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PRE INFORME PRÁCTICA DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA

PRÁCTICA No. 1: METODOS CUALITATIVOS PARA LA IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS Y PROTEINAS

Betty Segura Moreno, CÓDIGO: 23781.494, e-mail: [email protected], estudiante de Bioquímica – UNAD Universidad Nacional Abierta y a Distancia. Escuela de Ciencias Básicas, Tecnología e Ingeniería-ECBTI. Bioquímica Mediación: CV, Grupo: 81 CEAD: Tunja Boyacá- Colombia.

Tutor de laboratorio: Nombre APELLIDO: Nubia Valcárcel,([email protected]). Licenciada en Química y Biología con maestría en Docencia de la Química. Sesión de laboratorio 1: Octubre 05 de 2014

Estudiante Betty SEGURA MORENO

Correo electrónico estudiante [email protected] s

Código

Grupo de campu s

Correo electrónico tutor campus

23.178.49 4

81

[email protected] .co

1. Objetivos de la práctica

 Reconocer los aminoácidos como unidades estructurales de las Proteínas.  Analizar, mediante reacciones cualitativas coloreadas la presencia de aminoácidos y enlaces peptídicos en las muestras.

 Establecer la relación entre la estructura y la función de las proteínas y pérdida de esta al variar su pH y solubilidad (precipitación y desnaturalización).

2. Marco teórico

Fundamentación Teórica

1. Capítulo 1 y 2 de la Unidad 1: Biomoléculas del módulo del curso, enfatizando en: Clasificación de aminoácidos, Enlace peptídico, Niveles de estructuración, desnaturalización por calor y pH extremos.

Solubilidad

de

proteínas:

Precipitación por metales pesados, Precipitación acídica 2. Pruebas cualitativas: enfatizar en las reaciones químicas que tienen lugar y el principio del método: Reación de la ninhidrina, Reación xantoproteica, Reación de millón, Reación del ácido glioxílico, Prueba de Pauly, Prueba del Nitroprusiato, Reación de Sakaguchi prueba de Biuret.

3. Defina aminoácido: Que grupos funcionales están presentes en los aminoácidos? Cómo ellos están relacionados con las propiedades ácido básicas. 1. Algunos autores clasifican los aminoácidos de varias formas, por ejemplo, en esenciales y no esenciales, en alifáticos y aromáticos, o quizá la más acertada; de acuerdo a la polaridad, presencia de cargas y composición química de la cadena lateral “R” de los aminoácidos. De un argumento válido de ésta última clasificación en dónde se explique el porqué de esta.

 Aminoácidos con grupos R no polares o hidrofóbicos Existen 8 aminoácidos que contienen grupos R no polares o hidrofóbicos. Entre los cuales se encuentran la alanina, la leucina, la isoleucina, la Valina, la prolina, la fenilalanina, el triptófano y la metionina. Estos aminoácidos son menos solubles en

el agua que los aminoácidos con grupos R polares. El menos hidrófobo de esta clase de aminoácidos es la alanina, la cual se halla casi en la línea fronteriza entre los aminoácidos no polares y los que poseen grupos R polares.

 Aminoácidos con grupos R polares sin carga. Estos aminoácidos son respectivamente más solubles en el agua que los aminoácidos anteriores. Sus grupos R contienen grupos funcionales polares, neutros que pueden establecer enlaces de hidrógeno con el agua. La polaridad de la serina, la treonina y la tirosina se debe a sus grupos hidroxilos; la de la Aspargina y la glutamina, a sus grupos amídicos y de la cistina a la presencia del grupo sulfhidrilo (-SH). La glicola, a veces se clasifica como un aminoácido no polar. La cistina y la tirosina poseen las funciones más polares de esta clase de aminoácidos, sus grupos tilo e hidroxilo fenólico tienden a perder mucho más fácilmente protones por ionización que los grupos R de otros aminoácidos de esta clase.

