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Universidad Católica de la Santísima Concepción Facultad De Medicina Departamento de Bioquímica.

Alumnos:

Paula Rozas Karina Romero Miguel

Salgado Felipe Sobrazo Profesores Encargados: Dr. Reginald del Pozo BQ Javier Grandón BQ Mirna Muñoz

QA German Rotter Fecha del Práctico: 28/Marzo/2007 Fecha de Emisión: 11/Abril/2007 Introducción Los organismos vivos poseen diversos elementos o sustancias que se encargan del desarrollo pleno de la célula (unidad estructural de los seres vivos), entre los cuales encontramos los metabolitos, la sangre, el plasma, enzimas y otros. Los cuales, a su vez, por el hecho de ser tan vitales para ésta llaman la atención de investigadores, científicos o bioquímicos. Sin embargo es necesario cuantificar y cualificar estas sustancias para su óptimo estudio, y es así como se han desarrollado diversos instrumentos o técnicas para el análisis de aminoácidos u otros analitos, entre los cuales encontramos la electroforesis, la cromatografía o la espectrofotometría. Esta última la técnica que desarrollaremos en el presente trabajo de laboratorio. La espectrofotometría es un método que nos permite identificar y cuantificar sustancias puras o en mezclas a partir de la luz absorvida por un determinado sistema químico, todo esto llevado a cabo gracias a un espectrofotómetro. El cual es un instrumento que proyecta un haz de luz monocromática a través de una muestra y mide la cantidad de luz que es absorvida por dicha muestra, comparando la longitud de onda emitida por el espectro con la que llega al fotodetector. En el presente trabajo se analizó en primera instancia una solución madre albúmina de 10 mg/ml, tratada con el método de Biuret, como analito para posteriormente realizar una curva de calibración estándar con los resultados obtenidos. Posteriormente se realizó el mismo procedimiento de espectrofotometría en una solución problema de concentración desconocida (muestra Nº5) tratada también con el método de Biuret, de modo determinar la concentración de aminoácidos de esta muestra problema. A continuación se explicará en detalles como se pudo llegar a conocer la concentración de la muestra problema con la ayuda de éste importante instrumento de laboratorio como es el espectrofotómetro y los distintos procedimientos que realizamos para llevar a cabo esto.

Objetivos -

Familiarizarse con las técnicas espectrofotométricas. Determinación cuantitativa de proteínas por el método de Biuret Conocer las diversas utilidades que posee es el espectrofotómetro. Conocer distintos métodos para determinar la concentración de una muestra de concentración desconocida.

Materiales •

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Reactivos: Muestra proteica problema numero 5 Solución estándar de albúmina 10 mg/ml Reactivo de Biuret (solución de sulfato de cobre 1% en NaOH 14%) Vaso de precipitado de 100 ml Pipeta parcial de vidrio de 2 ml Propipet a para 10 ml y para 2 ml Tubos Kahan Gradilla para tubos Kahan Plumón Vórtex Reloj Cubetas para espectrofotómetro Gradilla para cubetas Micropipeta de 100-1000 ml Agua destilada Espectrofótometro Metertek SP-830

Método

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Al comenzar nuestro trabajo debemos recordar la manera de usar las micropipetas, ya que solo unos microlitos de error nos alterarían todo nuestro resultado. Además hay que tener presente que 500 uL es equivalente a 0.5 mL. Para obtener nuestras muestras debemos realizar algunas disoluciones, para lo cual utilizaremos la siguiente igualdad, y de esta manera sabremos el volumen de la solución de albúmina que necesitamos ocupar: V1 * C1 = V2 * C2

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Como ya conocemos la cantidad de muestra de albúmina que vamos a ocupar el resto del volumen lo debemos completar con agua destilada. Procedimiento que hay que realizar para cada muestra.

Tubo 1 Tubo 2a Tubo 2b Tubo 3 Blanco

Tubo 4 Tubo 5

Tubo6

Tubo 1: agua destilada 0.5ml + Reactivo de Biuret 2ml Tubo 2 a y 2 b: Muestra proteica 0.5ml + Reactivo de biuret 2ml Tubo 3: Solución estándar 0.5 mg/ml + Reactivo de Biuret 2ml Tubo 4: Solución estándar 1.0 mg/ml + Reactivo de Biuret 2ml

Tubo 7 Tubo 8

Tubo 5: Solución estándar 2.5 mg/ml + Reactivo de Biuret 2ml Tubo 6: Solución estándar 5.0 mg/ml + Reactivo de Biuret 2ml Tubo 7: Solución estándar 7.5 mg/ml + Reactivo de Biuret 2ml Tubo 8: Solución estándar 10.0 mg/ml + Reactivo de Biuret 2ml

