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• Juan Palacios

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PROLOGO

El conjunto de Prácticas de Laboratorio del curso de HEMATOLOGÍA agrupadas en el presente Guía de Prácticas, han sido especialmente diseñadas para los alumnos de la Escuela profesional y Académica de Biología que están orientados al área de la Salud y a todos los que deseen reproducir algunos experimentos y técnicas fundamentales de esta disciplina. Se procura, con el presente guía, que el alumno realice personalmente los experimentos para desarrollar su manualidad. Pero es indispensable que aprenda a observar y a razonar, y, a través de ello, las bases del método científico. La Hematología no se concibe sin experimentos, pero el estudio teórico siempre debe acompañar y completar al práctico. Por eso, se aconseja a los alumnos estudiar previamente los temas que habrán de ensayar luego en el laboratorio. Como objetivos tenemos: Conocer los reactivos y los materiales básicos utilizados en el Laboratorio de Hematología, Saber manejar los instrumentos más empleados en Hematología Saber preparar las muestras de sangre para la identificación morfológicas de sus elementos celulares. Ser capaz de realizar técnicas hemocitométricas Entender el funcionamiento normal de las células sanguíneas Conocer las principales enfermedades que afectan a la sangre El desarrollo completo de la guía permitirá una mejor comprensión de las técnicas desarrolladas y nivel de conocimientos en el Curso de Hematología

EL AUTOR

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INDICE

Pág PROLOGO ............................................................................................................................ 1 PRACTICA 1 ........................................................................................................................ 9 EXTRACCIÓN DE SANGRE .............................................................................................. 9 PRACTICA 2 ...................................................................................................................... 14 EXTENSIONES SANGUINEAS. ...................................................................................... 14 PRACTICA 3 ...................................................................................................................... 21 RESISTENCIA OSMÓTICA DE ERITROCITOS ............................................................ 21 PRACTICA 4 ...................................................................................................................... 27 HEMATOCRITO VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR ......................... 27 PRACTICA 5 ...................................................................................................................... 39 RECUENTO DE ERITROCITOS Y RETICULOCITOS .................................................. 39 PRACTICA 6 ...................................................................................................................... 48 HEMOGLOBINA SATURACIÓN DE OXIGENO ........................................................... 48 PRACTICA 7 ...................................................................................................................... 56 INDICES ERITROCITARIOS .......................................................................................... 56 CASO CLÍNICO ................................................................................................................. 61 PRACTICA 8 ...................................................................................................................... 62 RECUENTO DE LEUCOCITOS HEMOGRAMA DE SCHILLING ............................... 62 PRACTICA 9 ...................................................................................................................... 74 INDICES LEUCOCITARIOS ............................................................................................. 74 PRACTICA 10 .................................................................................................................... 80 TIEMPO DE COAGULACIÓN Y SANGRIA ................................................................... 80 PRACTICA 11 .................................................................................................................... 89 TIEMPO DE PROTROMBINA RECUENTO DE PLAQUETAS ..................................... 89 PRACTICA 12 .................................................................................................................... 98 TIPIFICACION DE SANGRE. ........................................................................................... 98 SISTEMA RH ..................................................................................................................... 99 PRACTICA 13 .................................................................................................................. 103 PRUEBAS CRUZADAS................................................................................................... 103 PRACTICA 14 .................................................................................................................. 108 BANCO DE SANGRE ...................................................................................................... 108 BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................... 113 REVISTAS ........................................................................................................................ 114