 Aminoácidos con grupos R cargados positivamente. Los aminoácidos en los que los grupos R poseen carga positiva neta a PH 7, poseen todos seis átomos de carbono. Aquí se encuentran la lisina, la arginina y la histidina. Esta última tiene propiedades límite. A pH 6 más del 50 % de las moléculas de la histidina, poseen un grupo R cargado positivamente, pero a pH 7 menos del 10 % de las moléculas poseen carga positiva.

 Aminoácidos con grupos R cargados negativamente. Los dos miembros de esta clase son los ácidos aspártico y glutámico, cada uno de los cuales posee un segundo grupo carboxilo que se halla completamente ionizado y por tanto cargado negativamente a pH 6 y 7.

2. Qué implicaciones tiene la Cadena lateral de los aminoácidos en sus propiedades químicas y en los métodos de identificación en el laboratorio?

“R” de los aminoácidos. De un argumento válido de ésta última clasificación en dónde se explique el porqué de esta. Porque ello afecta las características bien sea que el aminoácido se encuentre libre o en solución o combinados con otros en una proteína. En efecto la carga laterales de las proteínas está determinada por los grupos ionizables de las cadenas laterales de los aminoácidos.

3. En este laboratorio, Usted va a identificar algunos aminoácidos que están dentro de la composición de un tejido biológico. Explique brevemente, que pruebas usaría para identificar los siguientes aminoácidos y porque?: Tirosina, Fenilalanina, Aminoácidos aromáticos, Triptófano, Metionina y cisteína, Grupos aminos libres.

Aminoácidos que están dentro de la composición de un tejido biológico que pruebas usaría para identificar los siguientes aminoácidos y porque?: Tirosina, Fenilalanina, Aminoácidos aromáticos, Triptófano, Metionina y cisteína, Grupos aminos libres.edu.co Prueba xantoprotica: aromáticos.

Fenilalanina,

Tirosina,

Triptófano,

Aminoácidos

Es una reacción que reconoce los aminoácidos que poseen el grupo bencénico (tirosina, fenilalanina, triptófano). Las proteínas que tienen en su composición estos aminoácidos también darán la reacción. La positividad se reconoce por la aparición de un color amarillo o verde debido a la formación de nitrocompuestos.

Prueba de Sakaguchi: Grupos aminos libres Es una prueba para identificar arginina y se usa para identificar proteínas ya que casi todas las proteínas poseen ese aminoácido. El desarrollo de un color rojo marca la reacción positiva y se debe a la presencia del grupo guanidina, que caracteriza la arginina.

4. Que es el enlace peptídico, represéntelo. ¿Qué prueba usa en el laboratorio para identificarlos? ¿en qué se fundamenta?

El enlace peptídico es un enlace entre el grupo amino (–NH2) de un aminoácido y el grupo carboxilo (–COOH) de otroaminoácido. Los péptidos y las proteínas están formados por la unión de aminoácidos mediante enlaces peptídicos. El enlace peptídico implica la pérdida de una molécula de agua y la formación de un enlace covalente CO-NH. Es, en realidad, un enlace amida sustituido. Para nombrar el péptido se empieza por el NH2 terminal por acuerdo. Si el primer aminoácido de nuestro péptido fuera alanina y el segundos erina tendríamos el péptido alanil-serina.

5. Que es una proteína

Las proteínas son moléculas de un enorme tamaño formadas por aminoácidos, que tienen diversas funciones, desde estructurales como el colágeno en nuestra piel, funciones metabólicas como la insulina, que regula los niveles de azúcar en nuestra sangre, también existen proteínas que presentan una función de transporte como la hemoglobina, la cual transporta el oxígeno que respiramos a todo nuestro cuerpo. Las proteínas son biopolímeros (macromoléculas orgánicas), de elevado peso molecular, constituidas básicamente por carbono (C), hidrógeno (H), oxígeno (O) y nitrógeno (N); aunque pueden contener también azufre (S) y fósforo (P) y, en menor proporción, hierro (Fe), cobre (Cu), magnesio (Mg), yodo (Y), entre otros elementos.

