Medido a 600mm GRUPO

t=0 37°C 4°C SACAROSA 0.227 0,014 GLUCOSA 0,100 0,015 FRUCTOSA 0,041 SACAROSA -0,40 60% 0,018

t=30 37°C 4°C 0,052 0,051 0,235 0,038 0,045 0,131

t=60 37°C 4°C 0,115 0,078

0,119

0,061

0,033

0,024

SACAROSA 40% 0,002

0,026

0,038

0,016

0,004

0,043

0,051 0,013

0,014 0,214

t=90 37°C 4°C 0,770 0,020 0,064 0,083 0,173 0,044 0,022 0,018

t=120 37°C 4°C 0,092 0,093

0,039

0,014

0,021

0,114

0,100 0,004

0,198

0,025

0,025

0,029

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TIEMPO CERO 0 -0.05 -0.1 -0.15 ACTIVIDAD MICROBIANA

-0.2 -0.25 -0.3 -0.35 -0.4 -0.45

TIEMPO 30 MINUTOS 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 ACTIVIDAD MICROBIANA

0.05 0 -0.05 -0.1 -0.15

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TIEMPO 60 MINUTOS 0.25 0.2 0.15 0.1 ACTIBIDAD MICROBIANA

0.05 0

TIMPO 90 MINUTOS 1 0.8 0.6 0.4 ACTIVIDAD MICROBIANA

0.2 0 -0.2

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TIEMPO 120 MINUTOS 0.25 0.2 0.15 0.1 ACTIVIDAD MICROBIANA

0.05 0 -0.05 -0.1 -0.15

ANALISIS DE RESULTADOS En la práctica se observa el crecimiento de los microorganismos, todo 

se resume en varias fases: Fase de latencia o retardo: dura pocas horas, ya que la célula se adapta al medio en el que se encuentra. Puede haber muerte de algunos microorganismos. En la fase de latencia existe un aparente reposo en el que las células sintetizan lasenzimas necesarias para la actividad metabólica que deben llevar adelante.

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Cuando se hacen mediciones del número de células en distintos tiempos dentro de estafase, el valor no cambia sustancialmente. En cambio, interiormente

las

células

trabajanactivamente

adaptando

el

equipo

enzimático al medio de cultivo. La bacteria se preparapara hacer uso de los nutrientes que este medio le aporta, por lo tanto es la fase deadaptación al 

medio, con aumento de la masa celular pero no del número de células. Fase logarítmica: se lleva a cabo una multiplicación exponencial de los microorganismos.La velocidad de crecimiento que alcanza un cultivo, depende del tipo de microorganismoque se trate y diversos factores

 

ambientales como son la temperatura, el pH, oxigenación,etc. Fase de aceleración negativa: dada por la competencia del alimento. Fase estacionaria: consiste en el equilibrio entre la multiplicación y muerte de los microorganismos. Esta fase se presenta por agotamiento del suministro de algún nutriente esencial o poracumulación de productos metabólicos que sean tóxicos. También puede ser por ladisminución de la oxigenación o cambios en las



condiciones de pH del medio de cultivo(acidificación o alcalinización). Fase de Destrucción acelerada: debido a la muerte exponencial de los microorganismos, por falta de nutrientes y el aumento de sustancias de



desecho. Fase de declive: causada por la muerte total de los microorganismos por la acumulación de sustancias de desecho. El tiempo de la fase de latencia puede variar debido a las condiciones del cultivo así como también por la edad del inóculo, el tamaño del inóculo y los nutrientes contenidos en el medio de cultivo. 'La edad del inóculo varía debido a la cantidad de materiales tóxicos en él y la falta de nutrientes que posea la célula durante su desarrollo, los inóculos viejos prolongan más la fase de latencia. La fase de crecimiento microbiano dura 120 minutos y ésta es logarítmica.