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**El paso más importante en esta etapa es el agregado del reactivo de Biuret que solo se agrega cuando todos los tubos estén con su disolución lista ya que a partir de que se coloca comienza la reacción, y deben comenzar todas las soluciones al mismo tiempo. Mezclamos y agitamos los tubos durante 10 a 30 segundos en el Vórtex Dejamos incubar los tubos a temperatura ambiente durante 15 minutos Comienza la etapa de la utilización del espectrofotómetro. Para ello tuvimos que elegir 10 cubetas para espectrofotómetro que estuvieran en buen estado, esto es dentro del rango de error permitido de +/- 0,015 absorbancia. Esto corresponde a otra parte crucial dentro del procedimiento, debido a que si usamos una cubeta defectuosa, el espectrofotómetro no nos dará el resultado realmente esperado Después de esto con nuestra muestra blanco lo calibramos a cero para comenzar con nuestro último paso práctico que corresponde a la lectura de la absorbancia.

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Llenamos las 10 cubetas elegidas con las respectivas soluciones de los tubos kahan hasta ¾ de su capacidad total, cuidando de limpiarlas después de haber vaciado el contenido

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Luego introducimos cada cubeta en el espectrofotómetro, anotando los datos de absorbancia de cada muestra

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A partir de estos datos se construyo una curva de calibración Resultados

Se prepararon seis disoluciones de 500µl, cada una con distinta concentración de BSA, a partir de una solución madre 10mg/ml. Para esto se utilizó la igualdad: (1)

Cinicial . Vinicial = Cfiinal . Vfinal

Donde C = Concentración de la solución (mg/ml) V = Volumen de la solución (µl) Ejemplo para calcular el volumen del tubo nº 1 1: Cinicial = 10mg/ml (concentración de la solución madre) Vinicial = X Cfinal = 0,5mg/ml (concentración de la solución que se obtendrá después de la dilución) Vfinal = 500µl (volumen de la solución obtenida) Luego, reemplazando los valores en (1) tenemos: 10mg/ml . X = 0,5mg/ml . 500µl Multiplicamos la expresión por 1/10mg/ml 1

El número de cada tubo presente en la Guía de Trabajos Prácticos ha sido reasignado para este informe; correspondiendo así el tubo nº 1 de ésta al blanco reactivo del informe, el nº 2 a la solución problema, el nº 3 al nº 1, el nº 4 al nº 2 y así sucesivamente.

1/10mg/ml . (10mg/ml . X ) = (0,5mg/ml . 500µl) . 1/10mg/ml Simplificando llegamos a: X = 0,5mg/ml . 500µl : 10mg/ml

 X = 25µl

Si el volumen total de la solución es 500µl, necesitaremos 500µl – 25µl = 475µl de agua destilada para completar la dilución.

Solución Blanco reactivo Solución problema 2 Tubo nº1 Tubo nº2 Tubo nº3 Tubo nº4 Tubo nº5 Tubo nº6

Tabla nº 1 Volumen Volumen utilizado de utilizado de BSA agua 10mg/ml (µl) destilada (µl) 0 500 25 475 25 475 50 450 125 375 250 250 375 125 500 0

Concentración de la solución (mg/ml) 0,0 .? 0,5 1,0 2,5 5,0 7,5 10,0

Luego, usando el espectrofotómetro, se midió la absorbancia del blanco reactivo, de la muestra problema y de los estándares. Se obtuvieron los siguientes resultados:

Tabla nº 2 Solución Blanco reactivo Tubo nº1 Tubo nº2 Tubo nº3 Tubo nº4 Tubo nº5 Tubo nº6

Concentración de la solución (mg/ml) 0 0,5 1 2,5 5 7,5 10

Absorbancia 0 0,016 0,04 0,086 0,164 0,253 0,341

Se realizaron dos diluciones iguales a partir de la M.P. nº 5, al medir la absorbancia de cada una de estas soluciones problema, se obtuvo 0,180 y 0,195 lo que promedia 0,188. Éste valor será el utilizado para calcular la concentración de la solución. Luego, a partir de la tabla nº 2, se han realizado 2 gráficos:

2

El volumen de BSA utilizado para preparar esta solución problema no proviene de la solución madre 10mg/ml, sino de la muestra problema nº 5, de concentración desconocida.

