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IMPORTANCIA NUTRICIONAL DE ALIMENTO VIVO En los ecosistomas naturales acuáticos, la continuidad de las especies depende del equilibrio establecido entre los diferentes niveles de la trama trófica. Así, el desarrollo y supervivencia de larvas y juveniles depende de la presencia de organismos que conforman el fitoplancton y el zooplancton, quienes a su vez se producen en presencia de los nutrientes adecuados. Es de gran importancia el conocer la composición química de los alimentos vivos, pues el utilizar un recurso pobre en nutrientes esenciales puede causar el desarrollo anormal y muerte masiva de las especies en cultivo. Existen estudios que así lo demuestran, como es el caso del desbalance nutricional que causa el uso de la levadura Saccharomyces sereviceae en la producción masiva de larvas de especies marinas (Hirata, 1980). Se han hecho una gran cantidad de estudios para conocer la composición de las especies de alimento vivo más utilizados en Acuacultura en diferentes condiciones y con diferentes tipos de nutrientes (Tablas 3 y 4). Estos trabajos han revelado que el contenido nutricional de estas especies está en función directa de su alimento (Fogg, 1975; Watanabe et al., 1978a, 1983; Hirata et al., 1985). De acuerdo a lo anterior, es importante conocer y manejar las diferentes técnicas de cultivo del alimento vivo para establecer las condiciones más adecuadas, que permitan el obtener un alimento de alto contenido nutricional principalmente ricos en aminoácidos y ácidos grasos esenciales entre otros nutrientes, que favorezcan el desarrollo y supervivencia de las diferentes especies de crustáceos, moluscos y peces que se obtienen por Acuacultura (Tabla 5 y 6). Existen diferentes técnicas que permiten obtener este enriquecimiento que van desde la manipulación de parámetros físicos (Tabla 2), como son la temperatura y el fotoperíodo; los parámetros químicos como la concentración y tipo de macronutrientes, y hasta la adición de fuentes orgánicas (amincácidos, vitaminas, etc.) en bajas concentraciones. TABLA 3 COMPOSICION GENERAL DE ALGUNAS MICROALGAS UILIZADAS EN ACUICULTURA (Fogg, 1975) PROTEINA CARBOHIDRATO GRASA Tetraselmis 1.42 0.41 0.70 Dunaliella 1.43 0.80 0.15 Monochrysis 0.94 0.59 0.22 Chaetoceros 1.12 0.22 0.21 Skeletonema 1.38 0.79 0.17 Phaeodactylum 0.88 0.64 0.17 La composición celular reportada, corresponde a resultados de cultivo en condiciones físicoquímicas y nutricionales similares para las seis espcies (las cantidades de proteína, carbohidratos y grasas están expresadas en relación a cantidad total de Carbono).

TABLA 4 COMPOSICION PROXIMAL Y MINERAL DE CINCO ESPECTES DE ALIMENTO VIVO DE MAYOR USO EN ACUACULTURA* ESPECIE S

Acati Daphni a a sp sp

Tigriopus japonicus

Brachionus plicatilis

MEDIO LEVADUR LEVADUR LEVADUR Chlorell DE A+ A+ A a CULIVO Chlorella Chlorella

-

-

Moina sp LEVADUR A

Humedad 89.6

89.1

87.6

87.3

88.1

89.3

87.2

Proteínas 7.2

7.9

7.8

9.0

8.5

7.5

8.8

Lípidos

2.3

2.3

3.8

2.8

1.3

1.4

2.9

Ceniza

0.4

0.4

0.5

0.5

2.1

0.7

-

Ca mg/g

0.12

0.26

0.21

0.15

0.39

0.21

0.12

Mg mg/g 0.14

0.17

0.14

0.23

0.76

0.12

0.12

P mg/g

1.48

1.44

1.37

1.31

1.48

1.46

1.85

Na mg/g 0.41

0.30

0.29

0.61

6.63

0.74

1.09

K mg/g

0.35

0.12

0.23

0.84

2.21

0.72

0.92

Fe g/g

15.9

52.5

43.3

33.8

11.5

72.2

46.4

Zn g/g

7.4

9.8

8.2

12.3

39.0

12.8

10.0

Mn g/m

0.4

1.1

1.1

1.0

0.2

13.2

0.5

Cu g/g

1.1

1.5

1.7

2.4

2.8

1.1

5.8

* Watanabe et al., 1983.

TABLA 5. COMPOSICION DE AMINOACIDOS ESENCIALES EN CINCO ESPECIES DE ZOOPLANCTON DE MAYOR USO EN ACUACULTURA Artenia sp nauplios Leucina

6.1 17.3 128 6.1 15.8 117 5.5 13.8 102 5.0 13.3 99

Metionina

0.9 2.6

48* 0.8 2.1

39* 1.5 3.8

70

1.1 2.9

54* 1.0 2.7

50*

Cistina

0.4 1.1

41* 0.6 1.6

59* 0.8 2.0

74

0.7 1.9

70

0.6 1.6

59*

3.9 10.1 106 3.7 9.3

98

3.5 9.3

98

3.6 9.5

100

138 4.0 10.7 165 3.3 8.8

135

Tirosina

3.7 10.5 162 3.1 8.0

117 3.5 8.8

123 3.6 9.0

117 2.5 6.7

89

Moina spp

2.6 7.4

96

3.4 8.8

Tigriopus japonicus

Isoleucina

Fenilalanina 3.2 9.1

99

Brachionus Acartia clausi plicatilis

2.5 6.6

88

6.0 15.9 118

Treonina

1.7 4.8

45* 3.2 8.3

78

Triptofano

1.0 2.8

165 1.2 3.1

182 1.1 2.8

Valina

3.2 9.1

96

Lisina

6.1 17.3 103 6.1 15.8 94

Arginina

5.0 14.2 122 4.6 11.9 103 4.3 10.8 93

Histidina

1.3 3.7

77

*

***

**

4.2 10.5 99

3.8 10.1 95

165 1.1 2.9

4.2 10.9 115 4.5 11.3 119 3.3 8.8

1.5 3.9

81

5.4 13.5 80 1.9 4.8

3.8 10.1 95

171 1.2 3.2

188

93

89

5.7 15.2 90

3.2 8.5

5.8 15.4 92

5.2 13.9 120 5.1 13.5 116

100 1.6 4.3

90

1.6 4.2

88

* g/100 g proteína cruda (Watanabe et al., 1978a) ** Expresado como total de aminoácidos esenciales (a.a.e.) *** Registros basados en la composción con a.a.e. requeridos para peces -el 100 indica los mismos requerimientos TABLA 6. ORGANISMOS MARINOS CULTIVADOS CON MICROALGAS EN JAPON (U. UMEBAYASHI, 1975) ESPECIE SUPERVIVEN MICROAL CONCENTRACI PRODUCCI REFERENCI CULTIVA CIA GA ON ON A DA % BIVALVOS 3,000 Ostrea Chaetoceros cel/día/larva 14,000 Sato & edulis calcitrans (estadio org/200 l Takeda. 1970 temprano) Monochrysi 10,000 s lutheri cel/día/larva Andara Chaetoceros 10,000 40,000 cel/ml 59.3% Ito et al., broughtonii calcitrans org/35 l 1968 Monas sp 10,000 cel/ml Meretrix Chaetoceros 30,000 cel/ml 20% Tanaka, 1968 lamarckii calcitrans Nitzschia 50,000 cel/ml closterium Spisula Chaetoceros 30,000 a 150,000 Akimoto et sachalinensi 100,000 org 61% calcitrans cel/ml al., 1964 s Patinopecte Chaetoceros 20,000 cel/ml 88% Takeda, 1965 n yezoensis calcitrans Skeletonem 20,000 cel/ml a costatum Ostrea Chaetoceros 12,000 2,000 cel/ml 4% Imai, 1967 edulis calcitrans org/ton

Monochrysi 15,000 cel/ml s lutheri CRUSTACEOS Penaeus Skeletonem 10,000 cel/ml japonicus a costatum Penaeopsis Skeletonem monoceros a costatum Chaetoceros calcitrans

-

56%

Hudinaga, 1962

-

25%

Funada, 1966

(naupliopostlarva)

CULTIVO DE MICROALGAS Son llamadas microalgas a una gran cantidad de especies que constituyen el fitoplancton que abarca desde organismos autótrofos hasta microflagelados y microciliados auxótrofos. Su posición taxonómica ha sido de gran polémica entre botánicos y zoólogos, como ejemplo podemos mencionar el grupo de los dinoflagelados, conocidos por unos como microalgas y por otros como protozoarios. En este trabajo no pretendemos apoyar o rechazar ninguna de las líneas en relación a la sistemática taxonómica pero mencionaremos los ejemplos más representativos por su importancia en acuacultura de acuerdo con la clasificación que se muestra en la Tabla 1, seguida por Guillard, 1973, 1975; Hirata, 1974 y Watanabe et al., 1978. Estas especies aportan un alto contenido nutricional para peces, crustáceos y moluscos, además de ofrecer facilidades de manejo en sistemas de cultivo tanto en laboratorio como en producción a gran escala con fines comerciales. 1. CONSIDERACIONES GENERALES DE LOS CULTIVOS DE MICROALGAS Muchos factores contribuyen para el desarrollo óptimo de los cultivos de microalgas, algunos de éstos afectan las características del crecimiento. Los recipientes de cultivo más comúnmente usados son de materiales no tóxicos como las cajas de Petri, matraces Erlenmeyer, matraces Ferenback, carboys o garrafas, etc., adecuados para cultivos de laboratorio. Para cultivos a gran escala los recipientes de plástico, madera y concreto son los más recomendables, incluyendo los estanques rústicos en áreas rurales son los sistemas más económicos. En cultivos masivos la aereación es un factor muy importante para la homogenización de los nutrientes y para evitar la sedimentación de las microalgas. Las diatomeas suelen acumularse en lugares donde el agua no se mezcla, ésto también depende de la forma del recipiente de cultivo que cuando no es adecuado retarda el crecimiento.

Otro factor importante es la penetración de la luz en el cultivo; en los cultivos masivos la profundidad es tan grande que la intensidad de la luz insidente no es suficiente para la fotosíntesis, hasta el fondo del tanque. En los cultivos masivos a la intemperie la penetración de la luz es más efectiva, pero se debe reducir la intensidad de la luz fuerte, cubriendo estos estanques con una malla. En cultivos a gran escala es recomendable la inyección de CO2 (0.5%) para contribuir al proceso fotosintético. Para muchas especies de Diatomeas la temperatura óptima oscila entre los 15 y 20°C, pocas especies de esta familia crecen a más de 28°C, las cloroficeas pueden soportar altas temperaturas; un ejemplo es el cultivo masivo a la intemperie de Chlorella saccharophila, cuyas temperaturas oscilan entre 12.5 – 30°C (Hirata et al., 1974, 1975, 1977; Torrentera, 1983). El crecimiento y la división celular son afectados por la intensidad de la luz y el fotoperíodo (horas de iluminación y obscuridad) en relación también a la temperatura, por ejemplo en Diatomees a 20°C y 1,000 lux se obtiene un crecimiento favorable.

TABLA 7. CARACTERISTICAS DE ALGUNAS DE LAS ESPECIES DE ALGAS UNICELULARES UTILIZADAS EN ACUACULTURA (COLL-MORALES J., 1983) GENERO

CICLO

TEMPERATURA DIAMETRO OPTIMA MEDIO

Phaeodactylum (diatomea)

10 h

25°C

10.4μ

Skeletonema (diatomea)

13.1 h

18°C

>20μ

Dunaliella (cloroficea)

24 h

16°C

17.8μ

Chlorella (cloroficea)

7.7 h

25°C

5μ

Tetraselmis (cloroficea)

18 h

18°C

18.4μ

Monochrysis (crisoficea)

15.3 h

20–25°C

10μ

Isochrysis (crisoficea)

30.2 h

20°C

10.2μ

Estas especies se han utilizado en acuicultura marina dados su valor nutritivo y digestibilidad, además de su capacidad para crecer en cultivos masivos. La duración del ciclo celular como los requerimientos de temperatura son suceptibles de variación mediante selección de variedades. TABLA 8. REQUERIMIENTOS PRINCIPALES DE LOS

Físicos

CULTIVOS DE MICROALGAS COMPUESTOS REQUERIMIENTOS VALORES QUIMICOS 2,000 – Luz 4,000 lux Temperatura 15 – 22°C 0.37‰ Salinidad

pH Redox Nutritivos C

7–9 CO2CO3≃

g/100 ml

O, H N P

O2H2O N2NH4+ NO3 PO4≃

g/100 ml g/100 ml g/100 ml

S

SO4≃

g/100 ml

Na, K, Ca, Mg Sales Fe, Zn, Mn, B, Br, Si Sales Cu, Co, Cl, I, Sr, Rb, Sales Al, et B12, tiamina, Vitaminas biotina

g/100 ml mg/100 ml μg/100 ml μg/100 ml

En esta tabla se exponen los requerimientos principales de los cultivos de microalgas y sus valores aproximados. En cada caso habrá que estudiar los reqùerimientos particulares de la especie y de la variedad que se vaya a cultivar en las condiciones concretas de cultivo que se van a utilizar, por lo que estos datos son sólo orientación (Kinne, 1979). El fotoperíodo es un factor que regula la división celular, en diatomeas la reproducción asexual (división) ocurre durante el período de luz y éste es acelerado bajo iluminación continua. En contraste las especies formadoras de auxosporas (ésporas sexuales), dan lugar a células del mismo tamaño y ésto ocurre en el período de obscuridad. Por lo tanto, el período de iluminación puede ajustarse de acuerdo a los objetivos del cultivo: el fotoperíodo continuo (horas de iluminación prolongada) produce crecimientos rápidos, un fotoperíodo con horas de luz y obscuridad semejante al fotoperíodo solar mantiene un crecimiente normal y saludable. En la Table 7 se muestran las características de algunas de las especies de microalgas unicelulares utilizadas en acuacultura para la nutrición de moluscos y crustáceos. Además del control de los parámetros antes mencionados es necesario considerar que para el establecimiento de un sistema de producción de alimento vivo es importante el dominio de las técnicas de aislamiento, purificación y mantenimiento de cepas, así como el conocimiento de la fisiología, ciclo de vida, bioquímica, etc. de las especies para determinar su factibilidad de cultivo y sobre todo su contenido nutricional para

poder llevarse a niveles masivos de producción para fines acuaculturales. La Tabla 8 muestra algunos de los principales requerimientos de los cultivos de microalgas. 2. MEDIOS DE CULTIVO Se han desarrollado diferentes medios para el cultivo de microalgas que van desde las fórmulas para enriquecer el agua de mar natural, hasta el uso de medios artificiales que permitan resultados constantes en contraste con los resultados tan variables que brinda el uso del agua de mar natural que entre otros factores depende del lugar donde se colecta ésta, y el tiempo de almacenamiento de la misma. Los medios artificiales se usan principalmente para fines experimentales, ya que como se ha mencionado, brinda resultados constantes, aunque existen algunas especies que no crecen en medios artificiales por factores desconocidos que afectan su crecimiento, las principales fórmulas utilizadas van desde el agua de Miguel, que data de 1910, desarrollada por Allen-Nelson; el medio de End-Schereiber de 1934, hasta fórmulas específicas para familias como la fórmula del Laboratorio Haskins de Nueva York para diatomeas, Provasoli et al., 1975; Matthiesen & Thorner, 1966; McIachlan, 1973; Guillard F., 1973; Droop, 1975, 1979; Schoene, 1982, etc. Las principales formulaciones de los medios de cultivo, tanto de mantenimiento de cepas como de producción masiva (minerales, enriquecidos y orgánicos), se describen desde la Tabla 9 hasta la Tabla 16. El fitoplancton se desarrolla y multiplica en relación de las condiciones fisicoquímicas del medio. En términos generales son los macronutrientes o factores limitantes del crecimiento el carbono, Nitrógeno, Fósforo, Silicio, Magnesio, Potasio y Calcio, que se requieren en cantidades relativamente grandes, mientras que los llamados micronutrientes (Fierro, Manganeso, Cobre, Zinc, Sodio, Molibdeno, Cloro y Cobalto) se necesitan en menores cantidades. Existen otros medios que incluyen en su composición sustancias orgánicas (vitaminas, aminoácidos) necesarios para aquellas especies de microalgas Auxótrofas, es decir que no sintetizan por medio de la fotosíntesis este tipo de compuestos y resultan factores que pueden limitar su crecimiento; tal es el caso de Platimonas, Chrysophytas y algunas Bacillariophyceas.

