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AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS Arboleda, M.A.1; Montaño, D.H.2; Salas, W.R.3 1 [email protected]; 2 [email protected]; 3 [email protected]

Departamento de Química, Universidad del Valle, Santiago de Cali, Colombia Entrega: 17 de Septiembre de 2013

Abstract: Several qualitative and quantitative test were applied to different amino acids and proteins, in order to assess their behavior and properties. The average protein content in egg white was 10.8 % w/w, which was in agreement with the reported value. For the separation and identification of an amino acid mixture, paper chromatography was used, successfully resolving leucine, proline and glutamic acid. Finally, hystidine was titred against sodium hydroxide, which allowed the different pKa’s, isoelectric point (pI) to be calculated: 1.8, 9, and 6.1, for carboxylic, amino, and imidazole side-chain pK’s and 2.1 for the pI. Keywords: Amino acids, egg white protein, Biuret test, Ninhydrin test, Thin-layer chromatography, Acid-base titration, isoelectric point, pKa.

2 1

Introducción

Materiales y métodos

La metodología seguida, así como los reactivos empleados, fueron los mismos de las guías de laboratorio. Brevemente, se sometió a la prolina y glicina, así como a la albumina y aspartame al test de ninhidrina y Biuret cualitativo. Se cuantificó el contenido de proteína en la clara de huevo por espectroscopia UV-Vis. Se llevó a cabo la separación de una mezcla de aminoacidos por cromatografía en papel. Finalmente se caracterizó la histidina por medio de una titulación con hidróxido de sodio.

Las proteínas constituyen gran parte del cuerpo animal: lo mantienen como unidad y lo hacen funcionar. Se las encuentra en toda célula viva. Son el material principal de la piel. Los músculos, tendones, nervios y la sangre, enzimas, anticuerpos y muchas hormonas. Desde un punto de vista químico, las proteínas son polímeros grandes. Son poliamidas y los monómeros de los cuales se derivan son los ácidos α-aminocarboxílicos. Una sola molécula proteínica contiene cientos, e incluso miles, de unidades de aminoácidos, que pueden ser de unos 20 tipos diferentes [1].

3 3.1

El termino aminoácido define a cualquier molécula que contiene un grupo amino y un grupo acido; sin embargo, este término casi siempre para designar un α-aminoácido. [2]

Resultados y discusión Ensayos cualitativos aminoácidos y proteínas

en

La pérdida de los niveles de estructuración superiores al primario (conformación y asociación) se denomina desnaturalización de la proteína. Se conocen casos de desnaturalización reversible e irreversible. Hay numerosos agentes desnaturalizantes, como el calor, pH, sales inorgánicas a concentraciones elevadas, disolventes orgánicos, etc. La desnaturalización conlleva cambios drásticos en las propiedades físicas de las proteínas: solubilidad, grado de hidratación, índice de refracción, etc. Sus propiedades biocatalizadores desaparecen al alterarse el centro activo. Las proteínas que se hallan en ese estado no pueden llevar a cabo la actividad para la que fueron diseñadas, en resumen, no son funcionales[3].

El contenido de proteína y aminoacidos puede determinarse por varias técnicas analíticas e instrumentales. Como técnica rutinaria, la espectroscopia de UV-Vis suele ser un método relativamente rápido de análisis, y un amplio espectro de biomoleculas presenta absorción en el rango del visible – ultravioleta. Las técnicas cromatográficas son técnicas de separación, basadas en la distribución de los analitos en 2 fases de polaridad diferentes de acuerdo a las propiedades de los analitos. Para biomoleculas, las técnicas más empleadas son la cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) y la cromatografía de capa delgada.

Por esta razón se sometieron a diferentes ensayos a 2 proteínas y 2 aminoácidos:

1

En el esquema 1 se muestra la reacción general de la ninhidrina con aminoácidos que contiene grupos aminos primarios.