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NOMENCLATURA En términos de uso común para describir anomalías y artificios observados en los preparados coloreados de glóbulos rojos. Acantocitos. Estos son unos glóbulos rojos que tienen unas finas prolongaciones en su superficie. Ocurren como anormalidad hereditaria asociada con metabolismo anormal de los fosfolípidos. Anisocitosis. Este término se utiliza para denotar variaciones del tamaño de los eritrocitos. Anillos de Cabot. En algunas formas de anemia severa aparecen como anillos purpúreos en el centro o cerca de la periferia de los eritrocitos. Anulocitos. Como causa del menor contenido de hemoglobina estos eritrocitos exhiben un área grande de palidez central. Cuerpos de Heinz. La polimerización y precipitación de moléculas de hemoglobina desnaturalizada produce los cuerpos de Heinz, que se demuestra mejor mediante tinción supravital con violeta de metilo. Cuerpos de Howell-Jolly. Se trata de unos restos nucleares que aparecen como unas inclusiones azules densas que pueden ser únicas o múltiples, por lo general cerca de la periferia de la célula y medir hasta 1 m de diámetro. Los cuerpos de Howell-Jolly y los anillos de Gabot ocurren en los frotis de sangre después de la esplenectomia, y en forma ocasional en los estados dishemopoyéticos como anemia megaloblástica y las leucemia, pero los anillos de Cabot, son menos frecuentes que los cuerpos de Howell-Jolly. Drepanocitos (critrocitos falciformes). En casos de anemia hemolítica (anemía drepanocítica) ocurre esta anomali en la que muchos eritrocitos exhiben una forma semilunar franca y toman el colorante de mucho más que los eritrocitos circundantes. Eliptocitosis. Estas células tienen unas especulas distribuidas con uniformidad en su superficie como consecuencia de una alteración del ambiente intracelular y extracelular. El término es sinónimo de eritrocitos espinosos. Eritrocitos crenados. Este artificio suele deberse al mal secado del frotis de sangre. Eritrocitos en blanco de tiro. En estos eritrocitos existe un área central redondeada de citoplasma coloreado normalmente, rodeada por un área clara que, a su vez está rodeada por un anillo periféricos normocrómico. Eritrocitos espinosos. Estas células tienen varias saliencias aguzadas que semejan las espinas de ciertas plantas. Son poiquilocitos y es fácil confundirlos con las formas crenadas. Eritrocitos pinzados. Estos eritrocitos dan la impresión de que una parte de su sustancia hubiese sido indentada con una pinza. Es probable que esto represente el proceso de fragmentación. Esferocitos. Célula a esferoides que ocurren en muchos tipos de anemia hemolítica, incluso esferocitosis hereditaria, anemia hemolítica inmune y en las quemaduras.

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Esquistocito. Estos son productos de la fragmentación de los glóbulos rojos que pueden adoptar una forma triangular o elíptica pequeña con indentación o presentarse como eritrocitos crenados en forma irregular. Son comunes en la anemia hemolítica. Estomatocitos. Glóbulos rojos en los cuales el área bicóncava central aparece como una hendidura y como una concavidad circular. Se han notado grandes cantidades de este tipo de eritrocitos en un tipo infrecuente de anemia hemolítica hereditaria. Hipocromía. Se refiere a la reducción de la intensidad de la tinción, que puede variar desde un ligero incremento de la zona de palidez central hasta un área de gran tamaño rodeada por un pequeño borde de citoplasma hemoglobinizado. Leptocito. Fino glóbulo rojo hipocrómico de diámetro normal y de VCM disminuido. Suele ocurrir en la talasemía. Microcitos. Son más pequeños y más pálidos que los eritrocitos normales. Microesferocitos. Eritrocitos de forma esférica más pequeños que los eritrocitos normales que por su forma esférica no exhiben un área de palidez central. Existen en las enfermedades hemolíticas. Picnocito. Glóbulos rojos distorsionados y contraídos similares al equinocito. Poiquilocitosis. Dícese de la presencia de eritrocitos de formas irregulares. El término comprende alteraciones morfológicas como eritrocitos espinosos, eliptocitos, eritrocitos, primiformes y desgarrados y drepanocitos. Policromasia. Este término denota que la célula toma los colorantes ácidos y básicos al mismo tiempo por alteración en el contenido de hemoglobina del eritrocito, de modo que exhibe en gran medida la misma coloración que se ve en la etapa intermedia de la eritropoyesis. En este caso el citoplasma se ha atrasado respecto del núcleo en su maduración y no ha perdido del todo su ácido ribonucleico. Punteado basófilo. Estos pequeños gránulos azules se forman mediante condensación de la sustancia basófila del citoplasma de modo que le imparten un aspecto punteado. En estados como anemia severa estos gránulos pueden ser muy gruesos. Siderocitos. Estos son eritrocitos que contienen uno o más gránulos de distribución despareja que contiene hierro y se reconocen por la reacción positiva con el azul de Prusia. En ocasiones se disciernen como unos puntos basófilos en los frotis coloreados con los métodos de Romanowsky y entonces pueden conocerse como cuerpos de Pappenheimer. Estas células ocurren en la sangre periférica en los trastornos asociados con compromiso de la síntesis de la hemoglobina, como talasemia. También existen en la sangre después de la esplenectomia, cuando se ha hecho ésta para tratar ciertos estados hemolíticos.

