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Informe 1: Extracción del ADN y visualización del ADN Laura Daniela Agualimpia Calvache1, María José Castillo Silva2 Laboratorio de Bioquímica Química Farmacéutica1,2 Facultad de Ciencias Naturales1,2 Universidad ICESI Santiago de cali, 27 de agosto del 2019

OBJETIVOS GENERALES 1.

Extraer la mayor cantidad posible del ADN proveniente de la mucosa bucal de un estudiante, haciendo uso de una metodología correcta.

2.

Cuantificar y visualizar la extracción de ADN obtenida con anterioridad. ESPECÍFICOS

1. Identificar el botón de ADN aislado por el uso de sustancias adecuadas para realizar una buena extracción. 2. Homogeneizar en lo máximo el ADN con el buffer TE para hacer posible su cuantificación. 3. Hacer uso preciso del instrumento designado para inyectar el ADN disuelto en el pozo de la cámara con gel agarosa.

RESULTADOS

Tabla 1. Resultados de la absorción de luz UV del ADN en el espectrofotómetro de acuerdo a los dos tipos de longitud de onda. Factor de

Densidad óptica (D.O) a 260

Densidad óptica (D.O) a 280

dilución

nm

nm

1:100

0.052 A

0.057 A

1:10

0.162 A

0.157 A

- Concentración de la muestra de ADN usando el valor de D.O a 260 nm para el factor de dilución 1:100. [ADN]= 50𝜇𝑔. 𝑚𝐿−1 𝑥𝐷. 𝑂260 𝑛𝑚 𝑥𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 (1) 1

[ADN]= 50𝜇𝑔. 𝑚𝐿−1 𝑥0.052𝑥 100 = 0.026𝜇𝑔. 𝑚𝐿−1 -Concentración de la muestra de ADN con el factor de dilución 1:10. Haciendo uso de la ecuación (1) 1

[ADN]= 50𝜇𝑔. 𝑚𝐿−1 𝑥0.162𝑥 10 = 0.81𝜇𝑔. 𝑚𝐿−1 -Relación 260/280 con el D.O del factor de dilución 1:100. 𝐷.𝑂260 𝑛𝑚 𝐷.𝑂280 𝑛𝑚

(2)

0.052 = 0.91 0.057 -Relación 260/280 con el D.O del factor de dilución 1:10.

Haciendo uso de la ecuación (2) 0.162 = 1.06 0.153

Imagen 1. En esta imagen se puede observar el desplazamiento que tuvo la molécula de ADN (segundo pozo de abajo hacia arriba) por la separación de sus componentes en el gel de agarosa. No se pudo visualizar un rastro definido, debido a el daño en el pozo en el que se encuentra. DISCUSIONES Esta práctica se inició depositando 2.5 mL de una muestra de saliva en una probeta, la cual fue traspasada a un tubo falcón y agitada mediante el método de inversión de manera conjunta con 2.5 mL de solución SDS (sodio dedecil sulfato) al 10%, este actúa como detergente anicónico que desnaturaliza las proteínas, membranas y tejidos (Mosquera, 2005); además, elimina sus estructuras secundarias y terciarias evitando así que una valiosa cantidad de ADN quede apresada en los restos