3.1.1 Reacción con ninhidrina En la tabla 1 se presentan los resultados de los diferentes ensayos, así como sus observaciones. Tabla 1. Observaciones en el análisis cualitativo de aminoácidos y proteínas: Reacción de Ninhidrina

Muestra

Albumina Prolina

Aspartame

Glicina

Observaciones Al adicionar las gotas de ninhidrina no se observó ningún cambio, pero al calentar esta cambio a un color violeta- rosado combinado con blanco. La prolina cambio de un color cristalino a un color amarillo oscuro al adicionarle ninhidrina calentarse El aspartame cambio de un color turbio a un color cristalino al principio del calentamiento y después cambio a un color azul oscuro No se observaron cambios físicos

Esquema 1. Reacción general en la formación del purpura de Ruhemann.

La prolina que tiene un grupo amino secundario, reacciono en la práctica, formando un color amarillo, la diferencia radica en que la prolina es una amina secundaria por tanto su reacción con la ninhidrina no forma el purpura de Ruhemann si no a la formación de un ion iminio, el cual es el posible causante de la coloración amarilla en la reacción, esto hace que también se pueda utilizar la ninhidrina para el análisis de la prolina [7]. En el esquema 2 se presenta la reacción general de la prolina y la ninhidrina.

La ninhidrina (agente oxidante poderoso) es un reactivo muy útil para detectar aminoácidos, cuando reacciona con un aminoácido forma un compuestos coloreado brillante llamado purpura de Ruhemann, llamado así por su descubridor, Siegfried Ruhemann [4].

Esquema 2. Reacción general de la prolina y la ninhidrina

El aspartame cambio a un color azul oscuro al calentarse en presencia de la ninhidrina, debido a la formación del compuesto de Ruhemann.

En el esquema 3 se muestra las reacciones consecutivas así como algunos intermediarios en la formación de purpura de Ruhemann a partir de la reacción de ninhidrina con α-aminoácidos que contienen grupos amino primarios en este caso la glicina el aspartame y aminoácidos de la albúmina.

La clara de huevo también cambio a un color morado pero muy poco intenso en una parte y un color blanco en otra parte al calentarse, esto es debido a que la mezcla con la ninhidrina fue muy poca debido a su viscosidad además la albúmina proteína principal en la clara de huevo sufrió una desnaturalización por temperatura, cuando cosemos un huevo, el calor no modifica los enlaces covalentes de la estructura primaria de la albúmina. Pero si destruye los enlaces más débiles de hidrogeno y entonces la proteína se desenrolla, opacando el color traslucido de la clara de huevo, causa del color blanco presente en el tubo de ensayo [5]. La glicina no cambio de color esto puede ser debido al pH de la solución al cual el grupo amino de la glicina nucleófilo en la reacción se encontraba en + su forma protonada (-NH3 ), por tanto la glicina no reacciono con la ninhidrina, si se hubiese adicionado NaOH, hasta neutralizar la solución, hasta dejar el grupo (–NH2) libre en su forma desprotonada el cual es nucleófilo en la reacción del aminoácido con la ninhidrina posiblemente se hubiese formado el complejo colorido esperado [3, 6].

Esquema 3. Reacciones en la formación del purpura de Ruhemann [3].

2

Los detalles de la mecánica de formación del purpura de Ruhemann han sido objeto de debate, pero está de acuerdo en que la formación de (VII) es una reacción secundaria importante, que resulta de la reacción de ninhidrina con aminoácidos.

La reacción de Biuret es un método general para la determinación de proteínas o péptidos. Es una reacción coloreada debido a la formación de un 2+ complejo de Cu en medio alcalino con compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos. Recibe este nombre por el compuesto Biuret, cuya estructura y la del complejo coloreado (violeta) se presentan en el esquema 5.

