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ACTIVIDAD INDIVIDUAL

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA

PRESENTADO POR: MILEIDYS JUDITH TORRES PINEDA CODIGO: 1.063483276

PRESENTADO A

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA “UNAD” ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA INGENIERIA DE ALIMENTOS BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA 2018

INTRODUCCIÓN La biotecnología es una ciencia que implica la manipulación deliberada del material genético (ADN) de los organismos vivos con el fin de fabricar o modificar un producto, mejorar animales, plantas o desarrollar microorganismos con capacidad de especificar los como tales. La micropropagación es una de las aplicaciones de mayor impacto dentro del cultivo de tejidos vegetales y se tiene como la multiplicación asexual, basada en la totipotencia vegetal, realizada en condiciones in vitro. La obtención de plantas mediante micropropagación involucra una serie de etapas o fases que abarcan Desde los procedimientos previos al establecimiento de los cultivos en forma aséptica, los que se encargan de la selección y manejo de la planta madre, el establecimiento mismo, la proliferación o multiplicación a Través de subcultivos periódicos, el enraizamiento, que puede realizar in vitro o ex vitro (fuera del tubo de cultivo), hasta la aclimatación del material obtenido y su trasplante a condiciones de campo. La aplicación de la técnica de micropropagación se enfrenta a una serie de limitantes que discutan la realización de algunas de sus fases o etapas. Entre éstas sobresale el enraizamiento, ya que algunas especies no presentan una respuesta consistente a la aplicación de hormonas que lo estimulan, y la aclimatación del material. La aclimatación involucra aspectos relativos a la anatomía, siología y prácticas de manejo del material, que deben conocerse para aplicar procedimientos que permitan aclimatar el material vegetal y lograr su supervivencia, lo que constituye uno de los factores más limitantes de esta técnica.

MEDIDAS DE SEGURIDAD PARA EL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA OBJETIVO Establecer las normas básicas para hacer uso de las instalaciones del Laboratorio de Biotecnología de manera segura para evitar accidentes y por en lesione.

1. se utilizan guantes gorro tapa boca, polaina, bata 2. El NO uso de los elementos de protección personal se considera una falta grave y los facilitadores deberán impedir que se realicen las prácticas sino se cuenta con los elementos de protección primaria que las requieran 3. Las batas blancas, batas anti fluidos desechables cerradas y abotonadas. 4. No se debe deambular con los elementos de protección contaminados, ni utilizarlos en áreas diferentes como vestieres, baños, áreas de descanso o cafeterías 5. En caso que se requiera trasvasar sustancias químicas o infecciosas, se deben usar los elementos de protección primaria necesarios. 6. No está permitido en el laboratorio: Tener o consumir algún tipo de alimento o bebida, fumar, mantener o aplicarse cosméticos. 7. No se pueden mantener elementos personales en las áreas de trabajo. 8. No se podrán utilizar prendas de vestir diferentes a las definidas para el uniforme y elementos de protección personal (Ej. Sacos, chaquetas, chalecos, etc.)

9. Los estudiantes deben guardar sus bolsos, maletas, prendas de vestir y elementos personales en los casilleros asignados antes de ingresar al CMAPS. 10. No se pueden utilizar joyas por debajo de los guantes ni uñas artificiales. 11. Se deben mantener las uñas limpias y con una longitud menor de 1/4 de pulgada. 12. Los mesones de trabajo siempre debe estar en perfecto orden, evitando al máximo la presencia de objetos que no sean de trabajo (plantas o adornos). 13. Los reactivos se deben mantener en los sitios destinados.

La biotecnología se refiere a toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos y organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o procesos para usos específicos CONCEPTOS Y APLICACIONES BÁSICAS EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS VEGETALES IN VITRO

