ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA LABORATORIO DE BIOTECN
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ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA Nº2 TEMA: Fermentación alcohólica con levadura (obtención de vino)
INTEGRANTES: Ana Barrera Lina Carrillo Sonia Coba Jessica Murillo Johanna Veloz
CÓDIGOS: 2273 2420 2415 2153 2414
NIVEL: Octavo “B” DOCENTE: Dr. Iván Ramos LUGAR: ESPOCH, Facultad de Ciencias, Laboratorio de Biotecnología FECHA DE REALIZACIÓN: 12 de Mayo del 2015 FECHA DE ENTREGA: 19 de Mayo del 2015
OBJETIVOS General Realizar el proceso de fermentación alcohólica en el mosto de uva con levadura. Específicos Conocer la importancia de agregar levadura en el proceso de fermentación. Identificar la influencia de la temperatura en la obtención de vino. Determinar las características que indican que la fermentación alcohólica se produjo en el mosto de uva.
MARCO TEÓRICO
Bebidas Alcohólicas Las bebidas alcohólicas tienen su origen en el proceso de fermentación alcohólica. Todo líquido azucarado sufre esta fermentación de manera espontánea debido a la acción de las levaduras que, en ausencia de aire, destruyen la glucosa y otros azúcares produciendo dióxido de carbono y etanol. La vida de las levaduras en los líquidos es distinta a la de los mohos ya que, mientras estos últimos viven en la superficie, las levaduras crecen en la masa del líquido. En algunas ocasiones suben a la superficie creando una película llamada velo. La levadura del vino, por ejemplo, se encuentra sobre las vides en el período de maduración, pasa al mosto en la fase de estrujamiento y posteriormente inicia la fermentación del mosto para transformarlo en vino. Fermentación Alcohólica El proceso de fermentación alcohólica es el proceso que tiene por finalidad lograr la transformación de un mosto azucarado, hasta producto alcohólico, en un medio anaerobio y por la acción de la levadura, con la presencia de nutrientes, temperatura, pH y acidez óptima, de manera que la levadura pueda actuar correctamente sobre los azúcares y la fermentación sea correcta. Los azúcares presentes en la pulpa de las frutas son glucosa y fructosa esencialmente. Durante la fermentación, las levaduras transforman los azúcares en alcohol etílico y dióxido de carbono en una proporción similar y además libera calor (Grainger, 2005).
Reacción Alcohólica (Francisco Carretero, innovación tecnológica en la industria de bebidas)
Factores que influyen en el proceso fermentativo Levadura En la fermentación alcohólica participan diferentes especies de levaduras. Las más interesantes son: 1. Sacaromicetos Saccharomyces ellipsoideus. Es una de las levaduras más activas en la vinificación. Fermenta glucosa, sacarosa y maltosa Saccharomyces apiculatus. Tiene mucha importancia en la fermentación del vino y de la sidra. Sólo fermenta la glucosa. Deja de reproducirse cuando la concentración alcohólica de un líquido alcanza un 3-4 %. En el caso de los vinos, cuando se llega a esa concentración empieza a actuar la S. ellipsoideus. Saccharomyces cerevisiae. Se desarrolla en el mosto de la cerveza Saccharomyces carlsbergensis. Se desarrolla en el mosto de la cerveza. Fermenta glucosa, maltosa y sacarosa Saccharomyces pastorianus. Hay 3 variedades, una de ellas produce vinos seos de sabor áspero. Las otras actúan sobre la cerveza produciendo líquidos turbios y de sabor amargo Willia anómala. Se aisló en una levadura de cerveza. Forma velo gris en la superficie de los líquidos y produce olor a esencias y frutas. Fermenta la glucosa pero no descompone la maltosa y sacarosa 2. No sacaromicetos Torula. Forma velo en los líquidos fermentados comunicando sabores amargos y desagradables Mycoderma vini y M. cerevisiae. Producen también velo en la superficie de los líquidos. El primero es aerobio, transformando el alcohol en CO2 y agua (flores del vino) La preparación de las levaduras especiales es uno de los problemas de la industria de fermentación, ya que ciertas levaduras debidamente elegidas son las que comunican el sabor especial a las diferentes bebidas. Grado BRIX El mosto para fermentación alcohólica debe tener un brix entre 16 y 20, pues si el brix es muy bajo el grado alcohólico obtenido será pobre, por lo contrario si el brix es muy alto la fermentación no se efectúa, pues la presión osmótica que se ejerce sobre las levaduras es grande y no permite que actúen sobre los azúcares.
pH La levadura trabaja mejor en medio relativamente ácido por lo que el pH debe mantenerse entre 3.4 y 3.5, por lo que deberá ajustarse el mosto a este requerimiento. Temperatura La temperatura durante la fermentación debe controlarse pues durante la misma se produce un relativo aumento de esta, pues la descomposición de los azúcares produce una reacción exotérmica es decir con desprendimiento de calor. La temperatura óptima para la fermentación oscila entre 24 y 32°C siendo 27 º C la más adecuada. Si la temperatura es muy baja la fermentación es lenta, si la temperatura excede de los 35°C disminuye la acción de las levaduras y si esta aumenta por encima de los 40 esta se puede detener.