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CONCLUSIONES El crecimiento bacteriano puede considerarse como el crecimiento de poblaciones de muchos millones de células cuyas características son esencialmente estadísticas, y el comportamiento de la célula individual es tomado como una frecuencia. El crecimiento de las bacterias en cultivo puede determinarse midiendo experimentalmente el incremento de la materia celular (protoplasma) o del incremento del número de células.

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Las posibilidades fisiológicas de los microorganismos se relacionan inversamente con sus necesidades nutricionales, ya que, la síntesis de componentes celulares a partir de materia inorgánica o compuesto inorgánicos simples es obviamente un proceso más complejo de lo que sería si los productos de partida fueran sustancias orgánicas complejas químicamente más parecidas a los constituyentes finales de la célula. Los microorganismos probióticos juegan un papel importante en el desarrollo de nueva flora intestinal y de sustancias capaces de disminuir los patógenos como bacterias, virus y parásitos. Desde el punto de vista microbiológico, un microorganismo muere cuando pierde de forma irreversible la capacidad de dividirse. El fundamento de esta definición es que si un microorganismo ha perdido la capacidad de dividirse no podrá formar una colonia sobre un medio de cultivo y no será posible detectar su presencia por los métodos microbiológicos tradicionales. Es decir, cuando no se produce aumento en el número de microorganismos no hay crecimiento. Sin embargo, un microorganismo puede estar muerto desde el punto de vista microbiológico y continuar desarrollando una actividad metabólica que se traduzca, por ejemplo, en liberación de toxinas. Por otra parte, hay que considerar que la capacidad de multiplicación (crecimiento) de un microorganismo puede verse transitoriamente afectada por lesiones o por las condiciones físicas o químicas del entorno. En estos casos, podríamos considerar como muertos microorganismos que pueden reanudar su crecimiento si las condiciones son de nuevo favorables.

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BIBLIOGRAFIA



http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz3.htm



Universidad del País Basco.Cinetica enzimática. http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz3.htm

Recuperado

de:

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PRACTICA 4: CINETICA ENZIMATICA

INTRODUCCIÓN Las células poseen compuestos químicos que controlan las reacciones que ocurren en su interior. La sustancia que controla la velocidad a la que ocurre una reacción química sin que la célula sufra daño alguno ni se destruya se conoce como catalizador. Las enzimas son sustancias (proteínas) que actúan como

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catalizadores en las células y hacen posibles las, reacciones que ocurren en las células disminuyendo la cantidad de energía de activación que se necesita. Las enzimas también controlan la velocidad a la que ocurre la reacción para que la energía se libere a una temperatura que no haga daño al organismo. Las miles de reacciones que constituyen el metabolismo de los seres vivos están bajo control de miles de enzimas. Diferentes enzimas controlan diferentes reacciones. La sustancia sobre la cual actúa una enzima se llama Sustrato: Al ocurrir una reacción el sustrato se convierte en uno o más productos nuevos. Las enzimas no se consumen en las reacciones y se pueden volver a utilizar. Sin embargo una enzima particular actúa solo sobre un sustrato específico, así que una enzima solo puede controlar un tipo de reacción específica. Una enzima recibe el nombre del sustrato sobre el cual actúa; Ej. Anhidrasa carbónica, la cual actúa en la conversión del CO2 en HCO3. Como nota, a una parte del nombre del sustrato sobre el cual actúa la enzima se le añade el sufijo asa. Corno las enzimas son proteínas; los factores que afectan la estructura de la proteína, también afectan la función o actividad de las enzimas. La temperatura, el pH y la concentración son algunos de los factores que influyen en la actividad de las enzimas.

JUSTIFICACIÓN Las enzimas son moléculas proteicas que catalizan reacciones químicas, una enzima hace que una reacción química que transcurre a una velocidad muy baja, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima.

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En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas. Las ENZIMAS son catalizadores biológicos. Un catalizador es una sustancia que acelera las reacciones químicas sin modificarse; esto significa que puede ser utilizado una y otra vez. Una Coenzima es la parte no proteica de una enzima. Las enzimas (E) son proteínas que tienen uno o más lugares llamados SITIOS ACTIVOS (Entidad tridimensional de una enzima donde ocurren los procesos de lisis, catálisis, hidratación, des hidrogenación) a los cuales se une al SUSTRATO (S), es decir la sustancia sobre la que actúa la enzima. El sustrato es modificado y convertido en 1 o más PRODUCTOS (P).