celulares y/o desechos. Después, se le agregó a la mezcla anterior 50 μL de NaCl 5 M para evitar la unión de las proteínas al ADN gracias a su poder icónico en la solución; asimismo, la alta concentración utilizada (5M) se utiliza para prevenir la contaminación en la muestra con polisacáridos que afectan de manera directa la pureza del ADN, siendo capaz de abstener la actividad de ciertas enzimas como ligasas, polimerasas, y endonucleasas de restricción, pues los cimientos para la separación de los polisacáridos precipitan bajo la acción de fuerzas centrífugas (Alejos, L; Aragon, M & Romero, A; s.f). De manera seguida, se añaden 10 mL de etanol al 96% a 20Cque cumplirá la función de ayudar a separar el ADN de distintos componentes celulares, puesto que al no mezclarse con el ADN lo precipita, dando paso a la observación del llamado botón de ADN. Dicho botón, es retirado del tubo falcon con la ayuda de una punta doblada de micro pipeta la cual hace más fácil su transferencia al eppendorf. La segunda parte del laboratorio consistió en cuantificar la muestra extraída, este procedimiento sirve para conocer la pureza de la muestra y la concentración que se logró extraer de ella. Para esto, primero se secó el botón de ADN a 55°C durante 2 minutos para evaporar los restos de etanol que contuviera. segundo, se añadió 1 mL de buffer TE para hidratar el botón y mantenerlo en solución. Esta disolución se debía homogenizar completamente en el agitador vortex para continuar con el proceso de cuantificación; sin embargo, esta muestra no logró mezclarse absolutamente, así que se utilizó una micropipeta para expulsar y absorber el contenido varias veces y mejorar un poco más la homogeneización. Después, se realizó una dilución de 1:100 que contenía 10Lde la muestra con buffer TE y 990Lde buffer TE, y otra dilución de 1:10 que contenía 100Lde la muestra con buffer TE y 900Lde buffer TE. Ambas diluciones fueron introducidas en el espectrofotómetro, el cual les radia UV a unas longitudes de onda de 260 nm y 280 nm para identificar qué cantidad de luz puede absorber el ADN, es decir, su densidad óptica (D.O) que es gracias a la presencia de electrones deslocalizados en los anillos aromáticos de las bases nitrogenadas a lo largo de sus cadenas (Academia, s.f). Los valores obtenidos de este procedimiento están registrados en la Tabla 1 y se utilizaron para calcular la concentración de ADN en nuestra muestra para los dos casos de

diluciones, aquí podemos observar que los resultados concuerdan con la cantidad de muestra que se adiciono en cada caso. Es importante conocer la concentración de lo que se fue capaz de extraer para investigaciones que necesitan saber lo que realmente tienen de ADN. Por último, se realizó una relación entre el D.O a 260 nm con el D.O a 280 nm, tanto en la disolución 1:100 como en la disolución 1:10, obteniendo como resultados 0.91 y 1.06 respectivamente. Esta relación nos indica que nuestra muestra no fue lo suficientemente pura porque tenemos valores inferiores a 1.6, por lo tanto, nuestros resultados de las concentraciones no son las adecuadas (Universidad Nacional de Quilmes, S.f). Esto se debe a que nuestro método para la extracción del ADN no fue lo suficientemente eficiente, ya sea por el tiempo que se invirtió en el secado del etanol o la insuficiencia de homogeneización de la muestra con el buffer TE. La última parte del laboratorio se basó en poder realizar la electroforesis del ADN en el gel agarosa. El cual es un método muy utilizado para separar franjas de ADN por su carga y tamaño. Dicha técnica se basa en aplicar una corriente eléctrica por medio de un gel que posee varias moléculas de interés. Teniendo en cuenta su carga y tamaño, las moléculas se desplazan por el gel a distintas velocidades y direcciones, con lo que se dividen unas de otras. Los geles utilizados para este proceso, comúnmente se encuentran hechas por un polisacárido llamado agarosa, el cual suele encontrarse en forma de ´´hojuelas secas´´ pulverizadas. Uno de los elementos más importantes al momento de realizar la electroforesis es el buffer de carga. Dichas sustancias son aquellas que facilitan la sedimentación y visualización del producto proporcionado por el PCR o ácidos nucleicos en los pozos, en el cual se emplean los distintos tipos de colorantes, y cada uno de ellos proporciona un patrón de migración distintas. En este caso se hizo uso del TBE 1 X (Tris-Borato EDTA) el cual es una sustancia con una gran capacidad amortiguadora y discriminatoria en gel agarosa al 2%. Lo que significa, que mientras las geles agarosas con una gran concentración (2% a 3%) ponen una gran resistencia a la circulación de los ácidos nucleicos de modo que permiten lograr una mayor resolución y por ende una observación más nítida, las geles agarosas con una concentración baja (0.5 % a 1%) no posee la suficiente fuerza para lograr detener