TABLA 9. MEDIO CHU 10 (MODIFICADO POR GERLOFF) (0. UMEBAYASHI, 1975) (Recomendado para aislamiento de microalgas de hábitats oligotróficos y eutróficos) Ca(NO3)2

0.04%

K2HPO4

0.01%

Na2CO3

0.02%

MgSO4.7H2O

0.025%

Na2SiO3

0.025%

Citrato de Fierro Amoniacal

0.005%

NOTA: Puede usarse para medio solidificado Agar-Agar

1.0%

TABLA 10. MEDIO ENRIQUECIDO MEDIO MIGUEL (ALLEN-NELSON, 1910) Solución KNO3 20. 2 g A: H2O 100 ml Solución Na2HPO412H2O 4g B: CaCl26H2O 4g HCl conc. 2 ml FeCl3 2 ml H2O 80 ml Agregar 2 ml de la Solución A y 1 ml de la Solución B a un litro de agua de mar natural, y calentar a 70°C por 20 minutos. MEDIO ERD-SAHREIBER ENRIQUECIDO (FOYN, 1934a,b) NaNO3 10 mg Na2HPO412H2O 2 mg Extracto de suelo 5 ml Agua de mar 100 ml MEDIO ERD-SCHREIBER *Agua de mar 1 litro Extracto de suelo 50 ml NaNO3 0.2 g Na2HPO4.12H2O 0.03 g * Se recomienda usar el agua filtrada y pasteurizada,y adicionar los ingredientes. TABLA 11. MEDIO DE YASHIMA (SISFFAA, 1964a) (Para cultivo masivo de cloroficeas marinas) Sulfato de Amonio (para la agricultura 21%) 100 g/t Superfosfato de Calcio (para la agricultura 15 g/t 21%) Urea (para la agricultura 21%) 15 g/t 30–50 Clewat 32 g/t Componentes de Clewat 32: 0.385 FeCl2 (como fuente de Fe) % 0.166 ZnCl2 (como fuente de Zn) % MnCl2 (como fuente de Mn) 0.775 %

0.017 % 0.007 CuSO4 (como fuente de Cu) % 0.632 (NH4)6Mo7O24 (como fuente de Mo) % 2.470 H3 BO3 (como fuente de B) % 0.005 EDTA % MEDIO DE YASHIMA MODIFICADO (HIRATA, 1975) Medio de Yashima (en la misma concentración) Peptona 50 g/t 0.005 Peptidasa % 0.005 Diaminasa % (recomendado para cultivos axénicos) CoCl2 (como fuente de Co)

TABLA 12. YANASE & IMAI (1968) PARA Monochrysis lutheri, Platymonas sp., Nitzschia closterium, Chaetoceros calcitrans NaCl

18 mg

Metal Mix*

30 ml

KC1

600 mg

Fe (as Cl-)

100 μg

NaNO3

500 mg

Tris

1g

MgSO4 . 7H2O

5g

Vit.B12

3μg

Ca (as Cl-)

100 mg

Na2 SiO3

80 mg

K2HPO4

30 mg

Vitamin Mix†

1 ml

H2O

1l

* Mezcla de metales 100 ml, contanido: Na2 EDTA, 100 mg; Fe, 1 mg; Zn, 0.5 mg; Mn, 4 mg;Co, 0.01 mg; Cu, 0.004 mg; B, 20 mg. † Mezcla de vitaminas 50 ml, contenido: B12, 10 μg; biotina, 50 μg; B1, 5 mg TABLA 13. MEDIO DE GUILLARD & RHYTER (PARSONS & STRICKLAND, 1961) A. SOLUCIONES NUTRIENTES 1. Disolver 0.08 gr de clorhidrato de Cobalto CoCl2.6H2O y 0.8 gr de Sulfato de Cobre CuSO4.5H2O; en 100 ml de H2O destilada. 2. Añadir 1 ml de solución A.1. a aproximadamente 800 ml de H2O destilada, que previamente se le ha adicionado:

3. 4. 5. 6. 7. 8.

0.2 gr de Tricloruro Férrico FeCl3.6H2O 0.06 gr de Sulfato de Zinc ZnSo4.7H2O 0.12 gr de Sulfato de Manganeso MnSO4.H2O 0.03 gr de Molibdato de Sodio Na2MoO4.2H2O Añadir 1.2 gr de Etilenodiaminotetracetato Disódico (EDTA) diluído a cerca de 900 ml de H2O destilada. Ajustar el pH de la solución con Hidróxido de Sodio IN-Na(OH), hasta 7.5. Evitar la formación de precipitado, el cual puede elevar la adición de mucho alcali. Añadir 10 gr de Nitrato Potásico KNO3 y 1.4 gr de Fosfato Dihidratado de Potasio KH2PO4. Diluir la solución a 1 litro y en autoclave a menos de 15 libras de presión por 15 minutos. Guardar la solución en botellas de vidrio en la obscuridad. B. SILICATO DE SODIO

1. Disolver 10.5 gr de Metasilicato Pentahidratado de Sodio Na2SiO3.5H2O ó 14 gr de Na2SiO3.9H2O en 1 litro de agua destilada. 2. Esterilizar la solución por filtración a través de un filtro de vidrio. 3. Guardarla en un envase de polipropileno esterilizado. C. ACIDO HIDROCLORHIDRICO 1. Preparar una solución 0.1N-HCL. 2. Determinar por titulación la cantidad de esta solución necesaria para neutralizar 10 ml de la solución B.2-Si × ml de 0.IN-HCL han sido utilizadas para neutralizar 10 ml de solución B.2, multiplicar por 100 y esta cantidad llevarla a 1 litro de H2O destilada. 3. Esterilizar la solución ácida por filtración a través de un filtro de vidrio. 4. Guardarlo en una botella de polipropileno esterilizado. D. SOLUCION DE VITAMINA 1. Disolver 10 mg de Tiamina hidroclórica y 10 mg de Biotina en 100 ml de H2O destilada. 2. Diluir 10 ml de solución D.1 en 100 ml de H2O destilada. 3. Esterilizar solución D.2 pasándola a través de un filtro de vidrio. 4. Guardarla en porciones de 10 ml en tubos estériles de tapa enroscada a menos de 20°C. TABLA 14. MEDIO DE GUILLAR “F/2” (J. STEIN, 1979) Nutrientes Mayores NaNo3 7.5 NaH2PO4.H2O 0.5 NH4Cl 2.65

Solución Primaria % w/v % w/v % w/v

% w/v (calentar para disolver)

Na2SIO3.9N2O 3

Usar un mililitro de estas soluciones por litro de agua de mar, para preparar el medio “F/2”. Sugerencia: Preparar el NaNO3 junto con NaH2PO . H2O en 100 mililitros. Metales Traza CuSO4.5H2O ZnSO4.7H2O ZnCl2 CoCl2.6H2O MnCl2.4H2O Na2MnO4.2H2O

Solución Primaria 0.98 % w/v 2.2 % w/v 1.05 % w/v 1.0 % w/v 18 % w/v 0.63 % w/v

Es conveniente hacer las soluciones primarias en forma individual. y con una concentración menor de 106 más concentrada que en el medio “F/2”. Solución Primaria de Metales Traza A. Con “Secuestrante Férrico” (Cloruro Férrico): Disolver 5 gr del Secuestrante Férrico en 900 ml de agua destilada y añadir 1 ml de cada una de las soluciones primarias de metales traza preparados anteriormente; aforar a un litro y asegurar que el pH quede cerca de 4.5. Use 1 ml de esta solución por cada litro de agua de mar para hacer el medio de cultivo. Agua de mar filtrada (5μ, 10μ, etc.) y de ser posible irradiada con UV. B. Con EDTA y Cloruro Férrico (FeCl.6H2O) Disuelva 3.15 g de FeCl.6H2O ó 4.36 de EDTA (Na2) en 900 ml de agua destilada, agregue 1 ml de cada una de las soluciones stock primarias de metales traza y afore a 1 litro, asegure un pH de 2.0. Use 1 ml de esta solución por litro de agua de mar para preparar el medio “f/2”. Solución Primaria de Vitaminas •

•

Solución Primaria de Biotina: Se prepara a partir de cristales de Bl, disolver 10 mg de biotina en 96 ml de agua destilada. Haga esta solución ligeramente ácida para ser autoclavada y manténgase en un congelador. Solución de Bitamina B12: A partir de Cyanocobalamina U.S. de 1000 mg/ ml solución inyectable. Tomar 1 ml y aforarlo en 100 ml de agua destilada. La solución se acidifica para ser autoclavada y se congela.

Solución Primaria de Vitaminas

•

Tomar 1 m de la solución primaria de Biotina y 0.1 ml de la solución stock primaria de B12, aforar a 100 ml con agua destilada y añadir 20 mg de Tiamina HCl. Se pueden preparar ampolletas de 2, 5 ó 10 ml y almacenarlas estériles (acidificas) en el congelador. Use ½ ml de esta solución por cada litro de agua de mar para preparar el medio “f/2”.

Preparación del Buffer “Tris” Tome 50 g de “Tris” y disuélvase en 200 ml de agua destilada y ajuste el pH a 7.2 en HCL. Use de 1 a 5 ml por litro de medio antes de la autoclave, ajustando el pH a 7.4 (recomendado usar 1 ml por litro cuando el pH del medio es 7.9–8.2). TABLA 15. MEDIO DE CULTIVO (AGUA DULCE) (Guillard, In: Stein, 1979) Guillard (comunicación personal a J. Steinn, 1973. Handbook of phycological methods, Culture Methods and Growth Measurements. Cambridge at the University Press: 448 pp. a. Macronutrientes: CaCl2.2H2O 36.76 g/l MgSO4.7H2O 36.97 g/l NaHCO3 12.60 g/l K2HPO4 8.71 g/l NaNO3 85.01 g/l Na2SiO3.9H2O 28.42 g/l De esta solución rotulada como a se obtiene 1 ml y se le adiciona a 1 litro de agua esterilizada. b. Micronutrientes: Na2EDTA 4.36 g/l FeCl3.6H2O 3.15 g/l CuSO4.5H2O 0.01 g/l ZnSO4.7H2O 0.022 g/l CoCl2.6H2O 0.01 g/l MnCl24H2O 0.18 g/l Na2MoO4.2H2O 0.006 g/l De esta solución rotulada como b, se obtiene 1 ml y se le adiciona a 1 litro de agua esterilizada.

c. Vitaminas: Thiamine. HCl 0.1 mg/l Biotin 0.5 g/l Cyanocobalamina 0.5 g/l De esta solución rotulada como c, se obtiene 1 ml y se le adiciona a 1 litro de agua esterilizada. d. Tris: Tris 50.g/200 (Hydroxymethyl)ml H2O Aminomethano dest. (Cuando el cultivo se encuentra axénico el tris puede reemplazarse por Glycylaglycine). De esta solución rotulada como d, obtener 2 ml y adicionar al litro de agua esterilizada que se está preparando el cultivo. Una vez preparado el medio de cultivo, se debe hacer ajuste de pH a 7.2 con HCl cuidadósamente para no obtener el pH ácido. TABLA 16. MEDIO MET 44 (SCHONE & SCHONE, 1982) (Para microalgas marinas de la Familia Bacilarioficea) NaNO3 3.4 mg Na2HPO4.12H2O 0.925 mg Na2SiO3.9H2O 10.14 mg Na2EDTA.2H2O 0.803 mg FeSO4.7H2O 60.0 μg MnCl2.4H2O 14.4 μg Vitamina B12 0.5 μg Biotina 0.5 μg Tiamina-HCl 0.5 μg Para enriquecer un litro de agua de mar NOTA: La solución stock de Fierro y Silicato debe de acidificarse un poco con una gota de Acido Sulfúrico concentrado, y la solución de EDTA debe acidificarse con Acido Clorhídrico. El EDTA puede ser adicionado antes que el Fierro. Para la producción de microalgas a nivel comercial se usa el agua de mar enriquecida con fertilizantes agrícolas (Urea, Fosfato triple, Nitrato de Amonio, etc.) (Chu, 1942, y

Tamiya, 1957; SISFFAA, 1964a) y tradicionalmente la fertilización de estanques con abonos orgánicos, en cultivos de especies herbívoras como las carpas. 3. TECNICAS DE AISLAMIENTO Y PURIFICACION Muchos métodos se han desarrollado para obtener cultivos monoespecíficos (de una sola especie) y axénicos (libres de contaminantes). A continuación se brinda una breve descripción de algunos de los principales métodos que se utilizan para aislar y purificar microalgas (O. Umebayashi, 1975) (Fig. 1). 1) Aislamiento •

•

Pipeteo capilar: Se utiliza para separar microalgas mayores de 10μ, mediante una pipeta construída con un tubo capilar, a través del microscopio óptico se “pesca” las células y se separan en pequeñas gotas de nutrientes colocados alrededor de una Caja de Petri o en portaobjetos escabados. Rayado de Placas de Agar: Se transfieren pequeñas gotas de plancton con una asa de siembra, extendiendo por estrías (rompiendo un poco el agar). Este agar se prepara con una solución nutritiva para microalgas y con una relación de 1– 1.5% w/v de agar disuelto en el medio nutritivo, se incuba la placa bajo iluminación a 18–20°. De este primer crecimiento se transfiere a tubos con agar inclinado sembrando por estrías o bien, se transfiere a medios líquidos en subcultivos sucesivos para su purificación, de tal manera que en cada dilución se reduzca el número de organismos en una gota, es recomendable combinar la técnica de diluciones con la de transferencia en placa de agar o tubo inclinado para obtenr cultivos clonales (de una sola colonia o célula) y poder establecer el cultivo monoespecífico. Después de 10 días, pequeñas colonias aparecen sobre la superficie del agar, que se pueden transferir mediante el Método de Hocking o de la micropipeta a medios líquidos.