Dando la siguiente ecuación: E + S (ES) E + P

Donde (ES) es un complejo ENZIMA - SUSTRATO intermedio. Las enzimas aceleran la reacción hasta que alcanzan un equilibrio. Una característica muy importante de la actividad enzimática es su ESPECIFICIDAD de SUSTRATO, de manera que una enzima particular solo actuará sobre cierto sustrato y no aceptan moléculas relacionadas o que tengan una forma ligeramente distinta. Se asemejan al modelo de la Llave con la Cerradura. La enzima tiene un sitio activo complementario para el sustrato. Presentan un Sitio ALOSTÉRICO. Algunas enzimas requieren cofactores para su actividad, por ejemplo los Citocromos contienen un grupo prostético formado por un complejo metaloporfirínico. Otras

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enzimas emplean pequeñas moléculas no proteicas llamadas Coenzimas que se unen durante la reacción para activar a la enzima. El NAD y el NADP son importantes coenzimas. O sea una enzima tiene un Sitio Activo, Sitio alostérico, cofactores enzimáticos. Entre las Coenzimas se encuentra el NAD, FAD, FADP, FADPH, FADH, Co A, Etc. Toda Enzima se une al Sitio Activo y se ejemplifica mediante el modelo de la LLAVE con la CERRADURA, que consiste en la especificidad del SITIO ACTIVO, que depende no solo de la estructura primaria de la proteína, sino también de sus estructuras

secundarias

y

terciarias.

La

enzima

tiene

un

sitio

activo

complementario para el sustrato y no aceptan moléculas relacionadas o que tengan una forma ligeramente distinta y es por eso que la ENZIMA y el SUSTRATO tienen una interacción semejante a la LLAVE con la CERRADURA. Otro modelo es del ENCAJE INDUCIDO, la interacción entre la enzima y el sustrato produce cambios de conformación en la Proteína. El sustrato de une al SITIO ACTIVO mediante fuerzas no covalentes. Después de la formación del COMPLEJO ES, se produce el paso catalítico, en el que el Sustrato sufre Hidratación, Deshidratación, Oxidación, Reducción, Transferencia de grupos químicos, etc. El SITIO ACTIVO es complementario del SUSTRATO solo después que éste se une a la ENZIMA. En la práctica se realizó el estudio de la catálisis enzimática para la enzima Glucosa Oxidasa. La glucosa oxidasa es ampliamente utilizada, acoplado a peroxidasa de reacción que visualices colorimétricamente la formada H2O2, para la determinación de glucosa libre en el suero o plasma de la sangre para el diagnóstico, utilizando ensayos de espectrometría de forma manual o con procedimientos automatizados, y hasta el punto de utilizar ensayos rápidos. Ensayos similares permite para

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controlar los niveles de glucosa en la fermentación, birreactores, y para controlar la glucosa en la materia prima vegetal y los productos alimenticios.

Biosensores electrodo enzimático detectar los niveles de glucosa mediante el seguimiento del número de los electrones pasan a través de la enzima mediante la conexión a un electrodo y la medición de la carga resultante. Esto tiene una posible aplicación en el mundo de la nanotecnología cuando se utiliza junto con pequeños electrodos como sensores de glucosa para los diabéticos.

En la fabricación, GOx se utiliza como un aditivo gracias a sus efectos oxidantes: se solicita para la masa más fuerte en panadería, en sustitución de oxidantes tales como bromato. También ayuda a eliminar el oxígeno de envases de alimentos, o D-glucosa a partir de clara de huevo para prevenir el pardeamiento.

La glucosa oxidasa se encuentra en la miel y actúa como un conservante natural. GOx en la superficie de la miel reduce O2 atmosférico al peróxido de hidrógeno, que actúa como una barrera antimicrobiana. GOx actúa de manera similar como un bactericida en muchas células.

