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UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMAN FACULTAD CIENCIAS AGROPECUARIAS ESCUELA PROFESIONAL MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

ESPECTROFOTOMETRÍA

NOMBRE: Leny Yeraldi Marquina Paco CÓDIGO: 2019-110062 CICLO: I

TACNA-PERÚ 2020 ESPECTROFOTOMETRÍA

1. INTRODUCCION Muchos experimentos en bioquímica dependen de la medición de absorción de luz monocromática de una sustancia en solución en la región visible y ultravioleta del espectro electromagnético. Diversos compuestos sean o no coloreados tienen la capacidad de absorber luz de una determinada longitud de onda, pero en otros casos, es necesario transformar la luz en un derivado coloreado usando reactivos apropiados. Las moléculas de interés biológico adsorben luz en la longitud de onda comprendida entre 200 y 800 nanómetros (nm), como las purinas, pirimidinas, aminoácidos aromáticos, ácidos nucleicos, proteínas y otros. Tanto el color (colorimetría) como la transmitancia (fotometría) de luz de una solución pueden usarse como medida de su concentración.Para realizar las medidas de concentración se utiliza un instrumento llamado espectrofotómetro, el cual contiene un prisma de dispersión entre la fuente de luz y la muestra para poder seleccionar la longitud de onda analítica adecuada.La espectrofotometría consiste en comparar la transmisión de la luz a través de una solución que contiene la muestra. La ley de Lamber – Beer nos manifiesta que la fracción incidente absorbida por una solución a una determinada longitud de onda está relacionada con el espesor de la capa absorbente y concentración de la especie que absorbe.Esta ley está expresada por la fórmula: A = ɛ.c.l, donde : A = Absorbancia (0 - 1), ɛ = Coeficiente de Extinción Molar, C = Concentración (g/L, mg/mL, ug/Ml, etc.) l = longitud de la cubeta (cm). Para la transmitancia se aplica la fórmula: T = I/Io Donde: T = Transmitancia (se expresa de 100 – 0%), I = luz transmitida, Io = Luz incidente. Pueden existir limitaciones en la ley deLambert – Beer, debido a diversas desviaciones como instrumental, naturaleza de la muestra y el investigador. En la presente práctica esta luz debe estar entre el 10 y el 90% aproximadamente. La determinación de la concentración de una solución se puede realizar por el factor de calibración, curva de calibración y mediante la ecuación A = ɛ.c.l.

2. OBJETIVOS

 Encontrar la curva espectral de un colorante.  Determinar la longitud de onda analítica o de mayor absorbancia.  Poner en evidencia la ley de Lambert – Beer, haciendo uso de concentraciones progresivas de un colorante.  Determinar la curva de calibración y factor de calibración mediante concentraciones progresivas del colorante.  Determinar la concentración de una sustancia desconocida mediante el uso de la curva de calibración o factor de calibración.

3. MATERIAL Y METODOS 3.1. MATERIALES 3.1.1. Materiales de vidrio • Tubos de ensayo • Pipetas • Cubetas 3.1.3. Reactivos • Anaranjado de metilo 10mg/L • Anaranjado de metilo desconocido • Agua destilada 3.1.4. Equipos y otros • Espectrofotómetro 3.2. METODOS Mediante la observación y exploración se aplicará el método de absorción utilizando el espectrofotómetro. 4.PROCEDIMIENTO 4.1. Espectros de absorción y longitud de máxima absorción • En un tubo medir 2ml de un colorante (anaranjado de metilo) y diluirlo con 1mL de agua destilada. • Calibrar el espectrofotómetro a cero utilizando agua destilada como blanco. • Seleccionar la longitud de onda de mayor absorbancia. Longitud de onda

380n m

420n m

460n m

500n m

540n m

4.2. Curva de calibración • Preparar en tubos de ensayo, diferentes concentraciones con el respectivo colorante anaranjado de metilo (10mg/L). • 1 2 3 4 5 Anaranjado de metilo (10mg/L) 0m 1m 2m 3m 4m L L L L L Agua destilada 5m 4m 3m 2m 1m L L L L L •

Medir la absorbancia de los sistemas de tubos a una longitud de onda de máxima absorción, utilizando agua destilada como blanco.