2) Purificación Como ya se mencionó al describir las ténicas de aislamiento, estas mismas nos permiten purificar el çultivo a través de las resiembras clonales sucesivas, pero además es recomendable entre otros métodos el uso de antibióticos para eliminar otros microorganismos, generalmente de tipo bacteriano que estén contaminando el cultivo de microalgas de nuestro interés. En el inciso 5 de este mismo capítulo correspondiente a Métodos de Esterilización se amplian las alternativas. 3) Control Bacteriológico Para determinar el desarrollo bacteriológico realizamos lo siguiente: 1. Preparación del Medio de Zobell: Trypticase Extracto de levadura Fosfato Férrico Agar Agua envejecida (3 meses)

1.0 gr 1.0 gr 5 mg 15.0 gr 1 litro

pH = 7.0 – 7.2

Fig. 1a) Método de filtración a través de una columna empacada con algodón.

Fig. 1b) Aislamiento y purificación de micr subcultivos repetidos.

Fig. 1c) Método de aislamiento y purificación de microalgas en placa de agar.

Fig. 1d) Aislamiento mediante micropipeta

Una vez preparado colocar en Cajas de Petri, una capa no muy gruesa. Someter a esterilización a 15 lbrs. de presión y 125°C. Con una asa de Platino picar el agar con la muestra que se desea analizar y colocar a la luz y observando si hay crecimiento bacteriano. 2. Si el cultivo presentara bacterias es aconsejable someter a la acción combinada de diferentes tipos de penicilina, por ejemplo: Penicilina sódica Estreptomicina Agua destilada

400 mg 200 mg 10 c.c.

Filtrar en equipo estéril, adicionar volúmenes de 3.0, 2.0, 1.0, 0.5 y 0.25 que dan concentraciones de: Ejemplo: TUBO

1

2

3

4

5

ml

3.0

2.0

1.0

0.5

0.25

Penicilina ug/ml

12.000 8.000 4.000 2.000 500

Estreptomicina ug/ml

8.000

4.000 2.000 1.000 250

4. DETERMINACION DE LA DENSIDAD DE POBLACION DE LAS MICROALGAS Cuando el plancton es utilizado para alimentar larvas u organismos filtroalimentadores como los moluscos, el suministro constante y la concentración de estos alimentos son factores que determinan la supervivencia y desarrollo de los organismos en cultivo. A continuación se hace una descripción breve de los métodos que se utilizan para determinar el número de células presentes en una muestra de plancton. 1) Hematocitómetro o Cámara de Neubaver (Fig. 2) Mediante una pipeta Pasteur se toma una muestra de plancton y se desliza en la cámara que previamente tiene adherido el cubreobjetos, se deja pasar 5~10 minutos para que la muestra se estabilice; se procede a contar mediante un contador de mano, en algunos casos es necesario diluir la muestra cuando la densidad es alta y también fijada cuando el plancton es móvil, siguiendo los siguientes pasos: 1. Se toma un milímetro de la muestra. 2. Se añade un mililitro de agua de mar filtrada ya preparada con formaldehido todo al 4%. 3. Se deja reposar por tres minutos. 4. La muestra se homogeniza con una Pipeta Pasteur. 5. Se cuentan las células de cada una de las cámaras. Una vez que se tiene el promedio de células de las cámaras, el cálculo total de células por mililitro se lleva a cabo de la siguiente manera:

Fig. 2a) Conteo celular en homatocímetro.

Fig. 2b) Cuadrantes de la cámara de conteo. a. Primero calcule el factor de dilución

m = Muestra problema (ml) f = Agua de mar con formaldehido b. Se requiere también la profundidad del hematocímetro, la cual está incluida en el mismo en la parte inferior derecha. P.H. = Profundidad del Hematocímetro c. Todo el cálculo se multiplica por 1,000 para convertir a mililitros. d. Se requiere el número promedio de células de la muestra problema. N.P. = Número promedio de células por ml Con todos los incisos anteriores se realiza el cálculo de número de células de la muestra problema por ml y la fórmula queda así: No. de Células = (F.D.) (P.H.) (1,000) (N.P.) 2) Densidad Optica Mediante un espectrofotómetro se determina la concentración celular de la muestra por densidad óptica (calibrando con anterioridad el aparato, siguiendo las instrucciones del manual correspondiente), se determina la transmitancia (Nm), que se extrapola con la recta patrón antes determinada que corresponda a la especie problema (se construye graficando transmitancia vs. num. de células/ml). Así en la intersección de la recta conociendo la concentración (Nm) se puede calcular la cantidad de microalgas de la muestra problema. Por otro lado, conociendo la ecuación de la recta de cada gráfica, según la especie, se determina directamente la concentración de células de la muestra sustituyendo el valor dé la transmitancia en esta ecuación. 3) Volumen Celular Por centrifugación, se obtiene “un paquete o pastilla celular” que desechando el sobrenadante, puede ser pesado y determinado en unidades de peso W/v, la cantidad de células o biomasa de la muestra problema en peso húmedo o peso seco. 4) Composición Química En algunos estudios se puede determinar la concentración de clorofila A,B y otros pigmentos presentes en la muestra. Debe considerarse que la composición química del fitoplancton varía de acuerdo al tipo de cultivo usado, medio nutritivo y otros factores por lo que es necesario realizar el estudio de la composición química (análisis proximal) de la especie de estudio en relación al tipo de cultivo desarrollado. 5. METODOS DE ESTERILIZACION

Existen diferentes métodos para lograr las mejores condiciones de desarrollo de las microalgas, libres de microorganismos contaminantes, tanto del aire como del agua. A continuación se describen brevemente los métodos más comúnes de esterilización que varían en los resultados de eficiencia, costos y tiempo invertido. 1) Esterilización Química Uno de los métodos más comúnes dentro de este tipo de esterilización, es el uso del Hipoclorito de Sodio (Cloro comercial), resulta ser de bajo costo y brinda buenos resultados para desinfectar recipientes de cultivo, material de cristalería y además podemos esterilizar el agua de mar con la que preparamos el medio de cultivo, utilizando 50 mg de Tiosulfato de Sodio por cada 1 ml de Hipoclorito de Sodio usado; es decir, se utiliza 416 ml de Cloro comercial (6%) y se afora ésta a 1,000 ml (mantenga esta solución en la oscuridad); de esta solución agregue 0.25 ml por litro de agua, deje reposar por 12 h y añada 0.1 ml de una solución de Tiosulfato (ésta se prepara con 248.1 gr de Tiosulfato, Na2S2O3.5H2O aforado a 1,000 ml), y posteriormente introduzca aereación al recipiente de cultivo (carboy o garrafon) y déjelo así por una hora. Una vez esterilizado de esta manera, agregue los nutrientes y vitaminas previamente esterilizados. Esterilización con Formol Se recomienda su uso en los casos en que exista una contaminación en las instalaciones o laboratorio por hongos y otros microorganismos. Se utiliza una concentración de 0.1% al 10% (no se utilice para material de cristalería o recipiente de cultivo). Solución de Alcohol Etílico al 70% Se recomienda para material de cristal (pipeta, cajas de Petri, tubos de ensayo, etc.). Se pueden utilizar otro tipo de alcoholes (Isopropanol, o Propanol e incluso el Fenol, pero éste último es muy tóxico). 2) Esterilización Física Esterilización por Calor Húmedo Utilizando difusores de vapor a una temperatura de 100~110°C, se recomienda para estanques y tuberías de agua y de aire, destruye microorganismos vivos e incluso destruye esporas. Se recomienda utilizarlo por tres días consecutivos. Este método recibe el nombre de Tindarización. Autoclave Se recomienda para la esterilización de medios de cultivo, vitaminas, material de cristal. Tiene la desventaja del tiempo que se invierte y el volumen que se puede esterilizar. Filtración Se utiliza para separar partículas orgánicas o microorganismos en los medios de cultivo o instalaciones del sistema de aereación. Existen diferentes tipos de los que podemos

mencionar: filtros milipore (membranas, vidrio, celulosa, etc), filtros de fibra (algodón, vidrio, materiales sintéticos), filtros de tierra de diatomeas, geles de acrilamida (esferas de diferentes tamaños en micras), empaques de algodón y carbón activado, y finalmente existen unidades comerciales de esterilización con cartuchos sintéticos (0.45μ, 3μ, 5μ, 20μ) etc. Esterilización por U.V. Los efectos de la irradiación ultravioleta son bacteriostáticos y fungiostáticos en logitudes de onda menores de 500 NM (Jerlov, 1970). Se recomienda para estos fines las longitudes de onda de 240 a 280 NM las máximas eficiencias se obtienen cerca de los 254 NM (Kinne, 1976). Los rayos ultravioleta desinfectan el agua. El dato más importante y preciso sobre un tratamiento con rayos U.V. es la dosis de U.V. (normalmente expresada en μW seg/cm2) requerida para matar a un determinado porcentaje de la población de organismos contaminantes. Un antecedente importante son las experiencias reportadas sobre la utilización de unidades de U.V. para desinfectar criaderos de peces y ostiones, cultivos de microalgas, agua de mar almecenada (Fig. 3 y Tabla 4) (Kinne, 1976; Wheaton, 1977; Aguirre, 1981; Torrentera & Franco, 1988). 3) Criterios de Eficiencia para la Selección y Utilización de los Métodos de Esterilización Mencionados a. Método Indirecto: Se analiza el estado de salud y las tasas de supervìvencia de los organismos en cultivo. b. Método Directo: Se calcula el porcentaje de reducción de microorganismos, analizando el número de éstos presentes en muestras no tratadas y el número de los mismos presentes en muestras obtenidas después de la aplicación del tratamiento de esterilización seleccionado. Esto se puede determinar mediante análisis bacteriológicos (método standard en placa de agar); cuantificando el número de colonias presentes en la caja después de haber inoculado 1 ml de cada muestra por un período de revisión de 24 h, 48 h, 96 h. Para muestras de agua marina se recomienda el Medio de Zobell que selecciona el crecimiento de bacterias marinas; para Coliformes totales se recomienda el Medio McConkey, entre otros. En las Figs. 3 y 4 se muestran resultados de diferentes métodos de esterilización. 6. EQUIPO E INSTALACIONES a. Sala o Laboratorio de Cultivo: Se recomienda para fines de mantenimiento de cepas, transferencias sucesivas de cultivos, crecimiento de cultivos en pequeños y medianos volúmenes. Generalmente para fines de investigación las siguientes características: • Laboratorio con temperatura controlada 18–20°C. • Paredes y pisos de azulejo en color blanco. • Instalaciones para el cepario y cultivo intermedios con lámparas de luz blanca fría fluorescente (20W–37W). • Instalaciones tipo invernadero (ventanas de cristal o plástico con temperatura controlada). b. Cuarto de Siembra: Puede instalarse dentro del mismo laboratorio una cabina con campana de flujo laminar o bien una simple mesa de laboratorio con

instalación de gas para dos mecheros para la inoculación en condiciones acépticas. c. Sala de Producción: Para volúmenes de 200 l o más, se requieren recipientes de materiales plásticos no tóxicos y de preferencia transparentes para el desarrollo a nivel masivo de las diferentes especies del plancton. En este tipo de instalación es recomendable el uso de la luz solar, pues el uso de la luz artificial es de muy alto costo y se require además, de equipo para mantener la temperatura a 18– 20°C. En zonas de clima templado para cultivos masivos se pueden desarrollar éstos a la intemperie, cubriendo los recipientes en caso de lluvia. En la Figura 5 se muestra un ejemplo de instalaciones para cultivo masivo, utilizando la luz solar.

FIGURA 3a Promedlo de las Bocterlas viables formadoras de Colonla (C.F.U.) por mllímetro despues de diversos tratamientos. (Barroso, 1987).
TABLA 17. RESULTADOS REPORTADOS SOBRE EL USO DE ESTERILIZACION U.V. EN ACUACULTURA (TORRENTERA & FRANCO, 1988) AUTOR DENSIDAD % DE TIPO DE OBJETO DE FLWO (AÑO) DE U.V. REDUOCION CONTAMINANTE INVESTIGACION Okinami et al., Tratamiento de ? 90 μ W/cm2 90 Bacterias 1952 agua de mar. Shelton and ? ? óptimos Bacterias Cultivos de almejas. Green, 1954 Kowobata y Tramiento de agua ? 90 μ W/cm2 90 Bacterias Harada, 1958 de mar. Cultivos de 150 960 μ Kelly, 1961 99.96 Bacterias Crasostrea 1t/min W/cm2 Viroinica. 32 Sistemas de cultivo Wood, 1961 ? 100.00 Bacterias 1t/min cerrado.

Herald, et al., 32 1962 1t/min Burrows y ? Combs, 1968 Eagleton y ? Herald, 1968 Lasker y Vlymen, 1969 The Fishery Oceanography Center al La 1000 Jolla, (USA) 1t/min Sanders y ? Fryer, 1972 Murchelano, 3 1975 1t/min Kimura, et al., 8.5 1976 1t/min Bullock y 2 Stuckey, 1977 1t/min Bonnefoy, et ? al., 1978

?

100.00

Bacterias

Sistemas de cultivo cerrado.

?

significativa

Bacterias

Cultivo de Salmón.

?

óptimos

Bacterias

Desinfección de acuarios marinos.

? 215,500 μ W/seg/cm2 ?

significativa

Bacterias

Esterilización de agua de mar.

90 %

Bacterias

Cultivo de peces.

óptimos

Bacterias

22,100 μ W 99.0 seg/cm2 13,100 μ W 99.99 seg/cm2 20,000 μ W 50.0 seg/cm2

Bacterias Bacterias

Cultivo bivalvos.

Población microbiana mezclada.

Tratamiento de aguas negras.

Brown y Russo, 1979

32 30,000 μ W significativo 1t/min seg/cm2

Bacterias

Aguirre, 1981

3.751 60.95 μ W 1t/min seg/cm2

Bacterias

99.63

Maisse, et al., ? 1981

10,000 μ W 90 % seg/cm2

Agratzek, et al., 1983

?