1.-

MICROPROPAGACIÓN

El cultivo in vitro permite el crecimiento y desarrollo de material vegetal en recipientes que lo separan del ambiente exterior y lo mantienen en condiciones controladas y asépticas. Entre las diversas técnicas de cultivo in vitro, la micropropagación consiste en la producción clonal de vegetales a partir, generalmente, de ápices o explantos nodales de una planta madre. La gran producción de nuevas plantas se ve favorecida gracias al rápido crecimiento del material vegetal in vitro y a la proliferación de tallos durante los subcultivos. Dentro del proceso de micropropagación diferenciamos varias fases o etapas: • 0: Selección y Preparación de la planta madre • 1: Desinfección de las yemas de la planta y/o desinfección de semillas • 2: introducción del material seleccionado in vitro • 3: Multiplicación de brotes • 4: Enraizamiento • 5: Aclimatación Esta secuencia de etapas abarca el ciclo completo de la multiplicación de plantas in vitro ; puede ser aplicada a diferentes especies vegetales, en cada caso se podrán incluir simplificaciones o cambios de acuerdo a las características de las plantas, pero en términos generales son comunes al proceso de propagación in vitro .

FASE 0: PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donadora de yemas, durante un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades. FASE 1: DESINFECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL Una vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantes. Los explantes pueden ser yemas, trozos de hojas, porciones de raíces, semillas, etc. Antes de extraer los explantes se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Los contaminantes más comunes son los hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el ambiente. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia. A efectos de obtener las condiciones de asepsia, se trabajará en cabinas de flujo laminar para extraer los explantes a partir del material vegetal. Estos explantes se introducirán en un tubo de cultivo conteniendo medio de iniciación para poder controlar la sanidad y la viabilidad, luego de realizar la desinfección del material con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o diluída durante un período de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada.

FASE 2: INTRODUCCIÓN DEL MATERIAL IN VITRO Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas dependiendo del material seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril. En un período de una semana o quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración de nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro. FASE 3: MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron la FASE 1 y 2 originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollará luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el número de plantas en cada repique o división de las plantas. El número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las condiciones del medio de cultivo. El número de plantas que se obtiene por la vía de la micropropagación permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados. FASE 4: ELECCIÓN DE EXPLANTOS

UN

MEDIO

DE

ENRAIZAMIENTO

DE

LOS

Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un tamaño aproximado de 2 centímetros. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación se transfieren a un medio

libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren en forma simultánea. FASE 5: ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento en que se extraen los explantes o plantines enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante. Por otra parte, crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la perdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta. La siguiente lista presenta una comparación de las características de una planta en condiciones de laboratorio (in vitro) respecto a una planta en condiciones naturales (in vivo): In vitro. • No realiza fotosíntesis • Crecimiento en condiciones controladas • Crecimiento en condiciones de asepsia • Alta humedad relativa

• Estomas no funcionales • Ausencia de pelos radiculares • Ausencia de cera en la cutícula. • Realiza fotosíntesis • Crecimiento en condiciones no controladas • Exposición a los patógenos y gérmenes del ambiente • Humedad relativa variable • Estomas funcionales • Presencia de pelos radiculares • Presencia de cera en la cutícula. Los plantines enraizados, deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz. Estos plantines se plantarán en contenedores (almacigueras) cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada.

- MEDIOS DE CULTIVO Antes de realizar la asepsia del material vegetal que se va a introducir in vitro, es necesario disponer de Medios de Cultivo esterilizados y dosificados en recipientes adecuados. Una parte importante del cultivo in vitro son los Medios de Cultivo ya que en ellos se encuentran las sustancias necesarias para el crecimiento y desarrollo de los tejidos vegetales. Un medio de cultivo es una solución acuosa en donde se encuentran disueltas sales minerales que aportan los elementos esenciales Macronutrientes (N, P, K, S. Ca y Mg) y Micronutrientes (Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo, y Co). Normalmente es imprescindible una fuente de carbono, generalmente la sacarosa, debido a la escasa actividad fotosintética de los tejido in vitro. Además, el medio puede ser enriquecido con Aminoácidos, Vitaminas y Reguladores del Crecimiento. Los medios de cultivo se preparan a partir de soluciones concentradas 10 o 100 veces (Soluciones Madre o Stock). En la solución madre se pueden mezclar varias sales minerales siempre que no se produzcan problemas de precipitación. Algunos elementos, como el Fe, se utilizan en forma de quelatos para mantener su disponibilidad durante el cultivo. Los medios de cultivo se pueden utilizar de forma líquida o con un agente gelificante como el agar.