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VALORES HEMATOLÓGICOS NORMALES HEMOGLOBINA Neonatos de término, sangre del cordón 13,6-19,6 g/dl Niños de 1 año 11,2 g/dl Niños de 10 años 12,9 g/dl Hombres 13,5-18,0 g/dl Mujeres 11,5-16,4 g/dl GLÓBULOS ROJOS Neonatos de término, sangre del cordón 4,0-5,6 x 106/ul Niños de 1 año 4,5 x 106/ul Niños de 10 años 4,7 x 106/ul Hombres 4,5-6,5 x 106/ul Mujeres 3,9-5,6 x 106/ul VOLUMEN CELULAR CENTRIFUGADO (VCC) (Hematócrito Ht) Neonatos de término, sangre del cordón 0,44-0,62 1/l Niños de 1 año 0,35 l/l Niños de 10 años 0.3759 l/l Hombres 0,40-0,54 l/l Mujeres 0,36-0,47 l/ll VOLUMEN CORPUSCULAR MEDIO (VCM) Adultos 80-96 fl Hemoglobina corpuscular media (HCM) Adultos 27-32 pg Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM) Adultos 32-36 g/dl RETICULOCITOS Neonatos de término, sangre del cordón 2-6% LEUCOCITOS Neonatos de término al nacer 10-25 x 109/1 1 año 6-18 x 109/1 4 a 7 años 6-15 x 109/1 8 a 12 años 4,5-13 x 109/1 Adultos 4-10 x 109/1 RECUENTO LEUCOCITARIO DIFERENCIAL Relativo Absoluto por 7000 leucocitos Adultos: Neutrófilos 40-75% 2800-5250 Linfocitos 20-45% 1400-3150 Monocitos 2-10% 140-700 Eosinófilos 1-6% 70-420 Basófilos < 1% 0-70 Plaquetas 150000-400000 x u1 Recuentos diferenciales en médula ósea Hemohistioblastos 0,1-2% Hemocitoblastos 0,1-1% Mieloblastos 0,1-3,5% Promielocitos 0,5-5% Mielocitos Neutrófilos 5-20% 7

Eosinófilos Basófilos Metamielocitos Formas iniciales Formas en cayado Polimorfonucleares Neutrófilos Eosinófilos Basófilos Linfocitos Monocitos Megacariocitos Células plasmática Pronormoblastos Normoblastos Iniciales y formas intermedias Formas tardías Relación mieloide-eritroide

0,1-3% 0-0,5% 10-30%

7-25% 0,2-3% 0-0,5% 5-20% 0-02% 0,1-0,5% 0,1-3,5% 0,5-5% 2-20% 2-10% 2,5-15;1

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PRACTICA 1 EXTRACCIÓN DE SANGRE INTRODUCCION. La hematología viene ser el estudio de la sangre a través de sus componentes sanguíneos y los correspondientes órganos hematopoyéticos que lo producen, por lo tanto dentro del área de hematología se van a realizar diferentes pruebas o análisis destinados a determinar si las muestras de sangre respectivas presentan anormalidad en cuanto al número, concentración, etc. O si existe algún tipo de variación en estos elementos (forma, aspecto, etc.) para ello es necesario seguir ciertas condiciones básicas que empiezan desde la toma de muestra. El lugar de venopunción para la obtención de sangre venosa, es preferentemente en la región antecubital (vena cubital interna y la cefálica), ya que se trata de una región anatómica de fácil acceso por tratarse habitualmente de venas superficiales y de un grosor adecuado para la punción. MATERIALES: Lancetas descartables. Torundas de algodón con alcohol yodado. Agujas 20.5 mm Vacuteiner