91,900 μ W seg/cm2

Sako, et al., 1985 Sako, et al.., 1985 Sako, et al.., 1985

31 l/min 15 l/min 25 l/min

161,600 μ W 99.9 seg/cm2 32,300 μ W seg/cm2 19,400 μ W 100 seg/cm2

Torrentera y 3.75 140,059 μ W 100 % Franco, 1988 l/min seg/cm2

Virus

?

Bacterias Hongos

?

Cultivo de C. Crasostrea gigas. Tratamiento de agua de mar.

Virus Bacterias Bacterias

Cultivos de Crasostrea virginica. Esterilización de medios de cultivos continuos de microalgas. Sistema de recirculación para peces. Sistema de recirculación para peces. Tratamiento de aguas negras. Cultivo de peces marinos. Cultivo de peces marinos. Tratamiento de agua de mar almacenada.

7. TIPOS DE CULTIVO 1. Cultivo Estático Desarrollo del cultivo hasta fase de crecimiento exponencial y la utilización del volumen total del mismo. Generalmente el uso de estos cultivos es para fines de bioensayo o bien para transferencia a volúmenes mayores (ver la Figura 6, que ilustra la secuencia del cultivo). 2. Cultivo Continuo De acuerdo a Kubitschek (1970), un cultivo continuo es un sistema de flujo en el cual las células individuales están suspendidas en un volumen constante en un estado de equilibrio dinámico, establecido por una remoción de cultivo y adición de medio nutritivo por unidad de tiempo con tendencia al infinito. Se habla de una diferencia entre un cultivo semicontinuo y un cultivo continuo. Al parecer ésto es incorrecto, ya que la diferencia estriba en el número de períodos de remoción del cultivo y adición del medio nutritivo y en los sistemas continuos este período de remoción y adición es generalmente automático en aparatos llamados turbidostatos y Quimiostatos. Cuando se requiere de grandes cantidades de células a intervalos frecuentes para alimentar especies en cultivo (peces, crustáceos, moluscos), los cultivos semicontinuos o continuos proveen un gran número con mayor consistencia en forma uniforme y constante. En estos cultivos es importante determinar la concentración óptima de los nutrientes por unidad de tiempo en relación a la tasa de dilución o cosecha del cultivo. Cuando se establece el estadio de equilibrio del sistema, la producción es máxima. En las Figuras 7 y 8 se muestran dos ejemplos de cultivo semicontinuo. 3. Cultivo Masivo Se considera cultivo masivo a aquellos que se utilizan como alimento vivo de peces crustáceos y moluscos y cuya producción es a gran escala en tanques u otros recipientes de volumen no controlado. Existen muchas alternativas para la producción de microalgas en cultivo masivo, desde la utilización de tanques de plástico, madera, concreto hasta los estanques rústicos, así como la utilización de fertilizantes minerales de tipo agrícola hasta una gran variedad de escretas de ganado como fuentes de nutrientes. En relación a la utilización de luz artificial o natural, ésta dependerá del tipo de infraestructura con que se cuente. El control de la temperatura será necesario en relación del tipo de microalga en cultivo y de la región climática en donde se establezca el mismo. En la Tabla 17 se muestran algunas alternativas de producción en cultivo masivo de microalgas.

Fig. 4a) Esquema del ivnernadero de Wachapreague (USA). Cultivo masivo con temperatura controlada en invernadero con ventilador.

Fig. 4b) Cultivo masivo a la intemperie de algas unicelulares en tanques de fibra de vidrio (la temperatura es controlada por enfriadores sumergibles. La Joya, San Diego, U.S.A).

Stock primario Obtenido de laboratorio (Cepario) (Agitar los recipientes 2 ó 3 veces al día)

Inoculación ascéptica de plancton on agua esterilizada filtrada y enriquecida. El plancton permanece en contendores de stock. Crecimiento de 4 días sin aire.

Contenedor Cultivo intermedio Garrafón de 20 its.

Inoculación ascéptica de un stock de cultivo de agua marina esterilizada en outoclave, filtrada y enriquecida. Crecimiento de 4 días. Flujo bajo de aire.

Contenedor de 200 its. Cosecha o transferencia

Inoculación del garrafón de cultivo en agua marina filtrada, enriquecida e irradiada. Crecimiento de 2 días. Flujo bajo de aire.

Fig. 5) Secuencia de cultivo en sistema estático. Cuando se ha alcanzado una densidad óptima de células, se utiliza todo el cultivo como inóculo de la siguiente fase.

Fig. 6) Cultivo semicontinuo (R. Ukeles, en Stein, 1979). Esquematización diagramética de un cultivo semicontinuo (1), cilindro de CO2, (2) botella colectora de cultivo, (3) cámara de llenado ascéptico, (4) flujómetro de gas, (5) filtro de aire, (6) regulador de presión, (7) compresor de aire, (8) salida de gas, (9) campana de llenado ascéptico sobre el inoculador, (10) sifón de cosecha, (11) válvula de aguja para regular la presión del gas, (12) entrada de gas con filtros de algodón y difusores de aire, (13) regulador de voltaje, (14) unidad de crecimiento, (15) matraz Fernbach con inóculo.

FIG. 7) Cultivo semicontinuo (Cáceres, 1979; Aguirre, 1981). Sistama de cultivo semicontinuo de Tetraselmis suecica usando medio de cultivo esterilizado con autoclave. A) Reserva de medio de cultivo (20 1); B) Sifón para el medio de cultivo; C) Escape de aire; D) Recipiente de cultivo (bolsa de plástico); E) Dosificador de aire; F) Filtro de aire; G) Sifón de cosecha; H) Recipiente de cosecha. 8. MODELOS DE PRODUCCION Alrededor de 1960 se inició la modelación de los cultivos continuos con bacterias (Fencl, 1966), basados en la teoría básica desarrollada por Monod (1950). En relación a estas teorías matemáticas se han desarrollado numerosos trabajos con microalgas bajo el sistema de cultivo continuo, con diferentes fines de estudios: bioquímicos, fisiológicos, nutricionales, etc., como es el explorar los mecanismos de limitación de nutrientes (Droop, 1966; Caperon, 1968). Ahora se llevan a cabo numerosos trabajos con microalgas en sistemas de cultivo continuo con el objeto de determinar la mayor producción posible (Droop, 1975; Ukeles, 1973; Canzonier & Brunetti, 1975; Cáceres, 1979; Aguirre, 1981; Pares & Leyva, 1982; Torrentera, 1983). Estos trabajos también han contribuido en la implementación de sistemas de cultivo, algunos muy complejos usados para estudiar la

fisiología y bioquímica de las microalgas en condiciones axénicas, otros menos sofisticados para producir las microalgas y así utilizarlas como alimento de invertebrados marinos y larvas de peces. Algunos de estos modelos se construyen con los datos de densidad (No. de cél/ml) u otros tipos de medición, como la densidad óptica (Nm), en relación a las tasas de dilución (volumen/día). En el caso del Modelo de Monod (1950), la relación entre la densidad y la dilución describe una curva exponencial negativa, mientras que el Modelo de Droop (1966) asume esta relación como lineal. En ambos casos la producción se describe como una parábola simétrica (Droop, 1966) o asimétrica (Monod, 1950). En las Figuras 9, 10 y ll se muestran tres ejemplos de modelos de producción de tipo parabólico en donde el punto de inflexión de la curva describe la producción máxima sostenible en la tasa de dilución óptima para tres diferentes especies de microalgas en sistemas de cultivo semicontinuo. TABLA 18. ALTERNATIVAS DE PRODUCCION A GRAN ESCALA DE MICROALGAS PARA ALIMENTACION EN ACUICULTURA ALTERNATIVAS VENTAJAS INCONVENIENTES (granjas que las utilizan) Producción controlada en Control de las especies de escala pequeña (Conwy) 1010 algas A pequeña escala no es Luz artificial células*/día caro Producción controlada en Control de las especies de Luz artificial escala media (Horn-Point & algas Generalmente caro Ribadeo) 1011–12 células/día Producción controlada y Control de las especies de masiva (Lewes) en algas Aprovechamiento de la Generalmente caro 13 invernadero 10 células/día luz solar Generalmente barato, poca Florecimiento natural en mano de obra, producción invernadero (Wachapreague) Control limitado masiva, aprovechamiento de la 13 10 células/día luz solar Generalmente barato, Florecimiento natural en aprovechamiento de nutrientes, Control limitado sobre las piscina con aguas de desecho aprovechamiento de la luz especies de algas (Woods Hole) 1014 células/día solar Conwy (Inglaterra): 5×106 Ostrea de 0.3 cm/año Wachapreague (Virginia, USA): 200×106 almejas de 0.5 cm/año Ribadeo (Lugo, España): 3×106 Ostrea de 1 cm/año Horn-Point (Maryland, USA): 15×106 Crassostrea de 1 cm/año Lewes (Delaware USA): 5×103 Crassostrea de 6 cm/año Woods-Hole (Massachusetts, USA): 2×103 Crassostrea de 6 cm/año * Células (Tetraselmis equivalentes)

FIG. 8a) Relación entre la densidad y la dilución para un cultivo semicontinuo de Tetraselmis suecica, donde se muestran las medias de los valores obtenidos con los límites de confianza al 95% de una distribución normal. La relación se obtiene de acuerdo al Modelo de Monod (1950). Aguirre, 1981.

FIG. 8b) Relación entre la producción y la dilución en el cultivo semicontinuo de Tetraselmis suecica. La dilución óptima se encuentra en el punto de inflexión de la curva.

FIG. 9a) Relación entre la densidad y la dilución para un cultivo semicontinuo de Isochrysis galbana, donde se muestran las medias de los valores obtenidos con los límites de confianza al 95% de una distribución normal. La relación se obtiene de acuerdo al Modelo de Monod (1950) (Pares & Leyva, 1987).

FIG. 9b) Relación entre la producción y la dilución en el cultivo semicontinuo de Isochrysis galbena. La dilución óptima se encuentra en el punto de inflexión de la curva (Pares & Leyva, 1982).

FIG. 10a) Modelo de Droop (1966) que asume la distribución de los datos en forma lineal de la densidad (X) de Chlorella saccharophila en función de la tasa de dilución (D) (Torrentera, 1983).

FIG. 10b) Modelo de producción de Droop, para Chlorella saccharophila basado en los datos de la regresión lineal (Torrentera, 1983).

CULTIVO DE ROTIFFROS En el phylum rotífera se encuentran especies muy importantes objeto de estudio de Zoólogos y Ecólogos, pues son organismos muy activos considerados depredadores en el mundo del plancton pues consumen altas concentraciones de microorganismos, tienen una alta tasa de reproducción y su afloramiento abate rápidamente la concentración de oxígeno en el medio. Es por ello que su localización en los ambientes acuáticos permiten indicar la presencia de materia orgánica (medios eutróficos) por lo que revisten gran interés en estudios de Ecología y contaminación. En la década de los 60's empezaron a considerarse seriamente como una alternativa de alimentación en Acuacultura por sus características de desarrollo, facilidad de cultivo y aporte nutricional. Una de las especies seleccionadas para su uso en AcuaĎultura es Brachionus plicatilis del que presentamos sus alternativas de producción en cultivo en los siguientes incisos. 1. CONSIDERACIONES CENERALES SOBRE LOS CULTIVOS DE ROTTFEROS Brachionus plicatlis es miembro de la Familia Brachionidae. El ciclo de vida de este organismo involucra una alternancia en la reproducción sexual y asexual; la taxonomía de este organismo es descrita por Ruttner & Kolisko (1974). Este organismo ha sido tema de polémica sobre su sistemática, ya que los datos aportados en cuanto a talla y forma concluyen que esta especie en relación al hábitat es variable, ya que soporta amplios rangos paramétricos y está ampliamente distribuida, y esta distribución se debe a la alta longevidad y resistencia de huevos latentes. Los rangos de salinidad que soporta van desde 1 a 97 ppm (Ruthner & Kolisko, 1974) con el límite extremo de 200 ppm. Este mismo autor concluye que el agua de mar es el medio óptimo de este organismo. Es también importante mencionar que en dilución rápida del agua de mar se obtiene un incremento en el número de hembras y producción de huevos. El número de huevos producidos por hembra, es un indicador de las condiciones óptimas del medio. Su amplia distribución indica que es una especie Euriterma (5~20°C). La Figura 12 describe la anatomía de B. plicatilis (R. Huches, en: B. Pejler et al., 1983). B. plicatilis es una especie que no selecciona su alimento (polífago), es un filtroalimentador, se puede alimentar de microalgas: Cianoficeas, Chloroficeas, Pheoficeas, etc., bacterias y levaduras (Hirayama, 1973 y otros). Pejler (1983) señala que no se inlcuye en su dieta las Familias Cryptomonas y Chrysophytas. Otros trabajos demuestran que sólo pueden ingerir partículas de 12–15μ en tamaño (Hirayama, 1978). Existen diferentes trabajos que reportan tasas de ingestión de: 0.14μ 1/min de Chlamidomonas, 0.034 1/min de Olisthodiscus, 0.1 1/min de Chlorella, 0.025μ 1/min de Dunaliella (Hirayama et al., 1972, y otros. 2. CULTIVO MASIVO Y CALIDAD NUTRICIONAL La producción masiva del rotífero Brachionus plicatilis se inició en Japón alrededor de los años 60's. Estos se cultivaron inicialmente transfiriéndolos de un estanque a otro de Chlorella con una densidad de 10 a 20 × 106 c/ml (SISFFA, 1964a, b). Por lo impráctico de la técnica se iniciaron una serie de investigaciones tratando de encontrar el método

adecuado para la producción continua de rotíferos, sin depender de los cultivos masivos de Chlorella y otras microalgas; una de éstas propuso el uso de la levadura de pan (Saccharomyces cerevisiae) como alimento (Hirata & Mori, 1963). Se pensó que ésta resolvería la producción de rotíferos, pues esta técnica permite obtener densidades muy altas de más de 100 rotíferos/ml, después de la publicación de estos resultados, otros investigadores se interesaron en estudiar la composición química de los rotíferos alimentados con diferentes microalgas y levaduras (Fukusho et al., 1976; Hirata et al., 1980; Imada, 1980; Watanabe, 1978; Kitajima et al., 1980).