En presencia de agua, la indantriona (I) existe en equilibrio con la ninhidrina (II). La reacción inicial puede ser acorde a una base de reacción de condensación tipo Schiff en la triona o una simple reacción SN2 que se traduce en el desplazamiento de hidróxido en la ninhidrina, la condensación con el aminoácido es fundamental para formación del purpura de Ruhemann, ya que el nitrógeno sin duda proviene de este. El compuesto amino en última instancia resulta del ataque inicial en el carbono en posición dos (C2) de la ninhidrina. El compuesto imino (V) se forma bajo ciertas condiciones de la oxidación de (III). La formación oxidativa de la imina es de acuerdo con las observaciones de McCormick y lamothe. Sus estudios sugieren que la (III), que está en equilibrio dinámico con (VIII), esquema 4 es inestable y susceptible a la hidrolisis por ninhidrina en solución para producir la imina y la enodiol (IV). La imina (V) puede hacerse reaccionara continuación con ninhidrina para producir el purpura de Ruhemann (VI), etapa final de la reacción [3].

Esquema 5. Reacción general en la formación del complejo de cobre (II) con proteínas

Al tener la proteínas más de un grupo –CO—NH- dan positiva la prueba de Biuret, con una intensidad de color que es uniforme para todas las proteínas, ya que depende un grupo común a todas ellas, y no de las cadenas laterales de los aminoácidos. Esta es la principal ventaja de este método, junto con la sencillez de su práctica experimental y el bajo costo de reactivo. El principal inconveniente de este método es su sensibilidad relativamente baja: es aplicable a muestras con cantidades superiores a los 100 microgramos [8].

Solamente el átomo de nitrógeno del colorante proviene del aminoácido. El resto del aminoácido se convierte en aldehído y dióxido de carbono. Por lo tanto, todos los alfa aminoácidos con grupos aminos primarios producen el mismo colorante violeta y la intensidad del color es directamente proporcional a la concentración del aminoácido.

Los dipéptidos y los aminoácidos dan esta prueba negativa [9]. Las proteínas disuelven el hidróxido de cúprico del reactivo y forman compuestos coloreados violeta o violeta-rosado que depende de la naturaleza de las proteínas. Para esta prueba se utilizó la clara de huevo se disolvió muy bien con el reactivo de Biuret y cambio a un color violeta como era de esperarse debido a que los péptidos (a partir de los tripéptidos) y las proteínas reaccionan con el reactivo de Biuret formando un complejo de coordinación con los pares de electrones no compartidos del nitrógeno, presentes en los aminoácidos de las proteínas formando el complejo de Biuret mostrado en el esquema 5.

Esquema 4. Equilibrio entre intermediarios en formación del purpura de Ruhemann.

3.1.2 Biuret Cualitativo En la tabla 2 se presentan los resultados del test. Tabla 2. Observaciones del test cualitativo de Biuret

Muestra Albumina

Prolina aspartame Glicina Blanco

Observaciones La albumina se disolvió con el reactivo de Biuret y cambio a un color violeta Cambio a un color azul cristalino Primero cambio a amarillo y después a un color verde biche. Cambio a un color azul cristalino Cambio a un color azul cristalino

El aspartame que cambio de una solución turbia a una solución de color verde biche, el blanco, la glicina y la prolina cambiaron a una solución de color azul cristalino para los cuales se esperaba que fuera esta prueba negativa debido a que no poseen enlaces peptídicos, el color azul observado pudo se debido al reactivo de Biuret que es de color azul y tiño la solución cristalina de los aminoácidos o pudo ser un falso positivo debido a que la en la 3

estructuras de los aminoácidos anteriormente mencionados el grupo amino posee un par de electrones libres los cuales pueden ser donados y aceptados por el ion cobre (II) coordinando varios aminoácidos y generando el complejo de color azul, debido a que sustancia que contienen grupos carbamino, grupos CS(NH), también responde a la prueba. Esto implica que compuestos no proteicos que contienen los grupos necesarios responden a la prueba [10]. Por lo que se podría decir que el color verde y el color azul formado en los respectivos tubos de ensayo son falso positivos y esta prueba fue negativa para estos compuestos debido a que no se formó el compuesto violeta o el compuesto violeta- rosado esperado en la prueba positiva.

trastornar las interacciones hidrofóbicas, generando su desnaturalización.