Gráfico I (realizado en Excel)

Curva de Calibración para calcular la concentración de la solución problema a partir de las mediciones de absorbancia 0,4

y = 0,0339x

0,35

2

R = 0,9993

Absorbancia

0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0

2

4

6

8

10

Concentración (mg/ml)

De acuerdo a la ecuación de la recta del Gráfico I, calculamos la concentración de la muestra. y = Valor de la absorbancia de la solución. = 0,188 x = Concentración de la solución en mg/ml Luego: 0,188 = 0,0339 . x  x1 = 5,546mg/ml Gráfico II (realizado en papel milimetrado) Cálculo de la pendiente Sean A y B dos puntos de la recta, con las coordenadas A (1,5 , 0,05) y B (7 , 0,2375) m= pendiente de la recta. m = (yB - yA) : (xB - xA) = (0,2375 – 0,05) : (7 – 1,5) = 0,0341 Por lo tanto, la ecuación de la recta para este gráfico es y = 0,0341x De acuerdo a esta ecuación, podemos calcular la concentración de la solución problema, donde y = valor de la absorbancia correspondiente a la solución problema. X= concentración de la solución problema en mg/ml Luego: 0,188 = 0,0341x

 x2 = 5,513mg/ml

Interpolando en el Gráfico II, también podemos calcular la concentración de la solución problema: x3 = 5,5mg/ml

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CONCLUSION En el practico realizado el objetivo era descubrir la concentración desconocida de una proteína, la albúmina bovina, en una muestra problema, para lo que utilizamos el método del espectrofotómetro. Este es un método muy confiable, siempre y cuando se tengan las precauciones del caso, como seria la limpieza en el trabajo, el orden y la precisión El practico realizado nos sirvió para valorar este método bioquímico, ya que es muy usado y útil como examen en el diagnostico en sospecha de alguna patología de este tipo. Además nos permitió darnos cuenta de la precisión y la dedicación que se debe tener al realizar este tipo de procedimientos, ya que cualquier error en el método nos entregaría un resultado equivoco, cosa que no es para nada conveniente al momento de realizar un diagnostico medico. Es por eso que tuvimos el máximo de cuidado en esos puntos críticos. El primer problema que se nos presento fue calcular correctamente las diluciones necesarias procurando usar correctamente las unidades de medida, otro punto importante fue realizar una homogenización correcta de los tubos, con el fin de evitar errores posteriores y realizar una lectura uniforme en el espectrofotómetro y finalmente para realizar la medición espectrofotométrica tuvimos que calibrar el aparato a 0 absorbancia para lo cual usamos la muestra blanco, además de esto, debimos elegir cubetas que estuvieran en buen estado, es decir, que estuvieran dentro del rango de absorbancia permitida de 0.015, ya que si hubiéramos usado cubetas defectuosas se alteraría la lectura real de nuestra muestra Finalmente es importante considerar que, si bien se prepara una curva de calibración con límites de linealidad determinados, en más de algún caso la muestra a analizar puede tener concentraciones que se encuentren por sobre ese límite de dilución. En caso que ocurriera esto, lo más conveniente es separar la muestra en varios recipientes y diluir cada uno de ellos en diferentes medidas, para así tener una que se pueda ubicar dentro del límite de linealidad y que por ende sea cuantificable. Se debe tener el cuidado, posterior a la cuantificación, de multiplicar la concentración por el número de veces que se diluyo la muestra a analizar para así obtener el resultado que requeríamos Las características más importantes de la reacción son: · La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los péptidos y proteínas. · Su rango de determinación es de 1 a 6 mg/ml. · No depende de la composición de aminoácidos. DISCUSION La albúmina es la proteína de mayor concentración en el plasma, cuya función es el transporte de moléculas pequeñas en la sangre, como la bilirrubina, el calcio, la progesterona, etc. Además es muy importante en la mantención de la presión oncótica de la sangre. El rango normal de concentración de albúmina en el plasma es de 3,4 a 5,4 g/dl., representando un 60% de las proteínas que contiene el suero. Esta proteína es sintetizada en el hígado, por lo tanto, la disminución de la albúmina sérica puede ser producto de una enfermedad hepática, pero también puede ser el resultado de una enfermedad renal que permite que la albúmina se escape a la orina. La disminución de la albúmina también tiene su explicación en una desnutrición o en una dieta baja en proteínas. Los valores incrementados de albúmina representan deshidratación, uso de torniquete prolongado durante la recolección de la muestra, o evaporación de la misma.

Bibliografía

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Grandón. J, Muñoz. M, Del Pozo. R, Rotter. G, Guía de Trabajos Prácticos, Carrera de Medicina 2007, Universidad Católica de la Santísima Concepción, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica.

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Del Pozo. R, Texto guía de Bioquímica Medicina, volumen I, Universidad Católica de la Santísima Concepción, Facultad de Medicina, 2007.

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Skoog, West, Holler, Química analítica, Séptima edición, Editorial McGraw-Hill, 2001, México. Páginas 578-581.

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Nelson. D, Cox. M, Lehninger Principios de Bioquímica, Tercera Edición, Ediciones Omega, 2000, Barcelona, España.

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http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/