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REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Marco Conceptual y Modelos Matemáticos El crecimiento microbiano es el aumento del número de microorganismos a lo largo del tiempo. Por tanto, no se refiere al crecimiento de un único microorganismo (ciclo celular) sino al demográfico de una población. Denominamos ciclo celular al proceso de desarrollo de una bacteria considerada de forma aislada. A lo largo del ciclo celular, tiene lugar la replicación del material de la bacteria, la síntesis de sus componentes celulares, el crecimiento para alcanzar un tamaño doble del inicial y su división por bipartición de la bacteria para dar lugar a dos células hijas. La duración del ciclo celular coincide con el tiempo de generación y depende, en general, de los mismos factores de los que depende este. El crecimiento de una población resulta de la suma de los ciclos celulares de todos sus individuos. Este crecimiento suele ser asincrónico puesto que cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular. Por consiguiente, en un momento determinado en una población se encuentran células que acaban de dividirse, otras que están replicando su ADN y elongándose, otras que están iniciando la división celular, etc. En un crecimiento sincrónico todas las células se encuentran simultáneamente en la misma fase del crecimiento celular. Los cultivos sincrónicos son muy difíciles de mantener por lo que su importancia está principalmente ligada a los estudios básicos de biología microbiana. Sin embargo, en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en condiciones de crecimiento próximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta sincronización del cultivo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las poblaciones naturales probablemente se comporten como relativamente sincrónicas.

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Las poblaciones de bacterias pueden crecer de una forma explosiva acumulando grandes números en un periodo de tiempo muy reducido. Puesto que el efecto nocivo (infecciones o intoxicaciones) de los microorganismos depende de su número en la mayoría de los casos, entender cómo se produce el crecimiento microbiano es importante para poder evitar o reducir dichos efectos nocivos.

Se denomina crecimiento equilibrado a aquél en el que toda la biomasa, número de células, cantidad de proteínas, de ADN, etc., evolucionan en paralelo. El crecimiento equilibrado probablemente ocurra en muy contadas ocasiones en condiciones naturales. Las bacterias crecen siguiendo una progresión geométrica en la que el número de individuos se duplica al cabo de un tiempo determinado denominado tiempo de generación (ô). De esta forma, podemos calcular el número de bacterias (N) al cabo de un número de generaciones (n) usando la ecuación siguiente: N = No 2n Siendo No el número de células en el momento actual. El número de generaciones se puede calcular de la siguiente forma: n=t/ô

Donde t es el tiempo transcurrido. Los tiempos de generación de bacterias creciendo en ambientes favorables pueden ser muy cortos (valores de ô de 20 min). Esto lleva a que una única célula (N0 = 1) creciendo con un ô = 20 min, llegue a poder producir 4.7 x 1021 células en 24 horas.

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Si la bacteria crece en un medio líquido, las células que se producen en cada división continúan su vida independientemente en la mayoría de los casos formando una suspensión de células libres. Cuando una célula aislada comienza a crecer sobre un substrato sólido, el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Se denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una célula viva y aislada que se encuentra en un substrato y en condiciones ambientales adecuadas y produce una colonia en un breve lapso de tiempo. Una UFC también puede corresponder a más de una célula cuando éstas forman parte de grupos unidos fuertemente (estreptococos o diplococos, por ejemplo) ya que cada grupo formará una sola colonia. Cuando algunos tipos de bacterias o de levaduras patógenas crecen sobre superficies forman biopelícuas (biofilms) en los que las células se asocian entre sí mediante capas de polisacáridos que forman una película que recubre la superficie sobre la que se encuentran las células. Los biofilms son muy importantes porque los microorganismos que los forman resultan más resistentes a antibióticos y al ataque de células del sistema inmune y, por consiguiente, las infecciones que producen son más difíciles de tratar. La presencia de biopelículas es un problema serio en los implantes ortopédicos, catéteres, etc. El sarro de los dientes es un ejemplo de biofilm.