FIG. 11) Anatomía de Brachionus plicatilis (Rotífera) en: B. Pejler et al., 1983). En la Figura 13 se muestran los resultados obtenidos por Hirata et al., en relación a la utilización de: a) Chlorella, b) Levadura y c) Levadura/Chlorella. Como se puede observar los resultados obtenidos con las dietas a y c, son densidades altas hasta de 100 R/ml. Por otro lado, se realizaron investigaciones en cuanto al aporte nutricional de los rotíferos para el cultivo de larvas de peces y se observó que en las larvas de peces alimentados con rotíferos producidos a partir de ladieta de levadura o la mezcla 95% levadura y 5% Chlorella ocurrían altas mortalidades. Se identificó la causa como un desvalance nutricional en cuanto a los ácidos grasos esenciales (Fukusho et al., 1976; Kitajima et al., 1980ab; Watanabe, 1978). Otras investigaciones aportaron la utilización de una levadura mejorada con ácidos grasos del tipo W3 altamente insaturados, la cual recibe el nombre de “Levadura Omega” (Imada, 1980; Watanabe, 1978; Kitajima et al.,

1980a,b, etc.). En la Tabla 18 se muestra la composición de aminoácidos en B. plicatilis con diferentes dietas. Los estudios comparativos de la concentración de ácidos grasos W3 que Chlorella (especies marinas) posee, es de 29%, la levadura de pan 1.3% y la Levadura Omega 34.7%. Esta última se produce comercialmente en Japón (Kitajima, 1980). Otros trabajos más prácticos y baratos aportaron datos en relación a la determinación del contenido nutricional de diferentes especies del zooplancton: Acartia clausi, Tigriopus japonicus, Artemia sp y Moina sp. Se encontró que la abundancia y calidad de estas especies de zooplancton dependen de su nutrición, y que la elección de una especie de microalgas, levadura u otro microroganismo para alimentar a éstos depende de la composición química, temperatura, fotoperíodo y tipo de cultivo al que esté sometida esta especie de microorganismo. Por ejemplo, las especies de zooplancton alimentados con Chlorella obtienen un enriquecimiento en ácidos grasos de un 12.7 a un 18.8% (Imada et al., 1979; Imada, 1980; Watanabe, 1978b, 1980). Para fines prácticos, la producción masiva de microalgas y la utilización de levadura de pan aportan buenos resultados en la producción masiva de larvas de peces y otros invertebrados, tomando en cuenta que esta utilización permita un enriquecimiento de los cultivos de zooplancton llamado “tratamiento verde”, (6 a 12 h en un cultivo de microalgas) después de haber obtenido una alta densidad con levadura por tres a cuatro días (pueden ser obtenidos más de 100 R/M). Esto permite que el zooplancton obtenga la concentración necesaria de ácidos grasos y aminoácidos esenciales para el buen desarrollo de las diferentes especies de invertebrados y peces producidos mediante esta técnica. En la Tabla 19 se muestra la composición de aminoaécidos en cuatro especies del zooplancton de uso en acuacultura.

FIG. 12) Densidad de rotíferos con diferentes alimentos A) Chlorella; B) Levadura; C) Chlorella/Levadura; D) Control (Hirata, 1980). TABLA 19. COMPOSICION DE AMINOACIDOS EN Brachionus plicatilis, CULTIVADO CON DIFERENTES MICROALGAS Y LEVADURAS (g/100 g PROTEINA CRUDA) Nagasaki

Gifu

1975

1976 1

1975

Levadu 3 Levadur 3 1 Levadu ra + Chlorel Levadu Chlorel Levadu 4Chlorell a+ ra Chlorell la ra la ra a Chlorella a 2

Isoleucina

2.9

2.8

3.1

4.4

4.0

4.0

3.2

3.4

Leucina

5.5

5.3

5.6

6.9

6.1

6.2

6.2

6.1

Methionina 0.8

0.8

0.8

1.0

0.9

0.9

0.9

0.8

Cystina

0.7

1.1

0.8

0.7

0.7

0.7

0.9

0.6

Phenylalani 3.5 na

3.4

3.5

4.5

4.1

4.1

3.9

3.9

Tyrosina

3.0

3.0

3.2

3.0

2.8

2.9

3.2

3.1

Threonina

3.5

3.1

3.4

4.0

3.5

3.4

3.4

3.2

Tryptophan 1.1 o

1.2

1.2

1.1

1.1

1.2

1.2

1.2

Valina

3.6

3.5

3.8

4.4

4.0

4.2

4.0

4.2

Lysina

5.7

5.8

5.8

6.6

6.0

6.0

5.5

6.1

Arginina

4.2

4.5

4.6

5.2

4.6

4.8

4.4

4.6

Histidina

1.4

1.4

1.4

1.7

1.5

1.7

1.5

1.5

Alanina

3.2

3.2

3.7

3.9

3.5

3.5

3.9

3.8

Acido Aspártico

7.7

7.5

8.0

9.8

8.9

8.8

8.5

8.0

Acido 8.9 Glutámico

8.8

9.3

10.1

9.7

9.5

10.1

9.8

Glycina

2.9

2.9

3.1

3.6

3.1

3.2

3.1

3.1

Prolina

5.2

5.9

5.8

5.0

4.8

4.9

6.1

6.7

Serina

3.7

3.7

3.9

3.7

3.6

3.7

4.2

4.0

TOTAL

67.5

67.9

71.0

79.5

72.9

73.7

74.2

74.1

Muestra obtenida con Etanol al 80%, por hidrólisis con éter dietílico. 1. Rotíferos cultivados con Chlorella minutissima. 2. Rotíferos cultivados con levadura. 3. Rotíferos cultivados con Chlorella marina y levadura (1 g de levadura/10 cel/ml agua de mar/día). 4. Rotíferos cultivados con levadura y enriquecidos con Chlorella marinapor 36 horas (Watanabe, et al., 1978b; Hirata, 1983). TABLA 20. COMPOSICION DE AMINOACIDOS EN DIFERENTES MICROCRUSTACEOS (g/100 g PROTEINA CRUDA) (WATANABE et al., 1978b) Aminoácidos

Artemia salina1

Acartia clausi

Trigriopus japonicus

Moina sp.

Isoleucina

2.6

3.5

2.5

2.5

Leucina

6.1

5.5

5.0

6.0

Methionina

0.9

1.5

1.1

1.0

Cystina

0.4

0.8

0.7

0.6

Phenylalanina 3.2

3.7

3.5

3.6

Tyrosina

3.7

3.6

4.0

3.3

Threonina

1.7

4.2

3.8

3.8

Tryptophano

1.0

1.1

1.1

1.2

Valina

3.2

4.5

3.3

3.2

Lysina

6.1

5.4

5.7

5.8

Arginina

5.0

4.3

5.2

5.1

Histidina

1.3

1.9

1.6

1.6

Alanina

4.1

5.4

4.9

4.9

Acido Aspártico

7.5

9.0

9.0

8.3

Acido Glutámico

8.8

9.5

10.8

9.8

Glycina

3.4

4.6

4.5

3.7

Prolina

4.7

4.6

4.8

4.2

Serina

4.6

3.3

4.3

4.0

TOTAL

68.3

76.4

75.8

72.6

1. Nauplios de Artemia recien eclosionados 3. TECNICAS ALTERNATIVAS DE PRODUCCION MASIVA Para el cultivo de B. plicatilis en condiciones óptimas se recomienda la utilización de agua de mar (32~35%), la temperatura óptima de 25°C (Hirata & Mori, 1963; Watanabe, 1978, e Hirata 1980), y en cuanto a la selección del mejor método de cultivo masivo a continuación se describen esquemáticamente, algunos ejemplos de sistemas de cultivo desarrollados por diferentes autores para la producción masiva de rotíferos. El primer sistema utilizado fue el llamado método de estanque de transferencia en cultivos sucesivos de Chlorella (SISFFA, 1964a,b) (Figura 14). Posteriormente la producción de B. plicatilis con levadura de pan (Hirata & Mori, 1967) (Figura 15) sustituye la transferencia sucesiva por tanques de recirculación, mejorando el tanque con grava en el fondo y colocando un ascensor de aire en el centro.

La Figura 16 muestra un cultivo sistemático, alternando la dieta de Chlorella y levadura llamado “thinning out method” (Fukusho et al., 1976). Este método es el de mayor uso en cultivos masivos pues reporta una alta producción de rotíferos (300 R/ml). Y finalmente el método desarrollado por Hirata et al. (1977), llamado “sistema de retroalimentación”, semejando un ecosistema con la participación de bacterias pseudomonas (producción de nutrientes por biodegradación) para Chlorella y ésta como alimento de rotíferos, los desechos de éstos hacia un biodepósito, etc. (Figura 17) (“Feedback System”; Hirata, 1980). Las tasas de conversión de alimento de este tipo de sistemas diariamente se incrementan. Se puede concluir que los sistemas de retroalimentación tienen dos ventajas al mismo tiempo: la purificación del agua y la minimización de pérdida de energía a través de la alimentación. Esto permite el establecimiento de un cultivo de producción continua, como se muestra en las Figuras 18 y 19. 4. IMPORTANCIA DEL CULTIVO DE Brachionus plicatilis Las principales ventajas que ofrece el cultivo de Brachionus plicatilis son: rangos amplios de T° y S%, y diferentes alternativas prácticas de cultivo masivo, su pequeño tamaño (100–300μ), lo que permite a las lavas de peces y crustáceos ingerirlos cuando todavía no pueden ingerir nauplios de artemia, su fácil y barata alimentación con diferentes especies de fitoplancton, levaduras y dietas artificiales. Su alta velocidad de reproducción bajo condiciones óptimas de cultivo, pudiendo duplicarse la población en menos de 24 horas, lo que permite obtener altas densidades (Theilacker & McMaster, 1971; Amat, 1975; Funikowa & Idaka, 1973; Hirayama & Kusano, 1972; Hirata, 1975; Hirata et al., 1985; Watanabe et al., 1979; Kitajima et al., 1979; Imada et al., 1979; Yufera et al., 1983; Trotta, 1983). En cuanto a su contenido nutricional, como ya se mencionó anteriormente B. plicatilis ofrece la gran ventaja de incrementar su contenido nutricional en relación de su dieta como lo demuestran los trabajos de Watanabe et al. (1983) y cuyos resultados en relación a contenido de ácidos grasos esenciales se presentan en las Tablas 20 y 21. Para el buen manejo de la población de rotíferos en cultivo, es recomendable el uso de ecuaciones sencillas como las que se muestran en la Tabla 22, que nos permiten conocer la concentración adecuada de alimento y la tasa de reproducción y fecundidad, factores que nos indican el buen desarrollo del cultivo, que si son bien controlados nos permitirán el establecimiento de cultivos continuos y densos para su uso como alimento vivo.

FIG. 13) Método del tanque de transferencia.

FIG. 14) Esquema del sistema de cultivo en tanque de recirculación: A) Bomba de aire; B) Rotíferos en el medio; C) Tubo de vinil (25 cm de diámetro); D) Filtro de recirculación; E) Tina de policarbonato (Pan-light), cubierta de fibra de vidrio..

FIG. 15) Técnica de cultivo desarrollada por la asociación The Seto Inland Farming Fisheries Association (SISSFFA) y la Estación de Maricultura de Nagasaki. Este método es el más comúnmente utilizado y es llamado “Thinning out method” (Fukusho et al., 1976).

FIG. 16) Sistema de retroalimentación de nutrientes (“Feedback System”) para el cultivo masivo de rotíferos (Hirata, 1980).

FIG. 17) Variaciones en la densidad de rotíferos en el sistema de cultivo de retroalimentación (“Feedback System”) en tanque de 2,700 l (Hirata et al., 1980).

FIG. 18) Sección del sistema de retroalimentación del cultivo de rotíferos: A) Tanque de 2,700 l; B) Biodepósito en zig-zag; C) Aereador móvil; D) Motor de reducción; E) Regulador de automóvil; F) Compresor. TABLA 21. TIPO DE ACIDOS GRASOS PRESENTES EN ROTIFEROS PRODUCIDOS EN VARIOS SUSTRATOS ROTIFERO ROTIFERO ACIDOS ROTIFERO ROTIFERO LEVADURA LEVADURA GRASOS Chlorella AGUA (S. + Chbrella CULTIVO marina DULCE cereviceae) marina 16:0 8.7 11.7 16.8 8.9 16:1ω7 24.2 16.6 24.3 18.9 18:0 4.8 6.0 1.7 1.6 18:1ω9 33.9 22.8 10.1 9.0 18:2ω6 + 5.8 + 10.4 + 3.2 + 15.7 + 18:3ω3 + 0.6 + 2.2 + 0.4 + 10.2 + 20:1 6.0 + 3.3 2.4+ 0.3 20:3ω3 0.4 2.3 4.4 0.8 20:4ω6 0.4 2.3 4.4 0.8 20:4ω3 0.5 0.6 0.2 1.1 20:5ω3° 1.0° 8.1° 24.1° 1.9° 22:1 1.7 1.5 1.3 22:5ω3 0.2 1.7 3.8 0.3 22:6ω3° 0.5° 0.9° 0.5 -° εω3HUFA° 2.2° 11.3° 28.6° -°

* Watanabe et al., 1983 ° Acido graso esencial para especies marinas + Acido graso esencial para especies de agua dulce TABLA 22. TIPO DE ACIDOS GRASOS PRESENTES EN ROTIFEROS ALIMENTADOS CON LEVADURA (Saccharomyces cerviceae) Y LEVADURA OMEGA (W°) CULTIVADOS LEVADURA ACIDOS LEVADURA ROTIFEROS EN (S. GRASOS OMEGA LEVADURA LEVADURA cereviceae) OMEGA 16:0

8.3 – 20.0

13.4 – 16.9

6–7

10 – 12

16:1ω7

14.2 – 38.2

5.0 – 6.6

26–27

10 – 11

18:0

3.4 – 8.4

2.3 – 2.6

3–4

2–3

18:1ω9

26.1 – 43.9

15.5 – 16.4

26–30

22 – 24

18:2ω6

2.8 – 15.1

1.0 – 1.1

7–9

2–4

18:3ω3

0.5 – 6.4

0.8 – 0.9

20:1

tr - 1.6

8.4 – 9.2

3–4

8 – 10

20:3ω3

3.0 – 3.4

1–2

3–4

20:4ω6

3.0 – 3.4

1–2

3–4

13.4 – 17.4*

1–2*

9 – 12*

0.9 – 1.4

0–0.4

2–3

20:5ω3*

-*

22:5ω3

0.7 – 0.8

22:6 3

-*

12.8 – 15.6*

*

7 – 9*

εω3 HUFA*

-*

33.5 – 35.8*

2–44*

25 – 26*

W° La levadura W está enriquecida con una fuente de ácidos grasos esenciales * Son ácidos grasos esenciales TABLA 23. TASAS DE ALIMENTACION, REPRODUCCION Y FECUNDIDAD EN CULTIVOS DE ROTIFEROS Brachionus plicatilis donde: R = tasa de alimentación S = suplemento alimenticio (g) Tbω = peso total de la muestra de rotíferos (g)

Reproducción:

donde: P.H. = producción de huevos NRh = número de rotíferos con huevos T.R. = número total de rotíferos de la muestra donde: D.H. = densidad de huevos D.R. = densidad de rotíferos Indice de fecundidad: Tasa de recuperación: donde: A = población en momento t1 B = población en momento t2

