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III.PRÁCTICA No. 3 IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS POR MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

3.1 Hidrólisis de carbohidratos Los derivados de azucares en los cuales el hidrógeno de los grupos –OH del carbón hemiacetal o hemicetal es reemplazado por un radical orgánico (formando un acetal o cetal) son denominados glicósidos; una molécula de agua es eliminada cuando esta reacción se lleva a cabo. Si el radical orgánico es derivado de otro monosacárido el producto formado es un disacárido. Los polisacáridos son polímeros de monosacáridos unidos unos a otros por enlaces glicosídicos. Los enlaces glicosídicos pueden ser hidrolizados por ácidos relativamente fuertes o por enzimas específicas. Los oligosacáridos son azucares reductores si uno de sus grupos carbonilos está libre (no forma parte del enlace glicosídico).

3.1.1 Cromatografía. Cromatografía es el nombre dado a la técnica utilizada para separar solutos en base a sus distribuciones diferenciales entre dos fases, el sistema de solventes es la fase (fase móvil) que se mueve sobre la otra fase (fase estacionaria). Los solutos se moverán con la fase móvil a una tasa que dependerá de sus distribuciones diferenciales entre las dos fases. Existen tres tipos de cromatografía: partición, intercambio iónico y adsorción. La distancia que se mueve e soluto en relación a la distancia que se mueve el solvente sirve como un medio conveniente para la identificación de solutos. Esta tasa relativa de flujo es el valor de Rf para el compuesto bajo las condiciones específicas del experimento.

Rf = distancia recorrida por el soluto (medida al centro de la mancha) Distancia recorrida por el solvente

Varios compuestos pueden tener el mismo valor de Rf en un sistema de solventes particular; estos frecuentemente pueden ser separados corriendo más de un cromatograma cada uno con un diferente sistema de solventes. Ya que se deben usar

idénticas condiciones para obtener el mismo valor de Rf de un experimento a otro, es necesario siempre incluir un compuesto conocido en un cromatograma para propósitos de comparación. 3.2 Competencias: 1. Describe y realiza la hidrólisis de un disacárido y polisacárido 2. Explica y conoce las técnicas cromatográficas para identificar carbohidratos

3.3 Material y reactivos

Materiales: 1. Matraz de 250mL 2. Pipetas de 5mL y 10mL 3. Cocinilla eléctrica 4. Centrífuga 5. Espátula 6. Backer 250mL 7. Pro pipeta 8. Bagueta 9. Balanza analítica 10. Cuba cromatografica pequeña 11. Asperjador con bombilla

Reactivos: 1. Acido Sulfúrico al 5% 2. Carbonato de Calcio 3. Cromatofolio 20 x20 cm 4. Butanol 5. Acido acético 6. Piridina

7. Acetato de Etilo 8. Sacarosa Q.P 9. Almidón Q.P 10. Antrona 11. Lugol 12. Etanol 13. Revelador de difenilamina 14. Revelador acido 3.5-dinitrosalisilico

3.4 Procedimiento

3.4.1 Hidrólisis: 1. En un matraz colocar 1 g. de sacarosa y en otro 1 g. de almidón. 2. A ambos matraces añadirles 10mL de ácido sulfúrico al 5 % 3. Colocarlos en un baño maría hirviendo por 20 minutos 4. Probar con el matraz que contiene almidón si da coloración con el yodo. 5. Enfriar los hidrolizados con agua corriente y neutralizarlos con suficiente cantidad de carbonato de calcio. 6. Centrifugar y filtrar, y utilizarlo para identificación de los azúcares por cromatografía en capa fina. Sacarosa

Almidón

(cristales)

(polvo) 10ml a cada matraz

1g

Sacarosa

Almidón

20´

Diluidos

Centrifugar + Oscuro

+ Claro

3.4.2 Cromatografia 1. Preparar los siguientes sistemas de solventes: n-butanol-agua-ácido acético (5:4:1) 2. Preparar las placas cromatográficas utilizando como soporte silicagel G. 3. Sembrar las placas con patrón de glucosa versus los hidrolizados. 4. Desarrollar el cromatograma. 5. Revelar el cromatograma pulverizando con antrona (0,150g) en 20 mL del sistema etanol - ácido acético - ácido sulfúrico concentrado (3:1:1) y calentando las placas de 5 a 7 minutos en la estufa a 110 C. Todos los glúcidos dan manchas de color verde de diferente tonalidad. Revelador DIFENILAMINA la cual da un coloreado amarillo toda la placa

3.4.3 Otros reactivos de identificación para cromatográfia A. DIFENILAMINA: Caracteriza a las aldohexosas y aldopentosas. 1. Pulverizar los cromatogramas con una solución de 0,400 g. de difenilamina y 1g de ácido tricloroacético disueltos en n-butanol- metanol(1:1). 2. Calentar los cromatogramas en la estufa a 110 C. Las aldopentosas dan manchas violaceas y las aldohexosas manchas marrones. B. ACIDO 3.5-DINITROSALISILICO: Caracteriza a los azúcares reductores.