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METODOLOGÍA Para la realización de esta práctica se requieren los equipos materiales y reactivos:



Con la ayuda de un balón aforado, preparar 10 ml de una solución de glucosa a una concentración de: 8.8 mg/ml. Pasar a un tubo de ensayo y



marcar como: Tubo 1. En una gradilla ubicar seis (6) tubos de ensayo con cinco (5) ml de agua destilada cada uno; marcarlos como: tubo 2, tubo 3, tubo 4, tubo 5, tubo 6 y tubo 7.

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

Realizar diluciones sucesivas así: tomar 5 ml de la solución de glucosa del tubo 1 y adicionarlo al tubo 2; agitar y mezclar con la ayuda de un vortex. De los diez mililitros del tubo 2, tomar cinco (5) ml y adicionarlo al tubo tres (3), agitar y mezclar con ayuda de un vortex; esta acción se repite hasta el tubo 7.



Las concentraciones esperadas se muestran en la tabla adjunta.

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

En la celda de espectrofotómetro adicionar 1 ml de solución del reactivo de GOD POD; Introducir la celda en el equipo, y programar este a una longitud de onda de 510 nm.



En la celda de espectrofotómetro con el reactivo adicionar 0.1 ml del sustrato correspondiente al tubo uno (1), agitar rápidamente con ayuda de la micropipeta e inmediatamente llevar a cero la absorbancia (digitar blanco); e igualmente iniciar conteo del tiempo con ayuda de un cronómetro. Ir tomando datos de la variación de la absorbancia en el tiempo.

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

Repetir los numerales 2.9.5 y 2.9.6 con cada uno de los sustratos (Tubos de



ensayo del 2 al 7). Los resultados anotarlos en la tabla adjunta.



Graficar concentración de glucosa transformada a ácido glucónico con respecto al tiempo. La concentración de glucosa transformada a ácido glucónico se puede determinar mediante la siguiente relación: 0,320



Absorbancia equivale a 0,1 mg/ml de glucosa. Con lo anterior determinar la actividad enzimática de cada concentración



(en total son siete 7 actividades) Una unidad de actividad enzimática (U) se puede establecer como: cantidad de enzima necesaria para transformar un (1) mg de glucosa a ácido glucónico por minuto.

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

Realizar una gráfica de actividad enzimática con concentración de sustrato



y determinar la Vmax y Km de la enzima Glucosa oxidasa.

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TABLAS DE RESULTADOS Tabla de mediciones de cada una de las diferentes concentraciones de glucosa y la absorbancia obtenida en el espectrofotómetro

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Calculo de concentración de la Glucosa transformada en ácido Gluconico

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TUBO No. 2 0.20000 0.15000

calculo de concentracion

0.10000 0.05000 0.00000 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

TUBO No. 1 0.10000 0.08000 calculo de concentracion

0.06000 0.04000 0.02000 0.00000 1

3

5

7

9 11 13 15 17 19

Gráficas de CONCENTRACION DE GLUCOSA

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TRANSFORMADA A ÁCIDO GLUCÓNICO CON RESPECTO AL TIEMPO

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TUBO No. 4 0.35000 0.30000 0.25000 0.20000 0.15000 0.10000 0.05000 0.00000

calculo de concentracion

5

10 30 50 70 80 100 120

TUBO No. 3 0.20000 0.15000 0.10000 0.05000 0.00000

calculo de concentracion

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TUBO No. 6

TUBO No. 5

0.25000

0.25000

0.20000 0.15000

0.20000 calculo de concentracion

0.15000

0.10000

0.10000

0.05000

0.05000

0.00000

0.00000

calculo de concentracion

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TUBO No. 7 0.16000 0.14000 0.12000 0.10000 0.08000 0.06000 0.04000 0.02000 0.00000

calculo de concentracion

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RESULTADOS Y ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS Con lo anterior determinar la actividad enzimática de cada concentración (en total son siete 7 actividades) Una unidad de actividad enzimática (U) se puede establecer como: cantidad de enzima necesaria para transformar un (1) mg de glucosa a ácido glucónico por minuto.