6. Complete el siguiente cuadro, relacionada con proteínas Niveles de estructuración que puede tener una proteína Estructura primaria

Clasificación de las proteínas según su solubilidad Según su composición:

La estructura primaria es la secuencia de aminoácidos de la proteína. Nos indica qué aminoácidos componen la cadena polipeptídica y el orden en que dichos aminoácidos se

Proteínas simples u Holoproteínas: Las cuales están formadas exclusivamente o predominantemente por aminoácidos.

encuentran. La función de una proteína depende de su secuencia y de la forma que ésta adopte. Estructura secundaria La estructura secundaria es la disposición de la secuencia de aminoácidos en el espacio. Los aminoácidos, a medida que van siendo enlazados durante la síntesis de proteínas y gracias a la capacidad de giro de sus enlaces, adquieren una disposición espacial estable, la estructura secundaria. Estructura terciaria La estructura terciaria informa sobre la disposición de la estructura secundaria de un polipéptido al plegarse sobre sí misma originando una conformación globular. En definitiva, es la estructura primaria la que determina cuál será la secundaria y por tanto la terciaria. Esta conformación globular facilita la solubilidad en agua y así realizar funciones de transporte, enzimáticas, hormonales.

Proteínas conjugadas: Poseen un componente de proporción significativa no aminoacídico que recibe el nombre de grupo prostético. Según la naturaleza de este grupo consideramos: Glicoproteínas: Se caracterizan por poseer en su estructura azúcares. Se pueden citar como ejemplo: las inmunoglobulinas, algunas proteínas de membrana, el colágeno y otras proteínas de tejidos conectivos (glucosaminoglicanos). Lipoproteínas: Proteínas conjugadas con lípidos que se encuentran en las membranas celulares. Nucleoproteínas: Se presentan unidas a un ácido nucleico, como en los cromosomas, ribosomas y en los virus. Metaloproteínas: Contienen en su molécula uno o más iones metálicos que no constituyen un grupo hem. Por ejemplo algunas enzimas. Hemoproteínas o Cromoproteínas: Proteínas que tienen en su estructura un grupo hem (Figura 1). Ejemplo: Hemoglobina, Mioglobina y ciertas enzimas como los citocromos.

Estructura cuaternaria De acuerdo con su morfología y solubilidad: Esta estructura informa de la unión, mediante enlaces débiles (no covalentes) de varias cadenas polipeptídicas con estructura terciaria, para formar un complejo proteico. Cada una de estas cadenas polipeptídicas recibe el nombre de protómero. El número de protómeros varía desde dos, como en la hexoquinasa; cuatro, como en la hemoglobina, o muchos, como la cápsida del virus de la poliomielitis, que consta de sesenta unidades proteicas.

Proteínas fibrosas: Son insolubles en agua, presentan formas moleculares alargadas, con un número variado de cadenas polipeptídicas que constituyen fibras resistentes, con cierto grado de elasticidad, fragilidad o ductilidad. Funcionan como proteínas estructurales o de soporte. Las más comunes son: Elastina, Colágeno, Queratina, Fibrina, etc. Proteínas Globulares: Tienden a ser más solubles en agua, debido a que su superficie es polar. Sin embargo, pueden presentar mayor solubilidad en otros solventes como soluciones salinas, ácidos o bases diluidas o alcohol. Su estructura es compacta con formas casi esféricas. La mayoría de las proteínas conocidas son globulares, dentro de las que se consideran todas las enzimas, las proteínas del

