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Instituto Profesional Santo Tomás 2016 Ingeniería en Química Industrial Laboratorio de Bioquímica

Determinación Espectrofotométrica de las Proteínas. Francisco Barraza Gavia [email protected] Resumen: En el laboratorio preparamos soluciones en tubos de ensayos enumerados a los cuales se le adicionó reactivo Biuret, que se dejaron reposar para luego medir la absorbancia a través de un espectrofotómetro. Palabras Claves: Espectrofotómetro, celdas de espectrofotometría, reactivo Biuret, absorbancia.

Introducción La mayoría de los problemas analíticos reales comienzan con una compleja mezcla a partir de la cual es necesario aislar, identificar y cuantificar uno o más componentes de la misma. Un método es la espectrofotometría, y el espectrofotómetro es el instrumento capaz de medir la sustancia química capaz de absorber luz monocromática a través del espectro electromagnético en función a la longitud de onda de la radiación, esta sustancia dependerá de la estructura química que tenga.

- Reactivo de Biuret - Solución estándar de BSA al 4,8% Procedimiento Método Biuret 1. Prepare una batería de tubos enumerados. 2. Agregue el volumen indicado de la solución de BSA o muestra problema con una pipeta graduada de 1 mL. 3. Agregue el volumen indicado de agua con una pipeta graduada de 1 mL. 4. Agregue 4,0 mL del reactivo Biuret con una pipeta graduada de 5 mL. 5. Agite y espere 20 minutos a temperatura ambiente para la formación del complejo coloreado. 6. Mida la absorbancia de los tubos en un espectrofotómetro a 540 nm, previa calibración del equipo con el blanco.

Materiales y Reactivos - Espectrofotómetro (visible) - Celdas para el Espectrofotómetro - Agua Destilada - 1 piseta - 9 tubos de ensayo - 1 gradilla - 2 pipetas graduadas de 5 mL - 2 pipetas graduadas de 1 mL - 1 vaso precipitado 250 mL - 1 vaso precipitado 100 mL

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Instituto Profesional Santo Tomás 2016 Ingeniería en Química Industrial Laboratorio de Bioquímica De acuerdo a los datos. 1. Calcule la concentración de BSA 4,8% en los tubos (2S6S). 2. Complete la tabla con los valores de absorbancia y concentración. 3. Obtenga la ecuación de la recta y el coeficiente de regresión por regresión lineal. 4. Construya una gráfica absorbancia versus concentración, trace la recta obtenida por regresión. 5. Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las cubetas mediante la ecuación 1.5. 6. Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las soluciones originales considerando las diluciones realizadas en el ensayo (ecuación 1.6). Recuerde que Cx (ecuación 1,5) corresponde a Cf. (ecuación 1,6.).

CONCENTRACIÓN MP1 Y = mx + b 0,026 = 0,0458X + 5 x 10-3 CONCENTRACIÓN MP2 Y = mx + b 0,024 = 0,0458X + 5 x 10-3 Conclusión El trabajo práctico en el laboratorio sirvió para que entendamos experimentalmente la importancia de la espectrofotometría a través del método Biuret, donde conocimos el uso del espectrofotómetro, y el cuidado tanto de él como de las celdas que cumplen un rol importante dentro de esta medición. El tiempo en el que reposan las celdas es imprescindible, debido a que al mantenerse por mucho tiempo corren el riesgo a sedimentar y alterar la solución que queramos medir. En nuestra experiencia al ser el último grupo nuestras soluciones dentro de las celdas estuvieron por más de una hora aproximada, por lo que cambió de color y se observó presencia de espuma, y la medida de absorción no iba ser la misma, netamente por el factor de tiempo.

Resultados Absorban cia

Concentració n %

Absorbancia Real

0,012

0

0

0,063

0,96

0,051

0,054

0,768

0,042

0,038

0,576

0,026

0,038

0,384

0,026

0,027

0,192

0,015

0,038

0,4585

0,026

0,036

0,4148

0,024

Anexo 1) Mencione las causas del deterioro de las cubetas. -Limpieza con abrasivos.

m=0,0458 r=0,9706 b=5 x 10-3 2

Instituto Profesional Santo Tomás 2016 Ingeniería en Química Industrial Laboratorio de Bioquímica -Tocar directamente las cubetas, debido al material graso presente. -Manipulación con pinzas o tenazas. -Contacto de la pipeta con las paredes. 2) ¿Cómo se deben limpiar las cubetas? Se debe utilizar una solución alcalina diluida como NaOH 0,1 M y un ácido diluido como HCl 0,1 M o en efecto con agua destilada. 3) Mencione el material de fabricación de las celdas de Espectroscopia UV – VIS. -Para las de UV (quarzo). -Para las de VIS plástico o vidrio. 4) ¿Cuáles son las partes del espectrofotómetro? En su interior contiene un haz de luz, un monocromador, el colimador (lente), el compartimiento de muestra, un detector, un registrador y un fotodetector.

Bibliografía y/o Referencia . Análisis Químico Cuantitativo, Daniel C. Harris, Tercera Edición.

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