de manera constante los ácidos nucleicos, ocasionando que el espectro a observar después del recorrido del ADN sea muy opaco (Preparación de Geles de Agarosa para Electroforesis, 2008). La función del TBE sobre la electroforesis es hacer el papel de tampón durante la separación del ADN, permitiendo separar ácidos nucleicos por su peso y su gran afinidad con los compuestos (Checa, 2018); de tal forma que, si no se hiciera uso de los buffers de carga durante la electroforesis, la visualización del recorrido realizado por el ADN en el gel sería muy complicado, debido a que la apreciación de dicho desplazamiento se basaría en suposiciones personales apelando a la baja calidad de la franja de ADN a observar. En el momento en que el gel agarosa es calentada en el buffer y se deja enfriar, se forma un gel blando. En un extremo, el gel posee unos pozos en donde se colocan las muestras de ADN que anteriormente han sido mezcladas con 3 μL de buffer de carga 5X que cumple la función de conducir corriente y controlar de manera directa el pH (Fierro, s.f). En esta práctica, el gel se agregó a una cámara donde uno de los extremos se conecta a un electrodo positivo y el otro extremo a un electrodo negativo. Al observar la cámara por primera vez se podía apreciar que se encontraba rodeada completamente con el buffer. En el momento en que el gel se encuentra en la cámara, la muestra se transfirió de manera moderada. Posteriormente, se aplica energía durante 30 minutos a la cámara y automáticamente dicha energía comienza a correr por medio del gel. Mientras ocurre este desplazamiento, lo que sucede es que ´´los grupos fosfato de su esqueleto de azúcares-fosfato otorgan una carga negativa a las moléculas de ADN, por lo que comienzan a moverse a través de la matriz de gel hacia el polo positivo´´ (Electroforesis en gel, 2019). Al momento de apreciar que las franjas de ADN se han separado, se puede analizar el gel y reconocer el tamaño de caja franja. Finalmente, cuando el gel se encuentra teñido con un pigmento que para este caso es el SYBR Green, que cumple la función de teñir ADN en geles de agarosa. Concretamente lo que lleva a cabo es que se une al ADN de doble cadena, y mientras ocurre la PCR, el ADN polimerasa amplifica la secuencia diana que crean los productos proporcionados por el PCR y así, el SYBR

Green se une a cada copia nueva de ADN, lo que da como resultado un gran aumento en la intensidad de fluorescencia (Electroforesis en gel, 2019); permitiendo observar todo el ADN que se encuentra en todos los lugares por todo el gel. Después de este proceso, lo que se analiza es el verdadero recorrido del ADN comparando cada franja con el marcador de peso molecular, determinando así su verdadero tamaño. Al registrar y analizar cada dato obtenido, se pudo concluir cómo afectaron nuestros resultados algunos errores como el haber tocado de manera profunda el gel agarosa en el proceso de la electroforesis afectando así el recorrido de nuestro ADN y el conjunto común de errores de observación y/o medición.

CONCLUSIÓN En esta práctica se puede concluir que la muestra extraída de ADN no se encontraba pura. Esto se dedujo, gracias a la relación de los resultados D.O 260nm/280nm obtenidos en su cuantificación. Su impureza fue a causa de un incorrecto secado del botón de ADN y una incompleta homogenización de esta muestra con el buffer TE. En la parte de la visualización del ADN en el gel agarosa no se pudo observar un definido desplazamiento de la separación de sus moléculas, debido a su impureza y al uso incorrecto de la micropipeta en el momento de depositar la muestra en el pozo del gel.

REFERENCIAS Academia. (s.f). Recuperado de https://www.academia.edu/10297690/Los_%C3%A1cidos_nucleicos_son_los_component es_fundamentales_de_la_c%C3%A9lula_viva._Estos Fierro, F. F. (s.f). Recuperado de https://micrositios.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/electroforesis.pdf Khan Academy. (s.f). Recuperado de https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dnatechnology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/gel-electrophoresis L Alejos, L; Aragon, M & Romero, A (s.f). Recuperado de http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf MOSQUERA, R. V. (2005, Febrero 10). Recuperado de

file:///C:/Users/Usuario/Downloads/DialnetMarcadoresMolecularesYLaExtraccionDeADN-6117966.pdf Rojas, A. C. (2018, Abril 22). Conogasi. Recuperado de http://conogasi.org/articulos/metodo-gel-de-electroforesis-agarosa/ Standard Operating Procedures. (2008, Noviembre 11). Recuperado de http://www.genomica.uaslp.mx/Protocolos/Mol_GelAgarosa.pdf Universidad Nacional de Quilmes. (n.d.). Retrieved from https://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp5.pdf