METODOLOGIA 9

TOMA DE MUESTRA Para las técnicas hematológicas, es fundamental que las muestras de sangre sean tomadas en forma adecuada y precisa, ya que el menor detalle o error puede alterar la totalidad o exactitud del examen. Algunos procedimientos hematológicos como recuento de leucocitos, recuento de reticulocitos, todos estos exámenes requieren solo de una pequeña cantidad de sangre, las cuales son obtenidas de la punción venosa.: PUNCION CAPILAR Se puede recurrir a la punción capilar en caso de que las cantidades de muestra sanguínea a utilizar sea muy pequeña o haya dificultades para practicar una punción venosa. El sitio mas utilizado es el pulpejo del dedo, lóbulo de la oreja o talón del pie en el recién nacido; para ello se utilizan lancetas estériles desechables que tienen un tope para evitar profundizar más de lo aconsejable (2.4 mm en talón y 3.1 mm en el pulpejo del dedo) Utilizamos la zona ungual lateral de la yema de los dedos o del borde del lóbulo de la oreja, o en los niños en la superficie plantar del talón. Presionar longitudinalmente o un masaje suave en la zona para favorecer la vasodilatación, en niños puede ser necesario a veces sumergir el pie en agua caliente. Desinfectamos la zona elegida con una torunda de algodón con alcohol yodado. Ya evaporado este, realizamos la punción con una lanceta desechable. Desechamos las dos primeras gotas de sangre, y las gotas restantes se recolectan en capilares heparinizados o directamente, de acuerdo a la prueba que se va a realizar.

PUNCION VENOSA

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Colocar al paciente en posición cómoda, haciendo que su brazo descanse en una superficie plana. Colocar la ligadura alrededor del brazo del paciente con un nudo que sea corredizo, evitando oprimir muy fuerte. Pedimos al paciente que abra y cierre la palma de la mano enérgicamente, esto con la finalidad de que las venas sobresalgan. Desinfectar la zona elegida de la punción, mientras el paciente mantiene el puño cerrado. Colocar la aguja con el bisel hacia arriba e introducir la aguja en la vena, y esto se introduce de 1 a 1.5 cm. Recolectamos la sangre en frasquitos con anticoagulante o en tubos, según el examen que pida. Obtenida la muestra de sangre necesaria, procedemos a desligar el brazo del paciente. Colocamos un pedazo de algodón con alcohol yodado sobre la aguja sin presionar el brazo del paciente, ya al momento de retirar la aguja del brazo se presiona con el dedo el algodón y se le comunica al paciente que debe permanecer de 3 a 5 minutos con el brazo doblado o en todo caso con el brazo extendido. NOTA.- La sangre que quede en la aguja se utiliza para realizar los extendidos o frotis sanguíneo esto ni bien se termina la extracción sanguínea, esto en caso que haya solicitado la fórmula diferencial de leucocitos o recuento de plaquetas en lámina.

ANTICOAGULANTES: Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para estudiar las características morfológicas y realizar los recuentos celulares. Deben intentar que las células sanguíneas a estudiar se encuentren en el estado más parecido al fisiológico, como cuando se encuentran circulando por el torrente sanguíneo. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfología de los leucocitos, el tamaño eritrocitario, no producir hemólisis e impedir la agregación plaquetaria, posibilitando al mismo tiempo el 11