plasma y las presentes en las membranas celulares. A su vez las proteínas globulares se pueden clasificar de acuerdo con su solubilidad: Albúminas: Proteínas fácilmente solubles en agua, que coagulan con el calor y precipitan con las soluciones salinas saturadas. Por ejemplo la Lactoalbúmina, albúmina del suero, la ovoalbúmina (presente en la clara del huevo). Globulinas: Escasamente solubles en agua pura, pero solubles en soluciones salinas diluidas como cloruro de sodio, entre ellas se encuentran las seroglobulinas (sangre), ovoglobulina, inmunoglobulinas, etc. Glutelinas: Solubles en ácidos y bases diluidos, insolubles en solventes neutros. Ejemplo: La Glutenina del trigo. Prolaminas: Solubles en alcohol del 70 al 80%, insolubles en agua, alcohol absoluto y otros solventes neutros, como la Zeína del maíz y la Gliadina del trigo. 3. de acuerdo con su función biológica: Proteínas estructurales: Forman parte de células y tejidos a los que confieren apoyo estructural. Dentro de estas podemos citar, el colágeno y la elastina presentes en el tejido conectivo de los vertebrados. La queratinas de la piel, pelo y uñas y la espectirna presente en la membrana de los eritrocitos. Proteínas de transporte: Como su nombre lo indica, transportan sustancias como el oxígeno en el caso de la hemoglobina y la mioglobina, ácidos grasos en el caso de la albúmina de la sangre, o las que realizan un transporte transmembrana en ambos sentidos. Proteínas de defensa: Protegen al organismo contra posibles ataques de agentes extraños, entre las que se consideran los anticuerpos (inmunoglobulinas) de la fracción gamma globulínica de la sangre, las proteínas denominadas interferones cuya función es inhibir la proliferación de virus en células

infectadas e inducir resistencia a la infección viral en otras células, el fibrinógeno de la sangre importante en el proceso de coagulación. Proteínas hormonales: Se sintetizan en un tipo particular de células pero su acción la ejercen en otro tipo. Ejemplo, la insulina. Proteínas como factores de crecimiento: Su función consiste en estimular la velocidad de crecimiento y la división celular. Como ejemplo se puede citar la hormona de crecimiento y el factor de crecimiento derivado de plaquetas. Proteínas catalíticas o enzimas: Permiten aumentar la velocidad de las reacciones metabólicas. Dentro de las células son variadas y se encuentran en cantidad considerable para satisfacer adecuadamente sus necesidades. Entre otras se consideran las enzimas proteolíticas cuya función es la degradación de otras proteínas, lipasas, amilasas, fosfatasas, etc. Proteínas contráctiles: Son proteínas capaces de modificar su forma, dando la posibilidad a las células o tejidos que estén constituyendo de desplazarse, contraerse, relajarse razón por la cual se encuentran implicadas en los diferentes mecanismos de motilidad. Las proteínas más conocidas de este grupo son la actina y la miosina. Proteínas receptoras: Proteínas encargadas de combinarse con una sustancia específica. Si se encuentran en la membrana plasmática, son las encargadas de captar las señales externas o simplemente de inspeccionar el medio. Si encuentran en las membranas de los organelos, permiten su interacción. Sin embargo, no son proteínas exclusivas de membrana ya que algunas se encuentran en el citoplasma. El ejemplo más típico de éstas son los receptores de las hormonas esteroides. Casi todos los neurotransmisores, la mayoría de las hormonas y muchos medicamentos funcionan gracias a la presencia de estas proteínas.

Proteínas de transferencia de electrones: Son proteínas integrales de membrana, comunes en las mitocondrias y cloroplastos cuya función se basa en el transporte de electrones desde un donador inicial hasta un aceptor final con liberación y aprovechamiento de energía. Como ejemplo se citan a los Citocromos que hacen parte de la cadena respiratoria.

7. Cuál es la diferencia de precipitar y desnaturalizar una proteína. Es unos métodos para precipitar las sustancias de sus soluciones. Estos métodos tienen su principal aplicación en la desproteinización de los diversos fluidos biológicos (sangre, orina, liquido cefalorraquídeo, etc.) en los cuales se hace necesaria su interferencia en la determinación de otras sustancias presentes en estos medios.

Las proteínas son precipitadas de sus soluciones por ciertos ácidos tales como Zn +++, Hg ++, Fe ++, Cu++ y Pb ++. En general se aplica esta precipitación para los precipitantes pacidos a través de la formación catiónica de las moléculas de proteína.

La desnaturalización de las proteínas es la pérdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura tridimensional fija. Cualquier factor que modifique la interacción de la proteína con el disolvente disminuirá su estabilidad en disolución y provocará la precipitación.