3.1.4 Efecto del calor La desnaturalización por temperatura ocurre por el aumento de la energía cinética de las moléculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las proteínas, destruyendo las interacciones débiles y desorganizando la estructura de la proteína, de forma que el interior hidrofóbico interacciona con el medio acuoso y se produce la agregación y precipitación de la proteína desnaturalizada. Las interacciones intramoleculares que estabilizan la proteína en su forma nativa, son puentes de hidrógeno, interacciones salinas e interacciones hidrofóbicas [13].

3.1.3 Interacción con osmolitos, ácidos y bases

3.2

En la tabla 3 se presentan los resultados de los diferentes ensayos.

La cuantificación de proteínas por medio de la prueba de Biuret es posible por la formación del complejo tetra-coordinado resultante de la interacción de los pares de electrones no compartidos del nitrógeno (presente en los enlaces peptídicos) y los orbitales libres del ion metálico, 2+ Cu . Este complejo de coloración purpura presenta dos máximos de absorción de radiación electromagnética a 330 nm y a 545 nm. La cantidad de luz absorbida por el complejo es proporcional a la intensidad del color producido, el cual, a la vez, es proporcional al número de enlaces peptídicos. El color alcanza su intensidad máxima a los 10 minutos del inicio de la reacción y es estable durante al menos varias horas. [14]

Tabla 3. Observaciones de los ensayos con ácidos, bases y osmolitos.

Orden de reactivos HCl/NaOH NaOH/HCl Sulfato amonio/Urea Urea/Sulfato amonio

de de

Cuantificación del contenido de proteína en la clara de huevo.

Observaciones Coagulación/No se observó cambio Gelatinización/Disolución de gel; coagulación. Coagulación Coloración amarilla/Coagulación.

La desnaturalización debida a variaciones considerables de pH, ya sea por adición de NaOH o HCl, afectan la envoltura acuosa de las proteínas perturbando la carga eléctrica de los grupos ácidos y básicos de las cadenas laterales de los aminoácidos. Esta alteración de la carga superficial de las proteínas elimina las interacciones electrostáticas que estabilizan la estructura terciaria lo que provoca la precipitación o coagulación de la proteína [11]. Esta desnaturalización es irreversible, por lo que persiste la coagulación incluso al volver al pH inicial.

Con base en la curva de calibración de la guía, y con base en el tratamiento de la muestra, se obtuvo una concentración de 10.8 % p/p. En la tabla 4 se resumen los datos de los grupos del laboratorio. Tabla 4. Datos grupales para el contenido de proteína

# Grupo 2 3 5 ̅ s

La precipitación con sales es un proceso basado en la solubilidad, que es comúnmente utilizado para purificar proteínas. Las proteínas se mantienen disueltas por sus interacciones con el agua, al adicionar sulfato de amonio, las moléculas de agua forman enlaces ion-dipolo con los iones de la sal, disminuyendo la disponibilidad de moléculas de agua en él medio, lo que aumenta la interacción hidrofóbica entre las proteínas.[12]

Concentración (% p/p) 10.8 6.6 2.2 6.5 4.3

La concentración promedio para el grupo fue de 6.5% p/p ± 4.3% p/p. En la literatura se reporta entre 9.7-106% p/p [15]. La alta variación puede ser atribuida ya sea a manejo de las muestras o diferencias entre los huevos empleados. Solo se tomaron los datos que reportan el contenido en gramos de clara, ya que no es correcto reportar el contenido en mililitros de clara, ya que no se midió la densidad de esta. Por otra parte, resultados

La urea forma puentes de hidrógeno con la proteína, estos puentes son más fuertes que los que existen dentro de la proteína por lo que pueden 4

reportados erróneamente como ppbs (mg/mL) no pueden ser tomados en cuenta.

3.3

Cada equivalencia corresponde a la reacción entre un miliequivalente de OH con un miliequivalente del aminoácido en su forma correspondiente al pH de la solución, como se muestra en el esquema 6.

Valoración de histidina

En la figura 1 se presenta la curva de titulación de la histidina (His).