máximo período de conservación de la muestra (generalmente no más de 24 horas incluso refrigerada a 4° C). Los anticoagulantes más utilizados son: EDTA (C10H16N2O8) o sal disódica, dipotásica o tripotásica del ácido etilendiaminotetraacético, actuando mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca++), impidiendo el proceso de la coagulación al fijarlo. Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la realización de recuentos celulares, sobretodo en los autoanalizadores y permite además la realización del hematocrito y del frotis sanguíneo hasta dos horas después de la extracción de la muestra al mismo tiempo que impide la aglutinación de las plaquetas. Las sales de potasio tienen la ventaja con respecto a la de sodio, por ser más fácilmente solubles en sangre cuando las usamos a partir del producto sólido, sin embargo , las tres sales afectan el tamaño del eritrocito, especialmente después del almacenamiento de la sangre anticoagulada por espacio de algunas horas. El International Council for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotásica como anticoagulante para recolectar muestras sanguíneas destinadas al recuento y caracterización del tamaño celular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren para la calibración de los contadores automáticos. El K2EDTA .2H2O posee un peso molecular relativo de 404,1g; 1g quela 100 mg de calcio iónico y el pH para una solución al 1% es de 4.8+/-1,0. La cantidad de EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de 1.5-2.2 mg/ml. de sangre total. Esta cantidad es un compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulación y la cantidad a la cual se producen las alteraciones celulares. HEPARINA SÓDICA. HEPARINA DE LITIO, es un anticoagulante fisiológico que actúa impidiendo que la protrombina se transforme en trombina. Estructuralmente es un mucopolisacárido ácido. Los frotis realizados con muestras sanguíneas anticoaguladas con heparina producen en las tinciones panópticas un color azulado y una pseudovacuolización celular por lo tanto no se lo recomienda para tal fin. La proporción adecuada es de 15-20 UI (0.1-0.2 mg) de heparina por ml de sangre. CITRATO TRISÓDICO, C6H5O7Na3, actúa impidiendo que el calcio se ionice, evitando así la coagulación. Se utiliza para realizar las pruebas de Hemostasia en una proporción sangre: anticoagulante 9:1; así como para la velocidad de eritrosedimentación en una proporción sangre: anticoagulante 4:1. El citrato sódico se utiliza a una concentración de 0.106 mol/l (31,3 g/L de C6H5O7Na3.2H2O). ACD se emplea fundamentalmente en Bancos de Sangre para conservar las unidades de sangre y estudios metabólicos eritrocitarios por permitir una buena conservación de los hematíes. Se utiliza en una proporción de un volumen de ACD por cada cuatro volúmenes de sangre. La proporción de la mezcla del anticoagulante es de: Acido Cítrico 0.9 g, Citrato disódico 2 g, Dextrosa 2 g, H2O destilada 120 ml.

CUESTIONARIO

Cual es la concentración de citrato de sodio que se utiliza como anticoagulante

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Cual es la concentración de EDTA que se utiliza como anticoagulante

Cual es la concentración de heparina que se utiliza como anticoagulante

Mecanismo anticoagulante de la heparina

Que es el anticoagulante Wintrobe

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PRACTICA 2 EXTENSIONES SANGUINEAS. INTRODUCCION Una extensión o frotis sanguíneo consiste en recubrir parcialmente un porta con una gota de sangre, de tal manera que las células de ésta se dispongan formando una sola capa de ellas. Esto puede hacerse manual o automáticamente. Lo último se realiza con aparato (Spinner) que centrifuga rápidamente el porta con la sangre depositada en su centro. Con este aparato se obtienen unos frotís que presentan una distribución celular muy homogénea. PARTES DE UNA EXTENSIÓN: Cabeza: Es la zona inicial de la extensión Es la región más gruesa En ella se encuentra una mayor proporción de linfocitos, y los hematíes forman aglomerados (Rouleaux) Cuerpo: Es la zona media del frotís Su espesor es el apropiado En ella existe una adecuada proporción entre los distintos tipos de leucocitos Contiene la “zona ideal” de observación, que corresponde a la porción que limita con la cola Cola: Es la zona final de la extensión Suele tener un aspecto redondeado Es la región más fina En ella se encuentra una mayor proporción de leucocitos grandes (granulocitos y monocitos), y además, los hematíes están deformados y presentan una tonalidad uniforme. En su porción Terminal suelen ser más abundantes las plaquetas, sobre todo si son grandes. Bordes: Contienen una mayor proporción de leucocitos grandes 14

Si están deshinchados, en ellos las células son difíciles de reconocer por estar deformadas o destruidas.

CARACTERISTICAS DE UNA BUENA EXTENSION La cabeza ha de estar cerca de uno de los extremos del porta La cola debe estar cercana al otro extremo del porta, pero sin llegar a él El borde de la cola tiene que estar finamente deshilachado. Toda extensión ha de ser fina y homogénea Los bordes laterales de la extensión deben estar separados de los bordes del porta por 1 mm aproximadamente.

DEFECTOS DE LA EXTENSION Excesiva longitud y escaso grosor o escasa longitud y excesivo grosor. Esto se debe a un inadecuado tamaño de la gota de sangre y/o a un error en la velocidad y/o en un fallo en el ángulo de extensión de la misma. Presencia de escalones o estrías. Esto está ocasionado por una falta de uniformidad en el deslizamiento de la gota. Existencia de abundantes zonas redondeadas que carecen de sangre. Esto se produce por la presencia de restos de grasa o de suciedad en el porta. Extremo final excesivamente dentado.