Nutrientes La levadura necesita la presencia de nutrientes para que la fermentación sea correcta, pues como ser vivo necesita alimentarse para poder trabajar. Los nutrientes más importantes para las levaduras son el nitrógeno y el fósforo, para ello demos utilizar la urea y el fosfato de amonio, el primero como suministro de nitrógeno y el segundo de fósforo. 62 Una vez terminada la fermentación tenemos un producto alcohólico que oscila entre 6 y 12 °GL, dependiendo de la eficiencia que haya tenido el proceso, este producto es un vino, al cual hay que clarificarlo con la ayuda de bentonitas, pectinasas, gelatina, clara de huevo entre otros aditivos. Una vez se ha clarificado el vino se debe rectificarlo, es decir aumentar su grado alcohólico hasta 13°GL para evitar una acetificación del vino (Grainger y Tattersal, 2005)
METODOLOGIA
FERMENTACIÓN ALCOHOLICA CON LEVADURA (OBTENCIÓN DE VINO ) Pesar 200 g de uvas bien lavadas. Adicionar 50 mL de agua destilada. Estrujar hasta obtener un homogenizado . Filtrara la solución. Suspender 2 g de levadura en 100mL de mosto de uva en un matraz de 1000mL. Colocar el tubo de fermentación a traves de un tapón de caucho perforado en un matraz. Colocar el matraz de fermentación a una temperatura del laboratorio ocerca de la calefación ( 27 ˚C). Dejar fermentar por 8 días . Comprobar periodicamente el proceso de fermentación. Guardar el producto para continuar la proxima práctica.
MATERIALES Y REACTIVOS
EQUIPOS
REACTIVOS
Balanza
Refrigerador
Agua destilada
MATERIALES
Levadura
Uvas
Mortero
Papel filtro
Varilla de agitación
Vaso de precipitación
Matraz Erlenmeyer de1000 mL
Probeta
Embudo
Tapón de caucho perforado
Tripode
Manguera
CONCLUSIONES Mediante la elaboración de la práctica se logró realizar la fermentación alcohólica del mosto de uva con levadura, teniendo como resultado la obteniendo de vino de uva, el mismo que presentó características organolépticas muy propias a esta bebida alcohólica como lo es su olor característico (etanol), así como el cambio de coloración y su sabor. Gracias a la práctica pudimos identificar que la levadura cumple una acción muy importante en la formación del vino puesto que son las encargadas de metabolizar los azucares contenidos en la uva a etanol y gas carbónico además son capaces de proporcionar un sabor característico al producto final, cabe destacar que también generan glicerol, acido succínico, el ácido acético y alcoholes superiores los mismos que deben ser extraídos del vino ya que comprometería sus características sensoriales y en general la calidad de un buen vino.