CULTIVO DE Artomia salina 1. CONSIDERACIONES GENERALES La Artemia salina es un crustácco que en estado adulto mide entre 17–18 mm, posee un par de apéndices prenciles, ojos pedunculados, 17 pares de apéndices, una furca (rameada o bifurcada). La hembra adulta posee un ovisaco en el que incuba de 10 a 30 huevecillos generalmente y en condiciones óptimas hasta 70 huevecillos. Algunos autores reportan de 50–200, según la especie (Figura 20). Presenta un ciclo de vida sexual y asexual. Existen especies bisexuales y especies patenogenéticas en ambas. Pueden presentarse dos alternativas de desarrollo del huevo: uno es el desarrollo de larvas (prenauplio, nauplio) o bien que en condiciones adversas se presente el fenómeno de “Criptobiosis”, en el cual se producen los quistes. Este fenómeno se debe a que la gástrula permanece en este estado en períodos de desecación ambiental; esta gástrula enquistada en condiciones favorables se hidrata y continua su desarrollo hasta eclosionar el nauplio (Figura 21). Esta capacidad de la Artemia de la formación de huevos resistentes es lo que la ha hecho ser uno de los recursos de alimentación en Acuacultura más importantes, pues los quistes pueden conservar su variabilidad durante varios años hasta que se dan las condiciones necesarias para la eclosión. 1.1) Areas de Distribución A finales de los 60's la demanda de quistes de Artemia era insuficiente, por lo que se encareció. Debido a esta gran demanda se incrementaron las investigaciones sobre este organismo, principalmente por el Reference Center de la Universidad de Ghent, Bélgica, en colaboración con laboratorios de Estados Unidos e Inglaterra, explorándose

varias zonas naturales de producción de Artemia en Europa, Asia, América y Australia (Sorgeloos, 1974) (Tabla 23). Aunque su distribución es cosmopólita, la mayor abundancia ocurre en zonas tropicales y subtropicales. Existen dos categorías generales en cuanto a salinidad se refiere de las zonas de producción natural de Artemia: Thalasso-halino donde la mayor concentración de sales son de NaCl (menor número de localidades). Athalasso-halino con sales de Sulfatos, Carbonatos y Sales de Potasio (mayor número de localidades). Estas categorías son importantes, pues determinan las diferentes especies de Artemia. 2. OBTENCION Y CONSERVACION DE QUISTES Existen cinco etapas fundamentales para la preparación de quistes que son: colecta en zonas naturales o en cultivos intensivos, filtrado, lavado, secado, envasado y almacenado. En zonas naturales (salinas, lagos, zonas estuarinas), los quistes se acumulan en las orillas mezclándose con arena, lo que permite variaciones del nivel del agua y éstos están sometidos a deshidratación e hidratación, lo que disminuye su viabilidad, por lo que al colectarlos deben de ser pasados por tamices, lavarse alternativamente con agua de mar y agua dulce, incluso se recomienda su centrifugación para eliminar la mayor parte de quistes no viables, y su secado por varios métodos, entre ellos corrientes de aire. Existen muchos métodos para la obtención de quistes y técnicas de decapsulación reportadas por la bibliografía, ya que A. salina es objeto de estudios muy intensos. En la Table 24 se muestra un ejemplo de la técnica de decapsulación de quistes de Soogeloos, 1982. FIG. 19. CICLO DE VIDA DE Artemia salina

FIG. 20a) Artemia salina (Ivleva et al., 1973): A) Hembra, B) Cabeza de macho, C) Cabeza de hembra, 1. Ojo nauplio, 2. antenuelas, 3. antena, 4. apéndice toráxico, 5. saco ovigero, 6. segmento abdominal, 7. furca, 8. ojo pedunculado.

FIG. 20b) Estados nauplio de Artemia salina. TABLA 24. ZONAS NATURALES DE PRODUCCION DE Artemia salina EN EL MUNDO (P. SORGELOOS, 1974)

NUMERO PRINCIPALES NUMERO DE CONTINENTE TOTAL DE PAISES LOCALIDADES LOCALIDADES ASIA 19 EUROPA 77 ESPAÑA 37 AMERICA 37 U.S.A. 34 DEL NORTE MEXICO 9 AMERICA *REGION 11 6 CENTRAL CARIBE AMERICA 19 ARGENTINA 7 DEL SUR** ASIA 19 URSS 15 AFRICA 18 Méxco (Baja California, Sonora, Sinaloa, Culiacán, S.L. Potosí, Estado de México, Hidalgo, Zacatecas, Yucatán). * (Bahamas, Puerto Rico, Santo Domingo, Martinica) ** (Argentina, Bolivia, Brasil, Colombia, Ecuador, etc.) TABLA 25. TECNICAS PARA DESCAPSULAR QUISTES DE Artemia salina (P. SORGELLOS, 1982) 1. Hidratar el huevo de artemia una hora con aereación. 2. Cerrar el aire de la incubadora y dejar reposar unos minutos. Los huevos que sedimenten sacarlos con un tamiz y los que floten desecharlos. 3. Pasar la artemia a la solución descapsulante de siete a diez minutos como máximo. Evitar que suba la temperatura a más de 35°C (al terminar se ve el quiste de color anaranjado y transparente al microscopio). 4. Regresar los huevos al tamiz y lavarlos con agua de la llave hasta que pierdan el olor a cloro (unos diez minutos). 5. Lavar los quistes con HCl .1 normal (18 ~ 20 segundos). 6. Regresar la artemia al tamiz y lavarla con agua de la llave unos cinco minutos. 7. Pasar los huevos a la incubadora con agua de mar y esperar la eclosión en 24 horas. OBTENCION DE LA SOLUCION DESCAPSULANTE La solución descapsulante está formada con agua marina, Hidróxido de Sodio e Hipoclorito de Sodio. 1. Volumen de solución descapsulante 14 ml por gramo de quiste (71.88 ml) 2. Cantidad de Hipoclorito de sodio H.S.

(10 g/68.12 ml)

3. A = .5 por gramo de quiste B = 3000 por índice de refracción del Hipoclorito - 4003 4. Cantidad de agua de mar Es igual a la diferencia que hay entre el volumen de la solución descapsulante menos la porción del Hipoclorito de Sodio. 5. Cantidad de Hidróxido de Sodio 0.15 g por g de quiste (1.5 g/10 g) a. Producción de Quistes Es importante mencionar que a salinidades bajas (100 g/l), existe alta reproducción. Este dato debe considerarse, pues permite un reclutamiento continuo, pudiendo partir de una pequeña población, se puede obtener en pocas semanas producciones altas. A salinidades muy altas no hay reclutamiento, se generá la producción de quistes, acompañada de la muerte de los adultos. La producción de quistes no sólo se desencadena por altas salinidades, sino por alta temperatura y desecación, niveles tóxicos de iones (K, Ca, etc.). La Artemia es un organismo osmoregulador, por lo que dentro de su cuerpo la salinidad es baja y deshecha constantemente sales. b. Producción Comercial Los mayores productores a nivel mundial de quistes de Artemia son: Estados Unidos, URSS y Bulgaria. La Tabla 25 presenta los principales aislamientos de quistes y nauplios de Artemia correspondientes a nueve localidades geográficas a nivel mundial de importancia comercial. Es sumamente difícil establecer un programa simple para controlar la producción y cosecha de Artemia en zonas naturales, por todos los factores antes mencionados por lo que se recomienda: 1) Un monitoreo periódico de las poblaciones en estudio. 2) Caracterizar su ciclo de vida a través del año (número de organismos adultos, nauplios, quistes). 3) Lo anterior permitirá conocer la concentración de alimento adecuado y el tiempo idóneo para fertilizar y el establecimiento de la cosecha. En las salinas, la introducción del cultivo de Artemia contribuye a la precipitación de la sal, ya que la Artemia controla la población de algas disminuyendo la viscosidad. Al introducir Artemia, se contribuye a obtener mayor pureza de la sal por otros compuestos o partículas (Sorgeloos, 1982). 3. CULTIVO DE ARTEMIA 3.1) Parámetros Ambientales •

Temperatura: En relación a la temperatura, el límite inferior es de 6°C y el límite superior de 37°C. Después de este rango hay alta mortalidad.

•

• •

Composición Química: La composición química del medio debe de tener iones de Na, K, Mg en proporciones adecuadas. La relación Na:P y Cl:SC4 es muy importante. Cabe mencionar que se han transferido especies de medios con sales de Carbonatos a medios con sales de Sulfatos, y se ha reportado que pueden adaptarse a ellos, observándose cambios de interés en la cepa adaptada diferente a la cepa original. pH: En relación al pH, se considera adecuado el rango de 8.0 a 10.0. Oxígeno: El rango de O2 es amplio desde 1.0 mg/l hasta saturación de O2.

3.2) Alimentación Se han encontrado en análisis del contenido del tubo digestivo desde algas y detritus hasta granos de arena, lo que demuestra que es un organismo filtrador no selectivo, por lo que puede ingerir materiales contaminados. Ingiere partículas de 1.2 a 50 μ. Sólo se alimenta de partículas, no de alimentos solubles. La Artemia no regula su nutrición (se alimenta las 24 h). Estos factores deben de considerarse para la adecuada selección de las especies silvestres, y para calcular la concentración y la dieta adecuada para fines acuaculturales. En las poblaciones silvestres es difícil determinar el rendimiento máximo sostenible (RMS), ya que éste depende de los factores ambientales. 3.3) Proceso de Eclosión El fenómeno de eclosión es un fenómeno químico puro (intercambio iónico), relacionado con la concentración de glicerol que posee el embrión, a mayor producción de glicerol hay mayor absorción de agua; en etapas críticas de presión osmótica la membrana se rompe, y después la concentración de glicerol súbitamente baja a cero, el glicerol es liberado. Si bien se ha observado que en altas densidades de quistes la presencia de glicerol es importante, pues interviene en la sincronía de la eclosión (ya que no actúa tóxicamente sobre las larvas). Es recomendable cambiar esta agua antes de que transcurran diez horas de la eclosión, ya que la presencia del glicerol incrementa las poblaciones bacterianas. 3.4) Parámetros que permiten la eclosión de quistes • •

•

•

•

Temperatura óptima de eclosión de quistes: 25 a 30°C. Salinidad: 5 ppm (límite variable). A mayor S‰ de 30 ppm, los quistes no alcanzan el período crítico de ruptura o eclosión, y en tal caso no se consigue ésta. Decapsulación: En la decapsulación se controla el proceso de osmo-regulación. Permitiéndose la decapsulación es más fácil conseguir la eclosión (en el anexo se incluye la técnica de decapsulación recomendada por P. Sorgeloos). pH: A un pH de 8.0 hay una buena eficiencia de eclosión. Debajo de éste la eclosión disminuye. Se recomienda el uso de 2 g de NaHOO3/1 para asegurar una mayor eclosión. Oxígeno: En el metabolismo de Carbohidratos de Artemia, la presencia de O2 es relevante. Para conseguir una eclosión eficiente se recomiendan altos niveles de O2 (condiciones anaeróbicas afectan la eclosión y el metabolismo de Carbohidratos).

En la Tabla 26 se muestran las concentraciones de sales recomendables para eclosión y para cultivo de Artemia. TABLA 26. PRINCIPALES CARACTERISTICAS DE AISLAMIENTO DE Artemia DE NUEVE LOCALIDADES GEOGRAFICAS (QUISTES Y NAUPLIOS) Eclosión: mg Tiempo de nauplio/g de cosecha (h) quiste incubación

Nauplio en Longitud peso seco total del (μg) nauplio (μm)

435.5 - B

24

1.63

Bahía San 497.7 - B Pablo (USA)

24

1.92

Macau, Brasil 529.0 - B

24

1.74

Gran Lago 467.0 - B Salado (USA)

24

2.43

Bahía Snaik (Australia)

537.5 - P

29

2.47

Lago Chaplin 400.4 - B (Canadá)

27

2.04

474.6

Lavaldulc (Francia)

561.8 - P

31

3.08

509.0

Tientsin (China)

400.5 - P

29

3.09

515.0

Margherita di Savoia 458.2 - P (Italia)

29

3.33

Localidad Bahía de San Francisco (USA)

443.3

Peso húmedo (80.2%H2O) Sorgeloos (1982) Tiempo de incubación a 25°C B - bisexual o P - partenogenética

TABLA 27. CONDICIONES OPTIMAS EN CUANTO A COMPOSICION Y CONCENTRACION DE SALES REQUERIDAS PARA LA PRODUCCION DE Artemia EN CULTIVO Y PARA LA ECLOSION DE QUISTES (P. SORGELOOS, 1982) CONDICIONES QUIMICAS CONDICIONES QUIMICAS

PARA ECLOSION FUENTE

CONC. g/l

PARA CULTIVO CONC.g/l

NaCl

50

31.08

MgCO

13

7.74

MgCl2

10

6.09

CaCl2

0.3

1.53

KCl

0.2

0.97

NaHCO3

2.0

2.00

O2 - 55 ppm pH - 8.0

3.5) Cultivo Intensivo Se han desarrollado diferentes sistemas para el cultivo de Artemia en condiciones de laboratorio para fines de investigación sobre la Fisiología, Bioquímica, los mecanismos de formación de quistes, eclosión y el aporte nutricional de la Artemia, entre otros muchos estudios importantes, que han permitido el establecimiento de cultivos para la nutrición de larvas de peces y crustáceos de importancia en Acuacultura. Estos cultivos se pueden clasificar en dos grupos: los llamados cultivos intensivos, en recipientes de volumen controlado (tanques de concreto, tinas de plástico, estanques rústicos, etc.). En estos sistemas las condiciones ambientales y los nutrientes están controlados, por lo que se logran altas densidades de cosecha. En la Tabla 27 se muestran algunos ejemplos de dietas utilizadas para Artemia en condiciones de cultivo y en la Tabla 28 se muestran algunas características de los cultivos de Artemia, entre ellos el sistema intensivo. 3.6) Cultivo Extensivo El aprovechamiento de zonas naturales de producción de Artemia (salinas, estuarios, lagos salinos), así como su buen manejo para incrementar su producción, permite el establecimiento de los cultivos extensivos. En los cultivos extensivos puede esperarse una cosecha de 10–20 kg org/m2/día, siendo una producción anual mayor de 30 ton/ha/año. En la Tabla 27 se muestran algunos ejemplos de sustratos utilizados para el cultivo extensivo y la Tabla 28 muestra algunas características de los diferentes tipos de cultivo de Artemia. Hay que esperar un óptimo en la población para poder manipular los parámetros que inducen la formación de quistes (S‰, Oxígeno, T°). En relación a la producción de quistes por estación, se calcula en 20 kg/Ha/estación (cinco meses). 3.7) Recomendaciones para la optimización de la cosecha de quistes •

Diseño de estanques bien orientados (contra el viento) para favorecer la acumulación de quistes (lugares tropicales).