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MATERIAL Lanceta de aplicación manual o automática Algodón Capilar no heparinizado Porta objetos limpios libres de grasa Porta esmerilado Guantes desechables Plumón indeleble TECNICA: Con los dedos índice y pulgar de una mano, sujetar un extremo del porta normal, a nivel de sus bordes, y situarlo sobre una mesa. Con un capilar cargado mediante capilaridad de sangre problema, depositar una pequeña gota de ésta (5 uL) en la cara superior de ese porta, a no menos de 2 cm del extremo opuesto al que agarra la mano.

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Colocar un extremo del porta esmerilado un poco por delante de la gota de sangre y formando un ángulo de 45º con el porta objetos. Desplazar suavemente hacia atrás el porta extensor, hasta que alcance la gota de sangre. Dejar que la gota se extienda, por capilaridad, a lo largo del extremo del porta extensor que toca el porta soporte. Antes que la sangre alcance los bordes de ese extremo, deslizar el porta extensor hacia delante, con un movimiento firme y uniforme, y a una velocidad media. Secar rápidamente la extensión, agitándola al aire, para que sus células no se distorsionen.

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EVALUACION MICROSCOPICA:........................................................................

DIAGNÓSTICO:.................................................................................................................... ............................................................................................................................................. EVALUACION MICROSCOPICA:........................................................................

DIAGNOSTICO:.................................................................................................................... ..............................................................................................................................................

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CUESTIONARIO

Cual es la región más fina de una extensión sanguínea

Que leucocitos se observan en una mayor proporción en la cabeza de un frotís sanguíneo.

A que se debe la presencia de estrías en una extensión sanguínea

Que volumen ha de tener la gota de sangre utilizada para realizar un frotis sanguíneo.

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PRACTICA 3 RESISTENCIA OSMÓTICA DE ERITROCITOS INTRODUCCION. La vida celular depende de un continuo intercambio con el medio externo, ya que la célula debe tomar de este los nutrientes y expulsar hacia él los productos de su metabolismo. El intercambio se establece a través de la membrana celular, la cual se comporta como una estructura semipermeable que permite el paso de determinadas sustancias e impide el de otras. La membrana está constituida por una bicapa de moléculas lipídicas anfipáticas, orientadas de forma tal que sus grupos polares quedan expuestos hacia las interfases interna y externa, mientras los grupos apolares se disponen hacia el interior, alejados del agua. La bicapa lipídica se ve interrumpida en determinados puntos por la presencia de moléculas proteicas. De acuerdo con la estructura molecular de las sustancias que atraviesan la membrana, el paso se efectúa a través de la parte lipídica o de la proteica. Las sustancias apolares se solubilizan en los lípidos de la membrana y la atraviesan fácilmente; las sustancias polares pequeñas atraviesan los polos proteicos. En ambos casos la sustancia se mueve siguiendo su potencial químico y el mecanismo se conoce como permeabilidad simple. Las sustancias polares, cuyo diámetro molecular sobrepasa el diámetro máximo de los poros, requieren de un mecanismo especial de paso a través de la membrana, en el cual están involucradas las proteínas de membrana; este mecanismo se conoce como transporte mediado o facilitado. Uno de los aspectos fundamentales de la Fisiología, es el mantenimiento correcto de la composición de los líquidos corporales con un adecuado balance entre el LIC y LEC. Ello amerita revisar antes, los conceptos de osmosis, presión osmótica y osmolaridad. OSMOSIS Se define como osmosis el flujo de agua a través de membrana semipermeable desde un compartimiento en el que la concentración es baja hacia otro en el que dicha concentración es mayor. Se define como membrana semipermeable aquella que es permeable al agua e impermeable a los solutos. La ósmosis se produce porque la presencia de solutos reduce el potencial químico del agua, que tiende entonces a fluir desde las zonas donde su potencial químico es mayor hacia las de menor potencial. Otros efectos causados por la disminución del potencial químico del agua (debido a la presencia de solutos) incluyen una menor presión de vapor, descenso del punto de congelación y elevación del punto de ebullición de la solución, en comparación con el agua pura. Dado que estas 21

propiedades, al igual que la presión osmótica, dependen de la concentración presente del soluto, más que de sus características químicas, reciben el nombre de propiedades coligativas.