- ESTABLECIMIENTO IN VITRO Para introducir in vitro un material vegetal que se ha desarrollado en el exterior es imprescindible tomar una serie de medidas encaminadas a eliminar los posibles microorganismos que puedan estar establecidos sobre él. En primer lugar hay que seleccionar material vegetal en un adecuado estado de nutrición y libre de enfermedades y plagas. Si el material presentase algún problema habría que descartarlo o realizar los tratamientos adecuados. Una vez seleccionado el material vegetal, y previamente a la introducción in vitro, es conveniente someterle a una serie de tratamientos para reducir al máximo los microorganismos superficiales. Por ejemplo se pueden realizar aplicaciones periódicas de fungicidas y bactericidas sistémicos. Algunos microorganismos pueden tener una alta capacidad saprofítica que les permite colonizar rápidamente el medio de cultico e imposibilitar el desarrollo del material vegetal. El paso previo a la instalación in vitro de un material vegetal es la asepsia superficial. El protocolo de este proceso dependerá de las características del tejido empleado. Para trabajar en condiciones asépticas, es recomendable realizar este proceso en una cámara de flujo laminar y emplear material estéril. El ambiente debe mantenerse limpio con la superficie de trabajo desinfectada con etanol al 70% antes y después de usarla. Se debe usar bata de laboratorio y lavarse bien las manos.

- ASEPSIA SUPERFICIAL DE MATERIAL VEGETAL Se pueden considerar dos situaciones dependiendo que el explanto que se va a emplear esté protegido en el interior de un órgano, como el embrión, o esté en contacto con el exterior, como brotes y yemas.

Para los explantos en el interior de órganos hay que realizar los siguientes pasos: ⁻ Realizar una asepsia superficial del órgano con etanol al 70 %. ⁻ Eliminar el tejido del órgano hasta alcanzar el explanto. ⁻ Colocar el explanto en el medio de cultivo MS-O Dentro de este grupo de explantos podemos considerar a numerosas semillas y a los Embriones. Como se citó anteriormente, los explantos en contacto con el ambiente exterior han de estar en óptimas condiciones sanitarias gracias a la aplicación regular de productos fitosanitarios. Por ejemplo, para introducir in vitro plantas de patata se colocan tubérculos en una bandeja con papel de filtro humedecido con acaricida, fungicida y bactericida, hasta que se desarrollen pequeños brotes. Con un material vegetal saneado se puede seguir el siguiente protocolo: ⁻ Cortar segmentos nodales o apicales de crecimiento activo y de un tamaño ligeramente superior al deseado. Eliminar las hojas, si las hay, y colocarlos en un recipiente con agua destilada. ⁻ Esterilización de los explantos en un recipiente estéril con lejía comercial al 20%, durante 15 minutos. ⁻ Lavar los explantos con abundante agua estéril y depositarlos sobre papel de filtro para eliminar el exceso de agua. ⁻ Cortar una pequeña porción del extremo del explanto (por donde se cortó inicialmente) y clavar verticalmente la parte basal (inferior) en el medio de cultivo. ⁻ Etiquetar los recipientes con un código adecuado que identifique el medio de cultico, el vegetal y la fecha ⁻ Colocar los explantos en una cámara de crecimiento en oscuridad o a 25 ºC y 16 h de fotoperiodo.

Una ver establecido in vitro, es necesario hacer un seguimiento del material vegetal para detectar las posibles contaminaciones y sacar de la cámara de cultivo los recipientes contaminados. - DESARROLLO DEL MATERIAL VEGETAL IN VITRO Los explantos establecidos en el medio de cultivo que no presentaban síntomas de contaminación se subcultivan posteriormente en el mismo medio o en otro diferente. En algunas ocasiones, el primer medio de cultivo que se emplea es el MS-O (medio sin reguladores del crecimiento) y posteriormente, los que no estén contaminados, se subcultivan a otros medios más específicos, con diversas combinaciones hormonales que desentenderán del tipo de material vegetal y del fin que se pretenda. ENRAIZAMIENTO IN VITRO La siguiente fase de un proceso de Micropropagación (etapa III) consiste en inducir el enraizamiento de microtallos obtenidos en el apartado 1.3. Para inducir el enraizamiento se suele emplear el medio de cultivo MS sin citoquininas y con auxinas. Por ejemplo un medio MS con 1 mg/L de AIB.