La influencia que la temperatura ejerce durante el proceso de fermentación alcohólica es de vital importancia, ya que durante la misma se produce un relativo aumento de temperatura, pues la descomposición de los azúcares produce una reacción exotérmica es decir con desprendimiento de calor. La temperatura óptima para la fermentación oscila entre 24 y 32°C siendo 27 º C la más adecuada. Si la temperatura es muy baja la fermentación es lenta, si la temperatura excede de los 35°C disminuye la acción de las levaduras y si esta aumenta por encima de los 40 esta se puede detener. A través de la práctica se pudo determinar los aspectos que revelan que se ha producido una fermentación alcohólica, ya que se diferenció la presencia de gas en forma de CO2 (anhídrido carbónico) debido a la presencia de efervescencia en la solución, así como también existió el desprendimiento de un olor característico a etanol muy propio del vino obtenido, además del cambio de coloración pasando de crema a una coloración más clara siendo algo característico de los vinos. RECOMENDACIONES El oxígeno es necesario al inicio de la fermentación para que se dé el proceso de glucólisis, por lo cual la oxigenación del mosto es necesario a pesar de que la actividad de la levadura se da en un medio anaerobio. Para proceder a realizar una fermentación alcohólica es recomendable determinar el porcentaje de azucares o tomar los °Brix del mosto al inicio de la fermentación, cuyo dato permitirá ir midiendo continuamente en el proceso de la fermentación y así determinar el momento preciso d la finalización del proceso hasta cuando sus azucares se hayan disminuido. Para tener un trabajo más eficiente de la levadura se recomienda que el mosto sobre el cual va a trabajar tenga un pH 3.4 y 3.5
BIBLIOGRAFÍA
Alboran, O. (28 de 06 de 2010). DETERMINACIÓN DE ALCOHOL EN VINOS. Obtenido de Vino de frutas . com: http://www.vinodefruta.com/Medicion%20de %20alcohol.htm Coronel, M. (05 de 2013). Los vinos las frutas. Obtenido de http://www.ute.edu.ec/fci/coronel.pdf Grainger K / Tattersall H., Producción de Vino (Desde la Vid hasta la botella), Editorial Acribia, Zaragoza – España, 2005. Melo, V. (2006). . Fermentación alcohólica . En V. Melo, Bioquímica de los procesos metabólicos (págs. 160-161). Barcelona: REVERTÉ. Rodriguez, C. (11 de 2012). Fermentaciòn alcoholica. Obtenido de http://www.tempeh.info/es/fermentacion-alcoholica.php Universidad de Chile. (2013). DETERMINACIONES DE GASES EN EL AGUA. Obtenido de http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth/ 13.html Vinodefruta. (2010). Vinodefruta.com. Obtenido de Aliado tecnológico para aficionados y profesionales de la fabricación de vinos de frutas y cervezas: http://www.vinodefruta.com/Medicion%20de%20alcohol.htm
ANEXOS:
Pesar 200 g de uvas
•Estrujar hasta obtener un homogeneizado
Colocar 100 ml de la mosto de uva filtrado en una matraz de 1000 ml
Agitar por varios minutos hasta que la levadura se disuelva. ( mantenga un estado homogéneo)
Adiciona 50 ml de agua en las Vaso de precipitación que contiene las uvas
Filtrar la solución
Suspender 2 g de levadura en 100 ml de mosto de uva
Colocar un tapón al matraz en el cual este conectado por una manguera a una vaso de agua. (altura de la mitad del matraz la manguera tanto como en el agua)
Colocor a tras de la refrigeradora por 8 dias y ver sus cambios
Día 1
Día 2( formacion de borbujas) efervecencia
Día 3
Día 5
Día 6
Día 7
Día 8
CUESTIONARIO 1. ¿DEFINIR EL PROCESO DE FERMENTACIÓN? La fermentación proceso de catabolismo (ruptura) incompleto que es totalemente anabolico (se da en un ambiente sin oxigeno). La sustancia que se va a romper (catabolismo) es el nutrimento. El nutrimento es roto por la actividad enzimatica (complejo enzima sustrato). El fin de la fermentacion es proporcionar energia al organismo que la esta realizando. En el proceso de fermentacion participan numerosas enzimas que van catabolisando (rompiendo) los enlaces del nutrimento con el fin de obtener energia. La fermentacion la realizan mas que todo las bacterias, hongos. (Coronel, 2013) Fermentación Alcohólica La fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico realizado por las levaduras y algunas clases de bacterias. Estos microorganismos transforman el azúcar en alcohol etílico y dióxido de carbono. La glucosa se degrada en un ácido pyruvic. Este ácido pyruvic se convierte luego en CO2 y etanol. Los seres humanos han aprovechado este proceso para hacer pan, cerveza, y vino. En estos tres productos se emplea el mismo microorganismo que es: la levadura común o lo Saccharomyces cerevisae. (Rodriguez, 2012)
2.¿DESARROLLAR LA VÍA METABOLICA QUE SIGUE ESTE PROCESO BIOTECNOLÓGICO? La fermentación alcohólica, comienza después de que la glucosa entra en la célula de levadura. La glucosa se degrada a través de un proceso llamado glucólisis dando como resultado piruvato el cual pierde su grupo carboxilo por acción de la piruvato descarboxilasa. Esta reacción es una sencilla descarboxilación en la que no se produce una oxidación neta del piruvato. La descarboxilación precisa de Mg 2+ y se halla unida íntimamente con la coenzima pirofosfato de tiamina, cuya función es la de transportador transitoria del grupo acetaldehído. (Melo, 2006) Una segunda reacción que se presenta es cuando el acetaldehído se reduce a etanol por el NADH en presencia de la enzima alcohol deshidrogenasa. El NADH procede de la deshidrogenación del gliceraldehído 3-fosfato y aporta el poder reductor a la reacción que cataliza la deshidrogenasa del etanol. Los productos finales son, por tanto, etanol y CO 2. (Melo, 2006)
La ecuación global de la fermentación alcohólica puede escribirse como se expone a continuación:
Glucosa+2 Pi+2 ADP → 2 etanol+CO 2+ 2 ATP+2 H 2 O
3.