8. Elabore el diagrama de flujo de la marcha de la práctica y tablas de resultados en blanco. Los aminoácidos como unidades estructurales.

Relación entre la estructura la función de las proteínas

Reacciones cualitativas coloreadas: presencia de aminoácidos y enlaces peptídicos

Reactivos

Tabla de resultados

3. Metodología

Imagen

La pérdida de esta al variar su pH y solubilidad (precipitación y desnaturalización

a. Materiales: Listado

Equipos Estufas pHmetro (1) Centrifuga Balanza analítica Termómetros 120ºC Mecheros

Material de vidrio Material de vidrio Gradillas Espátulas Pipetas 1, 5 y 10ml Malas de asbesto Papel filtro Embudos Agitador de vidrio Erlenmeyer 10 y 250 ml Vasos de precipitado 250 ml Vasos precipitado 50 ml Probeta 10 ml Pinzas para tubos en madera Vidrios reloj grandes

Mortero con mango Soporte para embudos Pinzas para tubos de ensayo metálicas Vasos de precipitado de 100 ml plástico Vasos de precipitado de 60 plástico

Material biológico y otros (estudiantes)

Alimento de origen vegetal o animal: concentrados, proteína cárnica, hígado, huevo, etc. Tapabocas Libros de bioquímica Marcador de vidrio Cinta para rotular Cuaderno de laboratorio Bata blanca Marcador para vidrio

Reactivos Reactivo de millón Agua destilada, Solución de CuSO4 1% Solución NaOH 30% y 40%, Solución saturada de NaCl HNO3 concentrado, Cristales de sacarosa HCl concentrado, Acido triclorácetico 10% Solución ácido pícrico saturada, Etanol 95% Solución de (NH4SO4) al 50%, acetona

Solución de acetato de plomo 0.5 % Reactivo de sakaguchi, Ácido acético glacial HSO4 concentrado, Ácido acético al 30% Aminoácidos: glicina, tirosina, triptófano, aminoácidos azufrados, leucina Ninhidrina (2 g/l) prepárese en fresco, Hidróxido de amonio. Ácido sulfanilco (10 g/l en solución de HCl 1 mol/). Nitrito de sodio, Carbonato de sodio Acetato de plomo, Nitrato de mercurio. Nitroprusiato de sodio (20 g/l, prepárese fresco). Alfa- naftol, Agua de bromo Ácido fosfórico, Molibdato de sodio Tungsteno de sodio, Sulfato de cobre, Nitrato de sodio

Descripción de la práctica

Procedimiento: 1. Pruebas Cualitativas 1. 1 Obtención de los Extractos: -En el caso de alimentos en polvo, coloque unos 30 gramos en un vaso de precipitado, agregue 10 ml de agua destilada, agite durante 10 minutos y filtre a través de tela limpia. Conserve el líquido (filtrado) para las pruebas de las proteínas. -En el caso de los alimentos concentrados ó sólidos, muélala o macérelas por separado y recoja el molido en vasos de precipitado. Agregue 10 ml de agua destilada, agite durante 10 minutos y filtra a través de tela. Recoja los filtrados en vasos de precipitado o en Erlenmeyer previamente marcados. Deseche los residuos.

-En el caso de la solución de clara de huevo: Haga un pequeño orificio en uno de los extremos del huevo y vierta por él aclara en un vaso precipitado, dejando dentro la yema. Luego agregue a la clara 10 ml de agua destilada y agite con el fin de disolverla.

5. Referencias

(2014, 10, 02.) Disponible en: http://www.monografias.com/trabajos10/amin/amin.shtml

(2014, 10, 02.) Disponible en http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2000024/lecciones/cap01/01_01_12.htm

(2014, 10, 02.) Disponible en http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmendez/manuales%20PDF/EXPERIMENTO %202%20IDENT%20AA%2006-04.pdf

(2014, 10, 02.) Disponible en http://es.slideshare.net/Ichiriki/bioquimica-estructural

(2014, 10, 02.) Disponible en http://www.bioquimica.dogsleep.net/Laboratorio/Plummer/Chp05a.pdf