ACLIMATACIÓN

La última fase de una cadena de Micropropagación consiste en la aclimatación a condiciones ambientales de las plantas obtenidas in vitro. Las microplantas enraizadas in vitro se siembran en un sustrato humedecido de turba/vermiculita y se colocan en una cámara de aclimatación con una humedad relativa del 90 %. Durante dos semanas la humedad relativa va disminuyendo hasta alcanzar los valores del ambiente exterior.

CULTIVO DE MERISTEMOS

El cultivo del meristemo apical de un tallo se emplea para la obtención de plantas libres de virus ya que estos patógenos tienen dificultades para alcanzar esta zona cuando la planta está creciendo activamente Para obtener un meristemo apical es necesario tomar segmentos apicales de tallos obtenidos in vitro o procedentes de plantas crecidas en condiciones en el exterior. Si se utiliza la segunda posibilidad será necesario realizar una apepsia previa del tejido. Posteriormente se eliminan los primordios foliares que rodean al meristemo hasta dejar al descubierto el domo meristemático. Finalmente con un bisturí se realiza un corte transversal, de 0.2 a 1.0 mm, debajo del meristemo, con uno o dos pares de primordios foliares y se coloca sobre un medio de cultivo adecuado, procurando colocar la zona de corte hacia abajo. Una vez que empiece a desarrollarse el meristemo en el medio de cultivo se actúa como en una cadena multiplicativa en un proceso de micropropagación. Con los meristemos escindidos también se pueden realizar microinjertos y encapsulaciones en gel de alginato. El proceso de micropropagación: se realiza en varias fases: establecimiento, multiplicación, enraizamiento y adaptación, con personal especializado en cada una de las cuatro etapas

EQUIPO DE LABORATORIO

Estufa

Nevera

Conclusión La biotecnología vegetal permite la transferencia selectiva de una mayor variedad de información genética de una forma precisa y controlada mediante la utilización de técnicas que permiten desarrollar variedades con caracteres específicos deseables y sin incorporar los que no lo son.

Las características desarrolladas en las nuevas variedades protegen a las plantas de insectos, enfermedades, malas hierbas, etc.; e incorporar mejoras en la calidad, aumento del valor nutritivo, lo que conlleva a producir en abundancia, saludable y proteger el medio ambiente.

En el cultivo de tejidos las separaciones de explante y las operaciones relacionadas con su incubación in vitro, depende en gran medida del tipo de explante y del sistema de cultivo empleada; por lo cual las técnicas que se empleen, no son exactamente las mismas para meristemos. Los cultivos en vitro requieren técnicas heterogéneas donde los explante requieren condiciones contraladas y asépticas.

Las técnicas de la manipulación genética son importantes en el contexto general de la agricultura moderna; donde la biotecnología agrícola conecta aéreas como: Biología Molecular y Celular con prácticas agrícolas tradicionales produciendo nuevas variedades de plantas y técnicas de multiplicación que se utilizaran a futuro.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Evaluación morfológica e histológica del proceso de formación de yemas múltiples de Musa (AAB) cv. Canchignia, F. y Ramos, L. (2004). Micro propagación de plátano variedad barraganete. Laboratorio de biotecnología vegetal. Universidad Propagación de plantas por cultivo in vitro: una biotecnología que nos acompaña hace mucho tiempo. Disponible en 4/ad_382.pdf. Colmenares, M. y Giménez C., (2003). Multiplicación in vitro Musa spp., mediante sistema de inmersión temporal. Revista Facultad de Agronomía..(2002). Bananos (Musáceas de fruto comestible) notas de apoyo sobre el tema. Universidad del Táchira. 21 pp. Hurtado, D y Merino, M. (1987). Cultivo de tejidos vegetales. Editorial Trillas. Primera Edición. Ciudad de México D.F. pp. 231. Jiménez, E.(1998). Cultivo de ápices y meristemos. Citado por Pérez, J. (1998). Propagación y mejora genética de plantas por biotecnología. Instituto de Biotecnología de las Plantas, Volumen 1, Capítulo 3. Pág. 45-56.