4.3. Factor de calibración • Determinar la concentración de anaranjado de metilo en mg/mL y mg/100mL para cada tubo. • Encontrar el factor de calibración para el anaranjado de metilo. 4.4. Concentración de una solución desconocida • En un tubo de ensayo medir 5mL de la solución desconocida. • Medir la absorbancia de la muestra desconocida, utilizando la misma longitud de onda de máxima absorción.

580n m

6 5m L 0m L

5. RESULTADOS Experiencia N°1 Espectros de absorción y longitud de máxima absorción

En un tubo medir 2ml de un colorante (anaranjado de metilo) y diluirlo con 1mL de agua destilada.

1mL Anaranjado de metilo 2 mL

Calibrar el espectrofotómetro a cero utilizando agua destilada como blanco.

1

Agregar agua destilada en la cubeta.

2

Calibración del espectrofotómetro: 0

Seleccionar la longitud de onda de mayor absorbancia.

Y agregar la muestra en otra cubeta.

La longitud de onda de mayor absorbancia. Longitud de onda

380n

420n

460n

500n

540n

580n

m

m

m

m

m

m

Colocar la longitud de onda

1 380nm

0.000 Calibración del espectrofotómetro: 0

2

Luego anotar la absorbancia de la muestra

0.109

Agregar la cubeta con muestra al Espectrofotómetro

Hacer el mismo paso con las longitudes dadas en la tabla. Cada cambio de longitud de onda se hace la calibración del equipo. Longitud de onda Absorbancia

380n m 0,109

420n m 0,325

460n m 0,592

500n m 0,371

Máxima absorción para el anaranjado de metilo

540n m 0,099

580n m 0,002

Espectros de absorción y longitud de máxima absorción del Anaranjado de Metilo

0.7

MÁXIMA ABSORCIÓN 0.6

0.59

Absorbancia

0.5 0.4

0.37 0.33

0.3 0.2 0.11 0.1

0.1

0 380

420

460

500

0 580

540

Longitud de onda (nm)

Experiencia N°2 Curva de calibración

Preparar en tubos de ensayo, diferentes concentraciones con el respectivo colorante anaranjado de metilo (10mg/L).

1

5mL de Agua destilada

2

Agregar 1mL de Anaranjado de metilo y 4 mL de Agua destilada destilada

4

3

Agregar 3mL de Anaranjado de metilo y 2mL de Agua destilada

Agregar 2mL de Anaranjado de metilo y 3mL de Agua destilada

6 5

Agregar 5mL de Anaranjado de metilo

Agregar 4mL de Anaranjado de metilo y 1mL de Agua destilada

Anaranjado de metilo (10mg/L) Agua destilada

1 0m L 5m L

2 1m L 4m L

3 2m L 3m L

4 3m L 2m L

5 4m L 1m L

6 5m L 0m L

Medir la absorbancia de los sistemas de tubos a una longitud de onda de máxima absorción, utilizando agua destilada como blanco.

460nm

0.000

Calibración del espectrofotómetro: 0 Colocar la longitud de onda

Agregar todas las muestras Anotar la absorbancia de cada muestra XAbsorbanci a

1 0

2 0,210

Experiencia N°3 Factor de calibración

3 0,409

4 0,611

5 0,808

6 1,009

Anaranjado de metilo (10mg/L) Absorbancia

1 0

Concentración (mg/mL)

0

Concentración (mg/100mL)

0

2 0,21 0 0,00 2 0,2

3 0,40 9 0,00 4 0,4

4 0,61 1 0,00 6 0,6

5 0,80 8 0,00 8 0,8

TUBO 2.

1mL 10mg----1000mL x----- 1mL x= 0,01mg 0,01mg----5mL X ----- 1mL x= 0,002mg/mL 0,002mg----1mL X ----- 100mL Anaranjado de metilo y Agua destilada 4mL

x= 0,2mg/100mL

TUBO 3.