Para la 1ª equivalencia, se requirió una mayor cantidad de OH (1.5 meq) para valorar la His, con respecto al valor teórico (1 meq) ya que se empleó ácido clorhídrico para regular el pH, el cual fue

La curva de titulación obtenida corresponde efectivamente a la titulación de una especie triprótica, como lo es la His, porque consta de 3 puntos de equivalencia, determinables por medio de la gráfica del pH en función de la derivada del pH con respecto a los miliequivalentes de OH (figura 2). Cada punto corresponde a un máximo en dicho gráfico, siendo pH de 3.9 a 1.3 meq; 7.7 a 2.1 meq y 10.7 a 2.8 meq los valores determinados. El punto isoeléctrico corresponde al 2º punto de equivalencia, siendo 7.6 el valor reportado, por lo que el valor obtenido en la titulación presenta un %RSD del 1.3% siendo aceptado [16]

Esquema 6. Estructuras de la histidina según el pH[16]

neutralizado en el proceso. Los valores de pK de los grupos ionizables se determinaron por medio del método de los puntos de equivalencia. Este consiste en hallar el pH correspondiente al número de equivalentes obtenidos al promediar los equivalentes de 2 puntos de equivalencia sucesivos

Titulación de Histidina con NaOH 14 12

pH

10

(1)

8

Para el primer pKa, se toman los meq iniciales, 0, y los de la primera equivalencia, 1.3, obteniendo aproximadamente 0.6 meq. El pH asociado a dicho punto es aproximadamente 1.8, similar al valor teórico para el grupo –COOH de la histidina, 1.82. De manera similar el pKr fue de 6.1 y el pKNH2 fue de 9. Al ser los RSD% inferiores al 1.1%, 1.7% y 1.9% respectivamente, la titulación fue exitosa así como la determinación de los pKs.

6 4 1. Valoración de His (100 mM) con NaOH (100 mM) Figura 2 0 0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

Miliequivalentes de OH- (meq)

3.4

Cromatografía de capa delgada

En la Figura 3 se presenta la placa de celulosa empleado para la cromatografía en papel.

Derivada del pH en función de meq de OH- vs pH 50 45 40 35

pH

30 25 20 15 10

Figura 3. Separación de los aminoácidos en una mezcla (Leu, Pro, Glu). Fase estacionaria NH4OH 2%, Fase móvil 2-propanol.

5 0 0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

dpH/dmeq OHFigura 2. Método de la primera determinación de los pK de la histidina

derivada

para

la

5

En la tabla 5 se presentan los resultados de la separación. Tabla 5. Cálculos del Rf para los patrones de aminoácidos y la mezcla problema

Analito

Desplazamiento

Rf

RfT [17]

Solvente Glu Pro Leu Muestra Mancha 1 Mancha 2 Mancha 3

5.7 cm 2.6 cm 4.3 cm 5.3 cm

0.46 0.75 0.93

0.30 0.43 0.73

2.4 cm 3.4 cm 4.9 cm

0.42 0.60 0.86

Esquema 7. Estructura del aspartame

2) El peso molecular de las proteínas es elevado y por razones obvias, no puede determinarse por métodos normales de la química orgánica. El aumento en la presión osmótica es proporcional a la concentración molar y, en las disoluciones de proteinas es muy pequeño (peso molecular muy alto); solo puede determinarse con aparatos muy sensibles y con mucho error. Algunos métodos útiles para determinar el peso molecular de una proteína se presentan a continuación.

La fase estacionaria en este sistema cromatográfico corresponde al hidróxido de amonio acuoso: El agua ocupa los poros de la celulosa mientras que el hidróxido de amonio asegura un pH básico para la separación, razón por la cual el ácido glutámico, al ser polar posee una mayor afinidad con el agua, reflejándose en su bajo Rf [18-20]. Por otra parte, el 2-propanol al ser menos polar que el agua, hace de fase móvil, puesto que la prolina y leucina, al ser no-polares poseen una mayor afinidad y por tanto un desplazamiento mayor. La leucina posee un carácter más hidrofóbico que la prolina, por la estructura de su grupo –R, lo que se traduce en un mayor Rf. Estos valores son acordes al índice hidropático de cada aminoácido (Leu > Pro > Glu), soportando cualitativamente los Rf obtenidos. [16]