1. Pulverizar los cromatogramas con 0.100 g. de ácido 3,5 - dinitrosalicílico y 0.800g. de hidróxido de sodio disueltos en 20 mL de agua. 2. Calentar las placas a 110 ºC por 5 minutos en estufa. Los azúcares reductores dan manchas de color marrón sobre un fondo amarillo paja.

3.5 Resultados Se observó por medio de métodos cromatográficos (cromatografía en capa fina) las manchas características de los carbohidratos

Muestra

Migración

Mig solvente

Rf

Color

Sacarosa

2.6

7.7

0.34

Blanco cristal Color visible

(practica)

obs

antes

del

revelado Glucosa

3.7

7.7

0.48

Blanco cristal Color visible

(practica)

antes

del

revelado Frtucosa

3.1

7.7

0.40

Blanco cristal No

(teoría)

se

hallaba color

Almidon

2.9

7.7

0.38

Blanco polvo

3.6 Cuestionario 1. Indique otros reveladores para identificar azúcares por cromatografía en capa Fina.

El n-butanol saturado de agua) y naftoresorcinol (enacetona, agua y ácido fosfórico)Diversas

técnicas

han

sido

empleadas

en

la

detección

de

los

carbohidratosdespués de la separación cromatográfica. Aquí se incluyen las revelaciones consprays o inmersiones de tiras de papel en paltos de capa fina conteniendodiversos reactivos de coloración.Aunque se trata de métodos sensitivos, resulta muy difícil realizar un análisiscuantitativo.Dentro de los sprays cromogénicos se mencionan: el ácido tiobarbitúrico parala determinación de ácidos siálicos; el orcinolácido sulfúrico para determinar galactosa; antrona para hexosas; carbazol para ácidos urónicos; el resorcinol para residuos de ácidos siálicos unidos, y otros generales y específicos.

el

2. Qué otros métodos cromatográficos de aplican para identificar carbohidratos. De ejemplos (Adjunte cromatogramas, gráficos o figuras) 

Cromatografia ionica



Cromatografía en capa fina cualitativa



Cromatografía de reparto

REACCIONES

SACAROSA + ACIDO SULFURICO C12H22O11 (s) + H2SO4 (l) → 12 C (s) + 11 H2O (g) + H2SO4 (ac) Lo que ha sucedido es una reacción de deshidratación del azúcar provocada por el ácido sulfúrico. La sacarosa se convierte en un residuo negro de carbono, mientras que el agua se desprende en forma de vapor provocando ese ascenso de la masa y esa textura esponjosa

ALMIDON + ACIDO SULFURICO (C6H10O5)n + H2SO4 => H2SO4 + 5nH2O + 6C

Conclusiones La técnica de cromatografía en capa fina (CCF) tiene numerosas ventajas,es rápida, sencilla, barata Tiene también la ventaja de utilizar poca cantidad de muestra

Esto lo hemos averiguado gracias a las muestras patrón, ya que al ser las muestras problema mezclas entre ellas, al meterlas a la camara , el disolvente subirá por la placa e irá separando la mezcla, dejando abajo el patrón más polar. Luego, gracias a los reveladores físicos y químicos, se ve que esta compuesta la mezcla problema.

Después de terminado el trabajo, la realización de este informe nos aclaro en su desarrollo, muchas facetas de lo que son los Hidratos de Carbono, sus solventes y las reacciones que estos tiene frente a distintos solventes, respecto a sus distintas concentraciones y cantidades moleculares.

3.7 Fuentes de información 1. Fessenden J. Carbohidratos, Lípidos y Proteínas Química Orgánica, Editorial Iberoamericana 1ra. Ed. 2. Schaums Carbohidratos, Lípidos y Proteínas Química Orgánica, Teoría y Problemas, Editorial MeGraw. 1ra. Ed.