¿ CUALES REACCIONES SE UTILIZAN PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE ALCOHOL Y CO2? Determinación de alcohol 1. Hidrometría El contenido de etanol se puede medir en el destilado a partir de un volumen de la muestra exactamente medido. Los azúcares reductores no son destilables. Interfieren el SO 2 y el ácido acético a los niveles que se señalan a continuación:
Niveles de SO2 superiores a 200 mg/1
Acidez volátil que exceda 0,10%
Por esta razón las muestras deben neutralizarse antes de la destilación. La determinación se efectúa por medio de un hidrómetro calibrado y se registra la temperatura. El porcentaje de etanol en volumen se obtiene de tablas específicas. (Alboran, 2010) También se puede determinar el porcentaje de etanol en volumen con hidrómetros que miden el peso específico y consultar posteriormente las tablas pertinentes.
Los hidrómetros para etanol deben calibrarse con soluciones de etanol exactamente preparadas. Este método requiere bastante experiencia y cuidados extremos en todo el proceso de neutralización, destilación, medición y control de temperatura. 2. Método densitométrico Requiere de un equipo especial. Mide el peso específico de la muestra, por el cambio de frecuencia de oscilación en un tubo en U comparado con dos estándares. El peso específico se convierte a porcentaje de etanol a 15,56°C. Se aplica a destilados entre 25-79° alcohólicos. El control de la temperatura y presión son factores importantes a considerar en la determinación. (Alboran, 2010) 3. Método refractométrico Ocupa el refractómetro de inmersión. Debe tenerse un muy buen control de la temperatura a 15,56°C. A temperaturas diferentes se aplican factores de corrección. 4. Determinación del etanol en peso Se utiliza el método del picnómetro. Se debe tener la precaución de un buen control de peso del picnómetro y bien calibrado, y un muy buen control de temperatura. (Alboran, 2010) 5. Determinación de etanol por el método de dicromato de potasio El etanol obtenido por destilación se oxida cuantitativamente a ácido acético por un exceso de dicromato de potasio estandarizado.
El exceso de K2Cr207 se determina con solución de sulfato ferroso y amonio estandarizado. Los tiempos y temperatura de incubación para oxidar el etanol a ácido acético son críticos. Debe tenerse especial precaución con el material de vidrio, exactitud de las mediciones, calibración de pipetas, etc. Debe realizarse un blanco. (Alboran, 2010) 6. Análisis de etanol por cromatografía gas-líquido (GLC) El etanol presente en vinos, cervezas, jugos se puede separar de otros componentes por GLC. Para mejorar los aspectos cuantitativos se usa 2-propanol como estándar interno. La relación de área de ambos picos se compara con la de una solución patrón de etanol y 2propanol.
Se pueden emplear columnas empacadas de acero inoxidable o vidrio de 2 m rellenas con Porapack QS, Carbowax 0,2 % 1500 sobre Carbopack C 80 -100 mesh, Chromosorb 103. Se recomienda determinar el porcentaje de etanol en volumen por un método oficial para efectos de control. (Alboran, 2010) 7. Método enzimático El etanol se puede oxidar a acetaldehído por el NAD en presencia de la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH) para producir NADH. Es una reacción estequiometrica en condiciones experimentales adecuadas. El NADH producido se determina espectrofotométricamente a 334, 340 o 360 nm.
Actualmente se dispone de mezclas preparadas. Debe tenerse precaución en la medición cuantitativa de volúmenes muy pequeños de reactivo y muestra. La reacción se desplaza a la derecha en medio alcalino, atrapando el acetaldehído formado y luego oxidándolo a ácido acético en presencia de aldehído deshidrogenasa.