Análisis químico. Se usa cuando uno de los componentes (AA, un metal, etc.) puede determinarse con mucha precisión, el peso molecular o submúltiplos de él. Ultracentrifugación. Se usan ultracentrífugas de 60.000 a 70.000 revoluciones por minutos; la velocidad de sedimentación se relaciona con el peso molecular por la conocida ecuación de Svedberg. Con velocidades menores se obtiene un equilibrio de sedimentación de cuya distribución se deduce también el peso molecular (PM). Estos métodos exigen ultracentrífugas analíticas muy costosas, con sistemas ópticos muy sofisticados.

La separación e identificación fue exitosa debido a la heterogeneidad de los aminoácidos en la mezcla, ya que las marcadas diferencias en sus estructuras se reflejan en los diferentes Rfs obtenidos. De tratarse de moléculas muy similares, la separación sería difícil a causa de la resolución del centro de la ―mancha‖.

Columna de excusión. Para la cromatografía en columna de excusión existen tamices moleculares con tamaños de retículos escalonados. Dentro de sus límites, la velocidad de elución es una funcion lineal del log(PM). Disponiendo de una gráfica (logPM/vol. eluido) obtenida con patrones se puede intercalar el valor del volumen eluido correspondiente al problema y deducir su PM aproximado.

La diferencia con respecto a los valores teóricos encontrados en la literatura, se debe al sistema fase estacionaria/fase móvil empleado, pues cada aminoácido se comporta de manera única ante cada sistema cromatográfico.

4

Electroforesis. La electroforesis en gel de acrilamida con DSS se basa en unificar la carga de todas las proteínas para que la emigración en el campo eléctrico dependa solo del PM. Para ello se hierve la proteína con DSS al 2%; de este modo la cadena hidrófoba del detergente se sitúa sobre las ramas no polares de la proteína y la molécula de proteína queda cubierta de cargas negativas que tapan sus cargas naturales. La migración en estas condiciones es proporcional log del PM.

Preguntas

1) El aspartame (aspartilfenilalanina metil ester) es un dipéptido sintético, un edulcorante de naturaleza proteica. Es 165 a 2200 veces más dulce que el azúcar (sacarosa) y presenta muchas menos calorías que la sacarosa (16kilocalorias de azúcar por cada 1kilocaloria de aspartame). En el esquema 7 se presenta su estructura [24]. 6

rápidos, simples y evitan la menor manipulación analítica de la muestra. Estos son aplicables en cromatografía unidimensional y bidimensional. Se emplean las relaciones entre: contenido de la mancha y forma del cromatograma, peso de la muestra y el área o longitud del punto desarrollado. El adecuado análisis estadístico permite un control de las variables más sensibles a los errores. [21-22]

3)La albumina es una proteínas simple formada por una solo cadena, su aminoácido N- terminal es el ácido aspártico y el C-termina la leucina en la especie humana, su peso molecular es de 66.000, tiene forma de elipsoide con unas dimensiones de 141 Å de eje mayor y 41 Å de eje menor. Por titulación se comprueba que tiene 180 grupos funcionales con actividad iónica, de los que resultan 18 con cargas negativas libres en las condiciones habituales de pH y fuerza iónica. Debido a la existencia en sus moléculas de puentes disulfuros y grupos -SH libres, las moléculas de albumina pueden unirse formando dímeros. Su pequeño tamaño y el gran número de cargas hacen que se desplace en el primer lugar en el patrón electroforético, su pH es de 4.7 unidades.

8) Al tratarse de un endulzante, la calidad del aspartame hace referencia a su nivel de degradación. Por tanto se puede evaluar analizando patrones de ácido aspártico y fenilalanina – productos de la hidrolisis– así como de aspartilfenilalanina. 9) Ver discusión de resultados. 10) La electroforesis es una técnica analítica basada en las propiedades de una molécula cargada en un medio al cual se le aplica un campo eléctrico. El movimiento de la molécula depende proporcionalmente del campo aplicado, así como de su carga, pero es inversamente proporcional a la viscosidad del medio. Puesto que cada molécula en la mezcla posee una relación única entre carga y tamaño y su movilidad en el campo eléctrico, la electroforesis se emplea como análisis de pureza y tamaño de macromoléculas.