• • • • • •

Construcción de barreras (bambú, plástico, etc.). Determinar la frecuencia óptima de cosecha (una vez al día, preferentemente por la mañana). Diseño de redes colectoras de malla doble de l mm (exterior) y 50μ de luz interior). Colección de los quistes en solución saturada y aereación continua (para deshidratación de quistes). Aplicación de técnicas para provocar diapausa. Procesar los quistes (salado, desecado, empaque). TABLA 28. DIETAS UTILIZADAS PARA CULTIVOS DE Artemia (Coll-Morales J., 1983) TIPO DE ALIMENTO

RECURSO

TIPO DE CULTIVO

Microalgas

Chlorella, Chlamidomonas, Dunaliella, diferentes especies de Laboratorio e dinoflagelados (Ej. Anacystis sp., intensivo especies de diatomeas (Skeletonema, Thallassiosira, etc.)

Dietas inherentes

Spirulina (seca). Desechos de soya, salvado de arroz

Fertilización

Gallinaza, abonos agrícolas minerales Extensivo

Intensivo

TABLA 29. PRINCIPALES CARACTERISTICAS DE LOS DIFERENTES TIPOS DE CULTIVO DE Artemia (P. SORGELOOS, 1982) TIPO DE RECIPIENTE ALIMENTO OBJETIVO DENSIDAD CULTIVO Diferentes Bioensayos Acuarios, especies de y Cultivos de botellones microalgas, alimentación 5g/10 l Laboratorio bolsas de salvado de a pequeña plástico arroz escala INTENSIVOS Salvado de arroz+ S‰ Obtención Estanques, Cultivos rústicos, 35 ppm + alta de biomasa y Intensivos 10,000 org/l estanques de concentración quistes para (por lote) concreto Acuacultura de O2 + Fe EDTA EXTENSIVOS* Manejo de Estuarios, Manejo de las Obtención La zonas de lagos salinos, condiciones de biomasa y producción producción salinas naturales (S quistes para está en natural ‰, O2,pH, Acuacultura función de la (depende de estación nutrientes) las climática condiciones naturales del

sistema) En salinas Introducción estacionales Conocimiento de especies inoculación y control de Obtención (depende de Estuarios, de 100 a 500 condiciones de biomasa y las lagos salinos, g quistes/Ha. naturales (pH, quistes para condiciones salinas Salinas S‰,O2, Acuacultura naturales del permanentes nutrientes) sistema) 10–15 g quistes / Ha. *

1. Para favorecer la producción en los cultivos extensivos es recomendable el uso de sales para la agricultura:200 kg/Ha de Monofosfato de Amonio100 kg/Ha de Nitrato de Amonio500 kg/Sales de Calcio (regula el pH) 2. Es importante el control del nivel del estanque para favorecer el desarrollo del fitoplancton y no el de planctonbentónico. 3. Puede usarse la técnica de fertilización combinada usando 1.8 ton/Ha de gallinaza (cada tres días) después dehaber fertilizado con fertilizantes minerales).

TABLA 30. COMPOSICION DE DIETAS MEZCLADAS USADAS PARA LA ALIMENTACION DE ROTIFEROS Y Artemia EN CULTIVO Y DIETAS ENRIQUECIDAS Ingredientes g/100 g Dieta para mezcla rotíferos

Dieta para Mezcla Artemia enriquecida

Polvo de espirulina seca

40 1 + 40 3 ° 40 1 + 40 2 *

Levadura IFP

40

40

40 1

° 3

73

73

2

2

40

Pescado autolizado DL-Metionina

+ 1 2 °

1

D-Glucosa HCL

0.5

0.5

0.5

Almidón de maíz

9.9

9.9

7.9

9.4

4

4

4

10

10

Aceite de hígado de 4 bacalao Colesterol

1

Mezcla de vitaminasa)

3.2

3

3.2

3.2

9.6

10

Cloruro de Colina

2

2

2

2

4

4

CaHPO4

0.3

0.5

0.3

0.3

1

0.8

FeSO4.7H2O

0.1

0.1

0.1

0.1

0.4

0.2

+1

Gatesoupe et al., 1977 Gatesoupe et al., 1981 °3 Gatesoupe et al., 1981 a) Gatesoupe & Luquet (1981) - (mezcla de vitaminasde Halver (1972). *2

4. IMPORTANCIA NUTRICIONAL DE Artemia La Artemia es un excelente alimento vivo en la Acuacultura por sus características de desarrollo, su pequeño tamaño de nauplio y metanauplio (adecuado para las larvas y juveniles de crustáceos y peces) y fácil manejo, etc. El valor nutritivo de los nauplios recién eclosionados es muy alto; este valor decrece en ausencia de alimento. Si la Artemia (metanauplio y nauplio) es alimentada adecuadamente, podomos obtener un enriquecimiento de nutrientes esenciales en un sustrato de microalgas (vivas o secas), o en una mezcla artificial de nutrientes (lípidos, aminoácidos, ácidos grasos, etc.) (Tacon, 1987). Se ha calculado que se requiere entre un 2.5 a 5 g de la fuente, enriquecida para un millón de nauplios, y este enriquecimiento se logra en un período no menor de 6 h. En la Tabla 29 se presentan diferentes mezclas de nutrientes y mezclas enriquecidas que se utilizan para Artemia y rotíferos. Los recursos nutricionales que posee Artemia (proteínas, ácidos grasos, etc.). Su composición química y su concentración varían de una cepa a otra, como se muestra en la Tabla 30. De estos nutrientes, las principales fuentes a considerar son los ácidos grasos y aminoácidos esenciales en los nauplios y metanauplios. Se ha mencionado ya en capítulos anteriores, que la importancia de los llamados alimentos vivos (fitoplancton y zooplancton), radica en el aporte de ácidos grasos y aminoácidos esenciales que puedan brindar para el desarrollo larvario de peces y crustáceos (Watanabe et al., 1983). En la Tabla 31 se muestra la composición en ácidos grasos de cuatro cepas de Artemia (nauplios recién eclosionados) de diferentes localidades. Para lavas de peces marinos, los nauplios de Artemia contienen una alta proporción de ácidos grasos esenciales de tipo W,(20:5W3 y 22:6W3) que son los más nutritivos y que permiten el buen desarrollo y alta supervivencia de las larvas. Para especies de agua dulce, los nauplios de Artemia contienen una alta proporción de los ácidos grasos esenciales W3 (18:2W6 y 18:3W3) (Watanabe et al., 1983). La calidad nutricional de Artemia varía de un aislamiento a otro, de tal forma que en el mercado internacional alcanzan un alto valor aquellas cepas de Artemia cuyos quistes poseen concentraciones altas de aminoácidos esenciales y ácidos grasos. En Latinoamérica y el Caribe se reporta un gran número de localidades en donde se produce Artemia en forma natural en salinas y zonas estuarinas, de las que se conoce muy poco en relación a su producción, caracterización de la cepa (biología básica, análisis proximal, ecología), y potencialidad de industrialización para ser utilizadas en

Acuacultura. Es importante el desarrollo de trabajos de investigación que permitan la explotación de este importante recurso en los países latinoamericanos y del Caribe. TABLA 31. ANALISIS PROXIMAL Y MINERAL DE LA COMPOSICION DE HUEVOS Y NAUPLIOS DE Artemia DE TRES LOCALIDADES Nauplios de Artemia (recién eclosionados)

Huevos Artemia Compuestos

San S. San S. Canada Canada Francisco America Franciso America

Humedad % -

-

-

89.7

90.9

88.2

Proteína %

54.4

51.5

47.5

6.1

6.5

6.8

Grasa %

6.4

10.5

4.8

2.0

1.6

2.1

Ceniza %

6.3

13.0

15.3

1.2

1.0

1.5

Ca mg/g

3.73

2.21

1.41

0.23

0.24

0.41

Mg "

2.80

2.53

5.59

0.44

0.20

0.68

P

"

7.60

6.95

7.63

1.33

1.21

1.44

Na "

6.13

31.91

28.58

4.02

1.43

4.93

K

"

5.73

5.34

7.12

1.08

0.96

1.16

Fe μ/g

1298

1277

1022

52.2

294.6

287.3

Zn "

91.2

96.0

61.4

16.1

21.1

24.1

Mn "

98.3

50.9

14.8

2.1

2.6

3.7

Cu "

10.6

9.1

15.9

0.6

1.1

1.9

* Watanabe et. al. (1983) TABLA 32. COMPOSICION DE ACIDOS GRASOS (%) DE NAUPLIOS (RECIEN ECLOSIONADOS) DE Artemia EN CUATRO LOCALIDADES Bahía ACIDOS RAC de San Canadá China Francia GRASOS Pablo 14:0 1.79 0.43 0.83 1.80 1.73 14:1 2.92 2.26 1.67 2.24 3.03 16:0 12.70 7.79 9.99 11.40 11.90 16:1ω7 16.78 5.24 9.03 19.06 11.34 16:3ω4/17:1ω8 4:33 2.44 1.47 2.54 2.20 18:0 4.07 3.08 5.12 3.99 4.21

18:1ω9 18:2ω6* 18:3ω3* 18:4ω3 20:2ω6/20:3ω6 20:3ω3/20:4ω6 20:5ω3**

30.37 29.15 9.62 4.60 2.55 33.59 nd 4.88 0.20 0.24 5.82 1.48 8.45 1.68

28.24 7.95 19.87 1.60 0.44 4.21 9.52

26.81 4.68 7.38 1.26 0.15 3.34 15.35

24.73 6.14 20.90 2.04 1.13 2.45 8.01

° Datos de Klein-Macphee et al., 1982 * Acidos grasos esenciales para pecesde agua dulce ** Acidos grsos esenciales para pecesmarinos Todos los valores están experesadoscomo % total de ácidos grasos.

CULTIVO DE COPEPODOS 1. CONSIDERACIONES GENERALES Los copépodos son crustáceos de pocos milúnetros que son considerados entre las alternativas de alimentación en Acuacultura. Se han logrado cultivos de Calanoideos (Calanus sp., Acartia sp., etc.) y de Harpacticoideos (un ejemplo es Tigriopus japonicus). Tigriopus japonicus es un copépodo Harpacticoideo, cuyo adulto mide alrededor de 230 μm. Posee un desarrollo larvario con seis estadios nauplio. Los nauplios recién éclosionados miden alrededor de 120 μm. El estadio de copepodito está dividido en seis subestadios; el sexto estadio de copepodito es el estado adulto. En la Figura 22 se muestra el desarrollo de este organismo. 1.1) Técnicas de Cultivo El cultivo de copépodos aún no disponde de técnicas sencillas para considerarlos posibles substitutos de la Artemia. La principal especie que se ha cultivado masivamente es Tigriopus japonicus, que se ha utilizado para la nutrición de larvas de peces y camarones (Kitajima et al., 1980a,b; Koga, 1979 en: Hirata et al., 1985). Otras especies que se han cultivado en forma masiva son Tiste, Amphiascella, Calanus etc., pero la que ha ofrecido las mayores ventajas para su producción masiva es T. japonicus por su resistencia a cambios ambientales, como son la temperatura (10–27°C), salinidad (0–18‰), concentración y tipo de alimento, etc. A continuación se brinda la información necesaria sobre el cultivo de esta especiè. En condiciones de cultivo se ha alimentado con una gran variedad de microorganismos (becterias, fitoplancton) detritus o cualquier otro material orgánico de pequeño tamaño. En la Tabla 32 se muestran las diferentes dietas que se han utilizado en el cultivo de T.

japonicus. La selección del alimento determinará el contenido nutricional que pueda aportar esta especie para la alimentación de larvas de peces y crustáceos. Las dificultades para su cultivo masivo no son en razón de un estricto control de parámetros ambientales como la temperatura y salinidad, pues como ya se mencionó anteriormente, esta especie es may resistente a variaciones externas del medio ambiente. Las dificultades para su cultivo están en relación con el sustrato, ya que esta especie es bentónica, por lo que se ha experimentado con diferentes formas y materiales de sustrato artificial. En la Figura 23, se muestran algunos de estos materiales probados. Los mejores resultados de producción se han encontrado cuando se utiliza como sustrato alguna especie de macroalga (Ulva, Enteromorpha, Porfira, etc.), pues no sólo juegan el papel de sustrato sino que aportan material de alimento y constituyen en los sistemas de cultivo un filtro biológico que purifica el agua del mismo. Investigaciones de Koga (1979) consideran que la temperatura óptima en cultivo es de 20°C. En el cultivo de T. japonicus y de otros copépodos en general, es importante proporcionar la temperatura óptima, el pH, el tipo de alimento y su concentración óptima, así como la preparación de hábitats adecuados (para aquellas especies que así lo requieran). 1.2) Importancia de los Copépodos Existe aún un largo camino por recorrer en la investigación encaminada a la producción en cultivo de diferentes especies de copépodos, tanto bentónicas como fltoplanctónicas, pues la lista de especies alternativas se encuentra en proceso de experimentación en laboratorio. Es importante recordar que en el ambiente marino los copépodos ocupan un importante papel en las poblaciones que conforman el zooplancton, pues es este grupo uno de los recursos de alimentación más importantes para peces y crustácoos.