Para ello Se determina la pendiente de cada gráfica (Abs vs t). Nos dará cambio en absorbancia por segundo. Ésta pendiente Absorbancia/ tiempo se usa para calcular lacantidad de producto que se genera por segundo. La pendiente se calcula de la parte donde se ve la parte de ascendencia rápida, a partir del tiempo 0. No se toma en consideración la parte donde las lecturas comienzan a estabilizarse.

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Hallar U: U= 0,0134 para 8,8 mg/ml de glucosa

Tubo 2 0.20000 f(x) = 0.01x + 0.05

0.15000

calculo de concentracion Linear (calculo de concentracion)

0.10000 0.05000 0.00000 0

5

10 15 20 25

Tubo 3 0.20000 0.15000

f(x) = 0x + 0.06

calculo de concentracion Linear (calculo de concentracion)

0.10000 0.05000 0.00000 0 5 1015202530354045

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Tubo 4 0.40000

calculo de concentracion

f(x) = 0x + 0.11

0.30000

Linear (calculo de concentracion)

0.20000 0.10000 0.00000 0

50

100

150

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Tubo 5 0.25000

f(x) = 0x + 0.06

0.20000 0.15000

calculo de concentracion Linear (calculo de concentracion)

0.10000 0.05000 0.00000 0

50 100 150 200 250

Tubo 6 0.25000

f(x) = 0x + 0.04

0.20000 0.15000

calculo de concentracion Linear (calculo de concentracion)

0.10000 0.05000 0.00000 0

50 100 150 200 250

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Tubo 7 0.15000

f(x) = 0.01x + 0.02

0.10000

calculo de concentracion Linear (calculo de concentracion)

0.05000 0.00000 0

2

4

6

8

10 12 14

Realizar una gráfica de actividad enzimática con concentración de sustrato y determinar la Vmax y Km de la enzima Glucosa oxidasa.

CURVA DE MICHAELIS-MENTEN

Sustrato (mg/mL) 0,2750

Velocidad (mg/seg/ml) 0,001

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0,5500 1,1000 2,2000 4,4000 8,8000

0,0009 0,022 0,0041 0,0058 0,0134

16.0000 14.0000 12.0000 10.0000 8.0000

CURVA DE MICHAELIS-MENTEN Velocidad (mg/seg/ml)

6.0000 4.0000 CURVA DE MICHAELIS-MENTEN Sustrato (mg/mL)

2.0000 0.0000 1

2

3

4

Sustrato (mg/mL)

Velocidad (mg/seg/ml)

9,4922E+17 1,89845E+18 3,79689E+18 7,59378E+18 1,51876E+19 3,03751E+19

1,66667E-05 0,000015 0,000366667 6,83333E-05 9,66667E-05 0,000223333

5

6

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Curva Michaelis-Menten 3.5000E+19 3.0000E+19 2.5000E+19 2.0000E+19 1.5000E+19 1.0000E+19 5.0000E+18 0.0000E+00

Sustrato (mg/mL)

CONCLUSIONES 

Aprendimos a calcular el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción



Conocimos cual es el comportamiento de la enzima en el proceso al momento de su saturacion.

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BIBLIOGRAFÍA Peña A. (2004). Bioquímica (2004), Editorial LIMUSA S.A de CV. Grupo Editores. México. Benintende, S. & Sanchez, C. Crecimiento Bacteriano. UNER. Recopilado de: http://www.fca.uner.edu.ar/academicas/deptos/catedras/microbiologia/unidad_3_cr ecimiento_bacteriano.pdf Sosa Romero M, Galviz Franco P. “caracterización de la enzima glucosa oxidasa (gox) (ec 1.1.3.4.) Libre e inmovilizada en dos soportes (alginato de Sodio y agarosa) para la producción de ácido glucónico” UNAD. Bogotá. 2010.

http://www.slideshare.net/yordi189/cintica-enzimatica

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