La albúmina de suero sanguíneo o ser albúmina se encarga de transportar sustancias de naturaleza química muy diversa, como ácidos grasos, aminoácidos, esteroides, metales (como el calcio), y numerosos fármacos, facilitando la transferencia de muchas de ellas desde la circulación sanguínea a órganos como el hígado, el riñón, el intestino y el cerebro [25]. 4) La excreción diaria de proteína en personas sanas suele ser cercana a los 0.15 g; una concentración mayor se conoce como proteinuria. Algunos ejemplos de estas variaciones de la concentración de ciertas proteínas en la orina son: en el mieloma múltiple, la excesiva producción de inmunoglobulinas conlleva una excreción urinaria de la proteína Bence-Jones. En la pancreatitis aguda, la elevada concentración de α-amilasa en plasma permite su aparición en la orina, al igual que hemoglobina en las anemias hemolíticas o la lisozima en la leucemia mielomonocítica[26].

11) En general, la mezcla se inyecta en una solución buffer sobre el medio que actúa como soporte. Se procede a aplicar una diferencia de potencial, haciendo que el campo eléctrico impulse las moléculas cargadas a migrar hacia los electrodos. La electroforesis capilar es una versión instrumental de la electroforesis ordinaria, en donde se emplean capilares y menores tamaños de muestra para realizar la separación; a la salida del capilar se emplea un detector ya sean espectrométricos o electroquímicos, siendo similar entonces a las técnicas instrumentales de cromatografía. La electroforesis en gel, es empleada para analizar moléculas de mayor tamaño, como proteínas y ácidos nucleicos, requiere mayor cantidad de muestra. Al ser un medio más viscoso, la migración de moléculas pequeñas es mayor al de moléculas grandes. En ambos casos, el medio soporte (relleno del capilar o gel) puede adecuarse para permitir la migración de diferentes analitos debido a que se puede controlar el tamaño de poro.

5) 6) Ver discusión de resultados 7) Con una placa de considerable longitud es posible separar los 20 aminoácidos, porque el Rf al ser una relación, en una placa más grande se pueden resolver con facilidad compuestos con Rf similares. Con respecto a su cuantificación, existen métodos tanto ex situ, que consisten en la elución del componente y su cuantificación por espectrofotometría, como métodos in situ, basados en la correlación matemática existente en la forma de la forma mancha de la muestra, así como el peso de esta.

Actualmente, gracias al desarrollo tecnológico, se emplea para especiación de biomoleculas, análisis de fármacos, análisis de inhibición celular, análisis de ADN y ARN y análisis de muestras. [20-23]

Los métodos ex situ, son laboriosos, requieren una manipulación excesiva de la muestra, haciéndolos analíticamente poco adecuados, y conllevan a porcentajes de recuperación entre el 60 y 95 % por ciento. Por su parte, los métodos in situ son 7

5

[9] Quesada, M. S. Manual de Experimento de Laboratorio para Bioquímica. 1ed. Costa Rica: Universidad Estatal a Distancia, 2007. p. 31.

Conclusiones

Los diferentes ensayos cualitativos permitieron caracterizar los comportamientos de las proteínas y aminoacidos estudiados en diferentes condiciones de pH, temperatura, solvente, así como sus reacciones con reactivos específicos para estas biomoleculas.

[10] Guarnizo, A.; Martínez, P. Química Orgánica con Enfoque en Ciencias de la Vida. 1ed. Armenia, Quindío, Colombia: Elizcom. p. 183

El contenido de proteína en clara de huevo fue de 10.8% p/p. El contenido grupal presento una mayor variación, siendo de 6.5% p/p (%RSD 62.5%), posiblemente a manejo de la muestra, degradación de la proteína, así como diferencias y calidad de los huevos. A pesar de esto, el valor que se obtuvo, está acorde con el reportado en la literatura.