Dependiendo de la longitud de onda que se elija, se debe tener la precaución de que la concentración de etanol sea de 0,01 a 0,12g/l (365 nm) o de 0,005 a 0,06g/l(340o334nm). En general en alimentos líquidos se recomienda clarificar y filtrar. El método es muy sensible, debe tenerse especial cuidado con el agua empleada que debe estar libre de etanol. Igualmente se recomienda tapar las cubetas en el momento de la lectura. El etanol es muy volátil. Debe trabajarse en atmósfera libre de etanol. Para controlar el método se recomienda emplear una solución patrón de etanol. (Alboran, 2010) Para el CO2 Diferentes fracciones de CO2, en el agua Para reconocer la presencia de CO2 libre, se agregan a 100 ml de agua algunas gotas de una solución alcohólica de fenolftaleína al 0,1%, teñida de rosado por adición de NaOH,
produciéndose su decoloración. En cambio, existirá ácido mineral si esta decoloración se repite en otra porción hervida y enfriada del agua. Si se intensifica el color rosado de la solución de fenolftaleína, el pH es superior a 8 y no existe CO2 libre, ni agresivo. (Universidad de Chile, 2013) Las determinaciones cuantitativas son las siguientes: a) CO2 libre: 200 mil de agua (recogida como para el 02 disuelto) se adicionan de 2 ml de solución. neutralizada de tartrato sódico-potásico al 33% si se trata de aguas duras o ricas en Fe. Sé titulan con NaOH N/20 reciente, en presencia de 1 ml de solución metanólica de fenolftaleína al 0,38 por mil, hasta color rosado, estable durante 3' (o hasta pH 8,3), lo que indica que sólo persisten iones bicarbonato. Cada ml de NaOH N/20 equivale a 2,2 mg, CO2 libre; b) CO2 combinado. 200 ml de agua se titulan con HCI N/10 en presencia de 2 gotas de anaranjado de metilo al 1 por mil; hasta viraje del amarillo al rojo salmón (o hasta pH 4,3). Cada ml de HCI N/10 equivale a 2,2 mg CO2 combinado a 6,1 mg HCO-3. c) CO2 agresivo. Esta denominación ha sido creada por Tillmans (83) corresponde, a aquella parte del CO2 libre que se encuentra en exceso, con relación al necesario para mantener en disolución .a los bicarbonatos. En aguas blandas puede atacar al cemento, cal, Fe, Cu, Zn y Pb de cañerías y depósitos. Se determina como, sigue: Un frasco de unos 250 ml con tapa esmerilada, adicionado de 3 g de polvo fino de carbonato de calcio puro (previamente hervido con agua destilada). Se llena con el agua en su misma fuente y con las mismas precauciones que en la determinación del oxígeno disuelto. Se deja durante 3 días, agitando con frecuencia y en 100 ml de filtrado límpido se titula la alcalinidad con HCI N/10 y anaranjado de metilo, como en el CO2 combinado. El mayor gasto de HCI N/10 en comparación con el del C02 combinado corresponde al CO2 agresivo. Si lo que quieres es demostrar la presencia de Dióxido de Carbono (CO2) en un cierto lugar lo que puedes hacer en crear artificialmente lluvia Acida. Recordemos que el Dióxido de Carbono se forma por la unión química del Carbono y el Oxigeno, esto es, de la unión de un no metal con el Oxigeno, por lo que a este tipo de compuestos se les conoce con el nombre de óxidos No metálicos, Óxidos Básicos o simplemente Anhídridos. Ahora un Anhídrido cuando reacciona con el agua (H2O) forma lo que se conoce como Acido, en este caso el Ácido que se formaría sería el Ácido Carbónico teniendo la siguiente reacción: CO2
+
H2O
H2CO3
Esto es dos hidrógenos, u carbono y tres oxígenos, si nos fijamos está perfectamente balanceada, ya que la valencias de los dos hidrógenos juntos son de +2, la del carbono en este caso es de +4 y las de los tres oxígenos juntos son de -6, si sumamos tenemos +2 +4 -6
=
0,
por
lo
que
el
Acido
es
neutro
y
está
totalmente
balanceado.
Ahora todo acido tiene una capacidad corrosiva por lo que al tocar un cuerpo se origina una reacción que hace que el cuerpo parezca que se está quemando o descomponiendo, entonces lo que tendrías que hacer sería escoger el lugar que quieres comprobar que hay CO2 y vertir agua en forma de lluvia, ya que lo has hecho deberás de tener a la mano un medidor de pH y entonces tomar la muestra de la sustancia que cae al suelo, para comprobar si en verdad tiene un pH acido, si este va de 1 al 6 entonces se demostrara que es Acido, y entonces que en ese lugar existe la presencia de CO2, aunque te advierto que deberá de haber una cantidad grande de CO2 para que se pueda producir esto, y que yo no he comprobado que funcione pero en teoría esto debería de funcionar. (Universidad de Chile, 2013)