2mL 10mg----1000mL x----- 1mL x= 0,01mg 0,01mg----5mL X ----- 2mL x= 0,004 mg/mL

Anaranjado de metilo y Agua destilada 3mL

0,004mg----1mL X ----- 100mL x= 0,4mg/100mL

Tubo 4.

6 1,00 9 0,01 1

3mL

10mg----1000mL x----- 1mL x= 0,01mg 0,01mg----5mL X ----- 3mL x= 0,006 mg/mL 0,006mg----1mL X ----- 100mL

Anaranjado de metilo y Agua destilada 2mL

x= 0,6mg/100mL

TUBO 5.

4mL

10mg----1000mL x----- 1mL x= 0,01mg 0,01mg----5mL X ----- 4mL x= 0,008 mg/mL 0,008mg----1mL X ----- 100mL

Anaranjado de metilo y Agua destilada 1mL

x= 0,8mg/100mL

TUBO 6.

4mL

10mg----1000mL x----- 1mL x= 0,01mg 0,01mg----5mL X ----- 5mL x= 0,01 mg/mL 0,01mg----1mL X ----- 100mL x= 1mg/100mL

Anaranjado de metilo y Agua destilada 1mL

Curva de calibración del anaranjado de metilo en mg/mL

1.2

1.01

1

0.81

Absorbancia

0.8

0.61

0.6

0.41

0.4

0.21

0.2

0 0 0

0

0

0.01

0.01

0.01

Concentración (mg/mL)

Curva de calibración del anaranjado de metilo en mg/100mL

1.2

1.01

1

0.81

Absorbancia

0.8

0.61

0.6

0.41

0.4

0.2

0 0 0

0.21

0.2

0.4

0.6

Concentración (mg/100mL)

0.8

1

Experiencia N°4 Concentración de una solución desconocida

0.000

Agua destilada para calibrar el equipo

Calibración del espectrofotómetro: 0

En un tubo de ensayo medir 5mL de la solución desconocida.

0.410 Solución desconocida 5mL Medir Absorbancia (A)= 460nm λ

Factor de calibración - Concentración mg/mL

Anaranjado de metilo (10mg/L) Absorbancia

1 0

Concentración (mg/mL)

0

Concentración (mg/100mL)

0

0,002 =0,009523 0,210

TUBO 2.

F 2=

TUBO 3.

F 3=

0,004 =0,009779 0,409

TUBO 4.

F 4=

0,006 =0,009819 0,611

TUBO 5.

TUBO 6.

F 5= F 6=

2 0,21 0 0,00 2 0,2

3 0,40 9 0,00 4 0,4

4 0,61 1 0,00 6 0,6

F=

5 0,80 8 0,00 8 0,8

6 1,00 9 0,01 1

[ ]S As

F = Factor de calibración [ ] = Concentración estándar As = Absorbancia del estándar

0,008 =0,009900 0,808

0,01 =0,009910 1,009

Fx=

Factor del tubo 2,3,4,5,6 5

Fx=

F 2+ F 3+ F 4+ F 5+ F 6 5

Fx=

0,009523+ 0,009779+0,009819+0,009900+0,009910 5

Fx = 0,0097862

Concentración de la solución desconocido

[ ] D = Concentración desconocido F= Factor de calibración

[ ] D = F x AD

AD = Absorbancia del desconocido

[ ] D = Fx x AD [ ] D = Fx x 0,410 [ ] D = 0,0097 x 0,410 [ ] D = 0,0039 mg/mL

Factor de calibración - Concentración mg/100mL

0,2 =0,9523 0,210

TUBO 2.

F 2=

TUBO 3.

F 3=

0,4 =0,9779 0,409

TUBO 4.

F 4=

0,6 =0,9819 0,611

TUBO 5.

F 5=

TUBO 6.