[11] Lehninger, A.L, Principios de Bioquímica. España: Editorial omega, 2008. pp.7140-141 [12] Campbell, M.; Bioquímica. Cengage Learning Editores, 2004. P 118 [13] Lehninger, N. Principios de Bioquímica.http://bcs.whfreeman.com/lehninger 5e/ (Acceso Sep 16, 2013)

La cromatografía en papel permitió la exitosa separación de los componentes de la mezcla de leucina, prolina y ácido aspártico.

[14] Roca, P.; Oliver, J.; Bioquímica: técnicas y métodos: Editorial Hélice, 2004. P. 157

La titulación con hidróxido de sodio de la histidina permitió caracterizar su punto isoeléctrico así como los pKas de sus grupos carboxilo, amino y cadena lateral.

6

[15] Mine, Y: Recent advances in the understanding of egg White protein functionality. Trends Food Sci Technol. 1195,6: 225-232 [16] Nelson, D. L.; Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry; W. H. Freeman, 2010. pp. 7385. [17] Biotopics Chromatography of amino acids. http://www.biotopics.co.uk/as/amino_acid_chro matography.html (accessed September 16, 2013). [18] Katoch, R. Analytical Techniques in Biochemistry and Molecular Biology; Springer: New York, 2011. pp. 43-46. [19] Handbook of Thin-Layer Chromatography; Sherma, J.; Fried, B., Eds.; 3rd ed.; Marcel Dekker, Inc: New York, 2003. pp. 167, 185. [20] Boyer, R. Biochemistry Laboratory Modern Theory and Techniques; 2nd ed.; Prentice Hall: Upper Saddle River, 2012. [21] Spangenberg, B.; Poole, C. F.; Weins, C. Quantitative Thin-Layer Chromatography; Springer Heidelberg Dordrecht: New York, 2011. [22] Barakat, M. F.; Farag, A. N.; El-Gharabawy, A. Quantitative paper chromatography of amino acid mixtures by spot comparison methods. Chromatographia 1975, 8, 404–409. [23] Skoog, D. A.; Crouch, S. R.; Holler, F. J.; Anzures, M. B. Principios de analisis instrumental / Principles of Instrumental Analysis; Cengage Learning Latin America, 2008. Pp. 867.871. [24] García, G. M.; Quintero, R. R.; López, M. A. Biotecnología Alimentaria. 5ed. México, D. F: Limusa, 2004. p. 542

Bibliografia

[1] MORRISON, R. Química Orgánica. 5ed. Boston: Addison - Wesley Iberoamericana, 1996. p. 1323-1325. [2] WADE, L. Química Orgánica. 5ed. España: Pearson Educación, 2003. p. 1166-1169.

[3] Goi, F.M; Macarulla, J.M; Goñi, F.M. Bioquímica a Humana. 2 ed. Barcelona: Reverté, S.A.; 1994. p 114. [4] Tyler, D.; Richard, C.; Cheryl, D. J. Org. Chem. 2001, 66, 7596.

[5] Lehninger, A.L. (1991): Bioquímica. España: Editorial omega, 1991. pp.73-84

2ed.

[6] Starr, C.; Taggart, R. Biología la Unidad y la Diversidad de la Vida. 11ed. Cengage Learning Editores, 2008. p. 43-45 [7] Ocampo, R.; Ríos, L. A.; Betancur, L. A.; Ocampo, D. M. Curso Práctico de Química Orgánica Enfocado a Bilogía y Alimentos. 1ed. Universidad de Caldas, 2008. p. 153-156 [8] Battaner, A. E. Biomoléculas. 1ed. Españas: Ediciones Universidad Salamanca, 1993. p. 264-265.

[25] Teijón, R. J. Bioquímica Estructural Conceptos y Test. 1ed. Madrid: Telbar, 2004. p. 109-110 8

[26] Primo, Y. E. Química Orgánica Básica y Aplicada de la Molécula a la Industria. 1ed. Barcelona: Reverté, 1995. p. 998-999.

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