FIG. 21) Estadios de crecimiento de Tigriopus japonicus (Koga, 1979) 1 – 6: Estadios de Nauplio 1° – 6° 7 – 15: Estadios de copepodito y adulto 7 – 9: Copepodito 1° – 3° 10 – 11: Copepodito 4° – 5° (hembra) 12: Adulto hembra 13 – 14: Copepodito macho 4° – 5° 15: Adulto macho

FIG. 22) Esquema de tres diferentes tipos de sustrato para el cultivo masivo de Tigriopus japonicus. A. Estructura tipo panal 1. Base de polivinil transparente 2. Tubos aereadores B. 1. Lámina acanalada de polivinil 2. Línea de acero cubierta con tubo de silicón 3. Aereador C. 1. Tela de mosquitero de plástico (luz de 1.6 mm) 2. Aereador (Estación Experimental de Pesca de la Prefectura Hyogo, Japón 1978). TABLA 33. CRECIMIENTO DE Tigriopus japonicus CON DIFERENTES DIETAS (KOGA, 1979) Tipo de alimento

Tasa de

Crecimiento

alimentación Levadura de repostería

125–625 g/t

(Ind/1) 4,000

Alimento sintético 30g × 7 para anguila y peces veces/t carnívoros

6,000

Alimento sintético para camarón

0.1 – 1.0 g/2 1/5 días

4,000 – 8,000

Alimento sintético para yellowtail

10 – 15g/t/3días

3,000

Nitzchia sp

5 × 105 cel/ml/día

9,000

Leche en polvo

0.1 – 0.5g/2 1/5/días

6,000 – 36,000

Levadura seca

1 mg/1/día

4,000

Fragmentos de Undaria sp

5 – 20g/1/20 días

12,000 – 18,000

Fragmentos de Ulva 5 – 20g/1/20 sp días

17,000 – 36,000

Fragmentos de Enteromrpha sp

28,000

1 kg/t

CULTIVO DE MICRCORUSTACUOS DE AGUA DULCE 1. CONSIDERACIONES GENERALES Dentro de esta clase de organismos existen dos géneros de agua dulce de gran importancia en Acuacultura, que son Daphnia y Moina, las cuales se localizan en diversos medios. El género Daphnia comprende más de 20 especies, de las cuales las más conocidas son: Daphnia magna, D. pulex, D. longispina, D. strauss. En relación al género Moina podemos mencionar a las especies: Moina rectirostris, M. macrocopa, M. brachiata y M. affinis. 1.1) Morfología Estos organismos se caracterizan por poseer un cuerpo comprimido lateralmente y ovalado (Figura 24); no se distinguen segmentos como en otros crustáceos. Presentan

dimorfismo sexual marcado, la hembra es más grande que el macho (Figura 25). Presentan un carapacho de quitina transparente, las antenas o apéndices con numerosas setas; ojos compaestos y simples (ojo nauplio). Una cavidad embriónica con huevos y embriones situados en la parte dorsal, entre el carapacho y el dorso del cuerpo. Para la identificación de especies son importantes los apéndices toráxicos en la forma y número de espinas y setas (Figura 24). 2. PARAMETROS AMBIENTALES 2.1) Hábitat Son organismos ampliamente distribuidos en lagos, reservorios artificiales, charcos temporales y aguas de desecho. Poseen huevos de resistencia llamados efipios con una envoltura quitinosa que el aire y los animales pueden distribuir. Son abundantes en ambientes con alta concentración de materia orgánica en donde proliferan hacterias, levaduras y microalgas. Especies de Daphnia pueden cohabitar con Moina, Copépodos y Brachiópodos. 2.2) Temperatura D. magna es especialmente resistente a cambios extremos de temperatura desde O°C a 22°C y se consideran 18°C-20°C como su temperatura óptima. D. longispina, D. pulex y Moina rectirostris no sobreviven a cambios extremos de temperatura, se desarrollan en temperaturas de 28°C – 29°C. Moina macrocopa se desarrolla también en un rango amplio de temperatura desde 5°C a 30°C y se considera de 24°C – 26°C como su temperatura óptima. Moina brachiata crece en temperaturas de 8°C – 13°C. 2.3) Requerimientos de Oxígeno Estos organismos habitan en medios donde la concentración de O2 es variable, ya que pueden crecer tanto en completa saturación de O2 hasta concentraciones muy bajas. Estas concentraciones están en relación a temperatura, concentración de materia orgánica, concentración de microalgas, etc. La supervivencia en medios pobres de oxígeno depende de la capacidad de sintetizar hemoglobina. Este fenómeno está en relación directa del oxígeno ambiental. Un incremento en hemoglobina está en razón directa de alta temperatura y excesiva densidad de población. Incluso la hemoglobina está presente también en los huevos y la síntesis de hemoglobina también está relacionada con la concentración de CO2 ambiental.

FIG. 23) Daphnia pulex (hembra) Vollmer, 1951 1. Antenula 2. Antena Músculos de las 3. antenas 4. Ojos compuestos 5. Ganglio óptico 6. Músculo del ojo 7. Cerebro 8. Procesos hepáticos 9. Intestino 10. Corazón 11. Ovario

12. Cámara embrionaria 13. Embrios 14. Proceos abdominales 15. Postabdomen 16. Ano 17. Huevo toráxico 18. Saco respiratorio 19. Seta filtradora 20. Carapacho 21. Glándula maxilar Primer par de 22. apéndices 23. Mandíbula

FIG. 24) Estructura de antenulas en macho y hembra de D. magna (Irleva, 1973).

FIG. 25) Huevo de resistencia efipios en D. pulex (a) y D. magna (b). (Irleva, 1973). 2.4) Requerimientos en pH El pH óptimo en estas especies es difícil de determinar. En términos generales, el pH oscila entre 7.1 – 8 y por ejemplo en D. pulex el pH óptimo es de 5 a 6. 2.5) Otros Requerimientos Existe en estas especies una alta sensibilidad a cambios del equilibrio iónico a diferentes concentraciones de cationes en el medio. Las reacciones de Daphnia a la presencia de sales de fosfatos y nitratos (0.5 mg/l) es interesante, pues estimula la reproducción y la madurez sexual.

Los huevos contienen carotenoides y su síntesis requiere de la presencia de luz. Es importante mencionar que la madurez sexual también está influenciada por la presencia de luz. La abundancia y distribución de estas especies depende de la variación estacional pues el número y tamaño de huevos de resistencia partenogenéticos y la medurez sexual dependen de las variaciones de T°, S‰, pH y luz, entre otros. Un exceso de luz solar reduce considerablemente una población. En relación a la producción de huevos Ephippia (Figura 26) (huevos de resistencia partenogenéticos) dependen de la temperatura principalmente. Por ejemplo, en Moina rectirostris éstos se producen a 20~27°C en M. macrocopa a 14°C. La alimentación en Daphnia y Moina es más compleja que en Branchiópodos, ya que estas especies se alimentan de bacterias, levaduras y microalgas. La Daphnia se adapta a cambios ambientales y puede adaptarse a ambientes nuevos en tres - siete días, reproduciéndose partenogenéticamente. Las colectas de estos organismos de los medios naturales para su cultivo, deben hacerse en Primavera y Verano. 3. TIPOS DE CULTIVO La producción de Daphnia y Moina en condiciones de cultivo es relativamente sencilla por su resistencia a variaciones ambientales y diversas dietas altenativas que se pueden usar como se ha mencionado en párrafos anteriores. Como en otras especies de alimento vivo, las alternativas de producción de estas especies pueden ser: cultivo en laboratorio para fines de investigeción, cultivo intensivo y cultivo extensivo. La Tabla 33 muestra la producción de microcrustáceos de agua dulce con diferentes especies de microalgas y bacterias. 3.1) Condiciones Optimas de Cultivo T°C - 15°C a 25°C O2 - 3 a 6 mg/l pH - (6.8 – 7.8) Grado de Oxidación - 14.8–26.2 mg O2/l 3.2) Medios de Cultivo Recomendables • • •

Medios minerales (sales de fosfatos y nitratos) Medios orgánicos (estiércol de caballo, res, cerdo, gallina) Medios enriquecidos (combinación de medios orgánicos e inorgánicos o estractos de suelo

Se recomienda cosechar estos organismos a intervalos regulares para mantener un equilibrio en el cultivo. En condiciones óptimas de cultivo para iniciar la cosecha (de 20 a 25 días después del inicio del cultivo), se puede obtener una biomasa de 10 g/m3. Las Tablas 34 y 35 muestran los diferentes medios de cultivo recomendables para sistemas intensivos y extensivos. 4. IMPORTANCIA NUTRICIONAL

Las especies más estudiadas en relación de su aporte nutricional para la acuacultura son Daphnia y Moina. La Tabla 36 nos muestra el contenido nutricional reportado para Daphnia. Estas dos especies de cladóceros de agua dulce han sido seleccionadas dentro del grupo de zooplancton que ofrece alto contenido nutricional y facilidades de producción en cultivo. La Tabla 37 muestra la composición mineral y proximal de cinco especies seleccionadas como alimento vivo; entre éstas se encuentran Daphniay Moina. Es importante considerar que el contenido nutricional de estas especies está en función directa del sustrato en el que se desarrollan. La Tabla 5 muestra la composición de aminoácidos esenciales de estas cinco especies seleccionadas; dentro de éstas, Daphnia y Moina tienen un buen aporte. Los cladóceros en Acuacultura han sido objeto de estudios muy serios en países desarrollados como el Japón y La Unión Soviética. Estos trabajos han permitido conocer las condiciones óptimas para su producción en cultivo masivo, así como las alternativas de producción en diferentes medios de cultivo. TABLA 34. PRODUCCION DE MICROCRUSTACEOS DE AGUA DULCE CON DIFERENTES ALIMENTOS (IRLEVA I.V., 1973) ESPECIE ALIMENTO

CONSUMO CONCENTRACION DE DE ALIMENTO T°C REFERENCIA ALIMENIO ccl/ml. cel/hr 1,000

Daphnia magna

bacterias coliformes

15

2,000

700

3,000

1,050

4,000

1,700

410

18

750 D. magna

Chlorella pyrenoidosa

D. magna Soenedesmus sp D. magna

Azotobacter y bacteria Coli

200

124 255

1,140

a

299

1,580

24

393

2,160

405

2,300

327

8

58

415

275

22 470

Manuflcva, 1964

Sushchenya, 1958

Vasilleva, 1953 Rodina, 1984a

25 D. pulex

20

Chlamydomonas 50 reinhardti 75

5.8 13.8

100 Moina affinis

Soenedesmus dimorphus

Moina sp Soenedesmus sp

4.5 Richman, 1958

19.1

6,000

24.0

Shirota, 1966

26.5 200

21±2 16.6

500

48.0

Torrentera, 1986 (observación personal)

TABLA 35. MEDIO DE CULTIVO PARA “PULGA DE AGUA” PARA SISTEMA INTENSIVO (SEPESCA-ACUACULTURA, 1983, COM. PERS.) -I1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Póngase 6.6. gr de salvado de trigo en 1 litro de agua. Dejar fermentar en un lugar moderadamente caliente durante una semana. Diluir el litro a 100 litros de agua. Agregar 25 a 50 gr de Cloruro de Sodio (sal). Agregar 25 a 50 gr de Sulfato de Calcio. Colocar la solución en un sitio donde le de bastante sol. Sembrar el medio con “Pulgas de Agua”. -II-

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Póngase 6.6 gr de salvado de trigo en 1 litro de agua. Dejar fermentar en un lugar moderadamente caliente durante una semana. Diluir 1.5 litros en 100 litros de agua. Agregar 25 a 50 gr de Cloruro de Sodio (sal). Agregar 25 a 50 gr de Sulfato de Calcio. Agregar 5 a 10 gr de hígado cocido en rebanadas de 1 mm de grueso. El hígado debe cocerse lo más rápidamente hasta que las proteínas se coagulen. 7. No es necesario poner la solución al sol. 8. Siémbrese el medio con “Pulgas de Agua”. 9. Si falta oxígeno disuelto en la solución, debe retirarse un poco de agua (5 litros) y agregar la misma cantidad de agua limpia fresca y “aereada”. 10. Se añadirá salvado fermentado e hígado cuando sea necesario. -III1. Mezclar hasta formar una suspensión uniforme 1/4 de paquete de levadura para pan fresca en 100 cc. de agua. 2. Añádase la suspensión a 70 litros de agua. 3. Debe mantenerse burbejeo de aire en la solución para evitar la falta de oxígeno disuelto.

4. Siémbrese el medio con “Pulga de Agua”. 5. Se agregará la suspensión cada cinco o seis días.

TABLA 36. RESULTADOS DE CULTIVOS DE MICROCRUSTACEOS DE AGUA DULCE (CLA NUTRIENTES ORGANICOS E INORGANICOS - SISTEMAS INTENSIVO Y EXTENSIVO (IRLEVA, TIEMPO DE VO DOSIS DE NO. INICIAL DURACION BIOMASA MADU COSECHA TO FUENTE DE FERTILIZACION DE DEL MAX. RACION DIARIA DE NUTRIENTES POR m3 DE ORGANISMOS CULTIVO OBTENIDA DEL g/m3 CU AGUA g/m3 (DIAS) g/m3 CULTIVO M3 (DIAS) 1.5 kg (inicial) Excreta de 0.75 kg (cada 8– 10 20–25 40 caballo 10 días) 1.5 kg (inicial) Excreta de 0.75 kg (cada 8– 10 612.5 caballo 10 días) Infusión de excreta de 10 litros 5–50 10–16 9–45 250 25.8 30. caballo Infusión de 10 litros cada 4 34.4 (30– pasto (2 kg/100 15–20 15–19 26–47 250–1,500 5.5 días 38.5) 1) Infusión de 10 litros cada 2–4 excreta de 10–275 10–24 14–42 250–1,000 27.3 27. días (10:3) caballo y pasto 16–20 g inicial 30–40 18–20 120–130 800–1,200 30–50 25– Levadura proteolizada 8–10 g/5 días 16–20 gr inicial 10–40 20–25 180–270 16 280 Levadura 8–10 g/5 días 26 525 proteolizada 23 557 37.5 g nitratos (13 Fertilizantes mg N/l) 2 mg/l 20–40 12 15 13.4 332 minerales superfosfatos 37.5 g nitrato de 20–25 50 7 amonio y 20 gr de (verano) Fertilizantes levadura (al inicio) 100 5 25–40 20– minerales 19 g de nitrato de 35–45 amonio y 10 g de 150 3–4 (invierno) levadura c/5 días Excreta de caballo trozos 0.5 – 1 kg 28 de vegetales superfostatos y

sulfato de amonio Levadura 0.5 kg proteolizada y fertilizantes minerales 10:2

3–4

10–15

TABLA 37. CONTENIDO DE AMINOACIDOS EN Daphnia (IRLEVA I.V., 1973) Tyrosina 4.27% Tryptophano 3.62% Arginina 10.92% Histidina 2.69% Cistina 1.17% Methionina 3.45% TABLA 38. COMPOSICION MINERAL Y PROXIMAL DE CINCO ESPECIES DE ALIMENIO VIVO SELECCIONADO Brachionus Tigriopus Plicatilis japonicus ESPECIE Acartia Daphnia Medio de Levadura Levadura Levadura sp sp cultivo Levadura + Chlorella + Chlorella Chlorella Mezcla% 89.6 89.1 87.6 87.3 88.1 89.3 87.2 Proteína% 7.2 7.9 7.8 9.0 8.5 7.5 8.8 Lipidos% 2.3 2.3 3.8 2.8 1.3 1.4 2.9 Cenizas % 0.4 0.4 0.5 0.5 2.1 0.7 Ca mg/g 0.12 0.26 0.21 0.15 0.39 0.21 0.12 Mg mg/g 0.14 0.17 0.14 0.23 0.76 0.12 0.12 P mg/g 1.48 1.44 1.37 1.31 1.48 1.46 1.85 Na mg/g 0.41 0.30 0.29 0.61 6.63 0.74 1.09 K mg/g 0.35 0.12 0.23 0.84 2.21 0.72 0.92 Fe mg/g 15.9 52.5 43.4 33.8 11.5 72.2 46.4 Zn mg/g 7.4 9.8 8.2 12.3 39.0 12.8 10.0 Mn mg/g 0.4 1.1 1.1 1.0 0.2 13.2 0.5 Cu mg/g 1.1 1.5 1.7 2.4 2.8 1.1 5.8 * Watanabe et al., 1983

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