F 6=

F=

[ ]S As

F = Factor de calibración [ ] = Concentración estándar As = Absorbancia del estándar

0,8 =0,9900 0,808

1 =0,9910 1,009

Fx=

Factor del tubo 2,3,4,5,6 5

Fx=

F 2+ F 3+ F 4+ F 5+ F 6 5

Fx=

0,9523+ 0,9779+0,9819+0,9900+0,9910 5

Fx = 0,97862

Concentración de la solución desconocido

[ ] D = Concentración desconocido F= Factor de calibración

[ ] D = F x AD

AD = Absorbancia del desconocido

[ ] D = Fx x AD [ ] D = Fx x 0,410 [ ] D = 0,978 x 0,410 [ ] D = 0,40098 mg/mL

Anaranjado de metilo desconocido

Curva de calibraci ón

Factor de calibraci ón

Concentración (mg/mL) Concentración (mg/100mL)

0.0039 0.40098

0.0097 0.9786

Curva de calibración del anaranjado de metilo en mg/mL

1.2

1.01

0,410

Absorbancia

1

0.81

0.8

0.61

0.6

0.41

0.4

0.21

0.2 0 0 0

0

0

0.01

Concentración (mg/mL)

0.01

0.01

0,0039

Curva de calibración del anaranjado de metilo en mg/100mL

1.2

1.01

0,410

Absorbancia

1

0.81

0.8

0.61

0.6

0.41

0.4 0.2 0 0 0

0.21

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Concentración (mg/100mL) 0,4009

6.CONCLUSIONES 

Máxima absorción para el anaranjado de metilo es 0,592 con longitud de onda 460nm.



La absorbancia de la solución desconocida es de 0,410.



El factor de la calibración de la concentración mg/mL es de 0,00978.Y La concentración de la sustancia desconocida es de 0,0039 mg/mL.



El factor de la calibración de la concentración mg/100 mL es de 0,978.Y La concentración de la sustancia desconocida es de 0,40 mg/mL.



A mayor concentración, se incrementa la absorbancia.



Absorbancia ALTA de mg/mL y mg/100mL es de 1.009 por lo tanto las muestras están muy concentradas.

7. CUESTIONARIO

7.1 ¿Qué entiende por coeficiente de extinción molar? Es una medida de la cantidad de luz absorbida por una unidad de concentración. Compuesto con un alto valor de coeficiente de extensión molar muy eficiente en la absorción de luz de la longitud de onda adecuada y puede detectarse por medidas de absorción cuando se encuentra en disolución a concentraciones muy bajas. 7.2 ¿Qué se entiende por factor de calibración? Es la concentración de una sustancia que corresponde a una unidad de medida, generalmente 0,001 de absorbancia. Se halla mediante la concentración estándar entre la absorbancia del estándar. La calibración es una operación de comparación entre la señal o respuesta del problema, con la de un patrón de calibración, o muestra de composición conocida. La calibración se expresa en forma de un factor de calibración, o con una serie de parámetros correspondientes a la función de una recta o curva de calibración o con marcas en una escala arbitraria. 7.3 ¿Cuándo se usa luz ultravioleta o luz blanca en el método de espectrofotometría? La espectrometría UV se utiliza habitualmente en la determinación cuantitativa de soluciones incoloras como iones metálicos de transición y compuestos orgánicos muy conjugados. 7.4 ¿Qué es densidad óptica? La densidad óptica es una magnitud física que mide la absorción de un elemento óptico por unidad de distancia, para una longitud de onda dada. 7.5 ¿Qué importancia tiene el tubo blanco y el tubo estándar? Tubo blanco: Se utiliza para calibrar el equipo al momento de colocar las muestras y normalmente contiene agua destilada. Tubo estándar: Contiene la solución de una muestra con concentración conocida. Y nos ayuda a conocer la concentración desconocida.

8. BIBLIOGRAFIA

Paca.(2015). Ley de Lambert-Beer. Disponible en: https://slideplayer.es/slide/145856/ [Consultado Diciembre 2020] Pérez,G.(s.f). Espectrometría ultravioleta-visible. Disponible en: https://www.espectrometria.com/ [Consultado Diciembre 2020] Rubio,E.(2018). Espectrofotometria uv-visible. Disponible en: https://www.slideshare.net/mateorubio5/espectrofotometria-uv-visible [Consultado Diciembre 2020] Valle,J. & Cornejo,A.(2014). Bioquímica Biología celular y molecular II. Disponible en:

https://repositorioacademico.upc.edu.pe [Consultado Diciembre 2020]