PRESIÓN OSMÓTICA Una membrana semipermeable separa agua pura (B) de una solución (A). El agua fluye de B hacia A por ósmosis porque la presencia de soluto en el lado A reduce el potencial químico del agua en la solución. Al empujar el pistón en la solución del lado A se incrementa el potencial químico del agua de esta solución, lo que hace que disminuya la velocidad neta de ósmosis. Si la fuerza aplicada sobre el pistón se incrementa gradualmente, acaba por alcanzarse una presión a la que el flujo de agua se detiene. Si se aplica una presión aun mayor, el agua comienza a fluir en sentido contrario, de A a B. La presión que, aplicada en el lado A, resulta ser justamente suficiente para evitar el flujo de agua recibe el nombre de presión osmótica de la solución del lado A. La presión osmótica de una solución depende del número de partículas en solución, lo que significa que ha de tenerse en cuenta el grado de ionización del soluto. Las ecuaciones referentes a la presión osmótica y otras propiedades coligativas fueron definidas por Van`t Hoff.. Una forma de la ley de Van`t Hoff. Para el cálculo de la presión osmótica es: P.O.  R.T .i.M

donde: P.O. = Presión osmótica R = 0.08206 L-Atm/mol k, la constante ideal de los gases T = 310 k, la temperatura absoluta a 37 oC i = Número de iones resultantes de la disociación de una molécula de soluto M = Concentración molar de soluto (moles de soluto por litro de solución) Esta ecuación no predice con exactitud las presiones osmóticas de las soluciones reales. De hecho, a las concentraciones que numerosas sustancias presentan en el citoplasma y en el líquido extracelular, las desviaciones de las condiciones ideales pueden ser considerables. Un modo de corregir las discrepancias existentes entre las soluciones reales y las predicciones de la ley de Van`t Of. Consiste en introducir un factor de corrección llamado coeficiente osmótico. Con la inclusión del coeficiente osmótico la ecuación de Van`t Hoff se convierte en: P.O.= RTiM, donde el término ( iM puede considerarse como la concentración osmótica eficaz y, frecuentemente, se denomina concentración osmótica real, que se expresa en osmoles por litro. CALCULO DE LA OSMOLARIDAD DEL PLASMA SANGUÍNEO 22

La osmolaridad plasmática se puede calcular mediante la siguiente fórmula, a partir de los solutos predominantes: Osmolaridad = 2 Na+ + Glucosa /18 + BUN /2.8 (mosmoles/L) (meq/L) (mg/dl)

(mg/dl)

Y a concentraciones normales tendremos: Osmolaridad = 2 x 140 + 90/18 + 14/2.8 = 290 mosmoles/L, que es el valor de la osmolaridad plasmática total. Este valor puede corregido a una osmolaridad efectiva de 285 mosmoles/L, debido a que los miliosmoles de urea son osmóticamente inefectivos. Con este valor puede calcularse la presión osmótica del plasma mediante la ecuación de Van`t Hoff o utilizando el factor 19.334 que es la presión osmótica, en mm de Hg, producida por 1 miliosmol a 37 oC. TURGENCIA Y RETRACCIÓN OSMÓTICA DE LAS CÉLULAS Las membranas plasmáticas de la mayor parte de las células del organismo son relativamente impermeables a muchos de los solutos del líquido intersticial, pero muy permeables al agua. Por lo tanto, si la presión osmótica del líquido intersticial aumenta (es decir, se vuelve hiperosmótico), el agua escapa de las células por ósmosis, y la célula se encoge (se contrae). De este modo, los solutos intracelulares se concentran progresivamente hasta que la presión osmótica eficaz del citoplasma vuelve a igualar la del líquido intersticial (es decir, se vuelven isosmóticos). A la inversa, si la presión osmótica del líquido intersticial disminuye (es decir, se vuelve hiposmótico), el agua pasa hacia el interior de la célula, que sigue hinchándose hasta que las presiones intra y extracelular se igualan. Los eritrocitos se emplean frecuentemente para ilustrar las propiedades osmóticas de las células, porque son fáciles de obtener y de estudiar. Dentro de un determinado intervalo de concentraciones externas, los eritrocitos se comportan como un osmómetro, puesto que su volumen se relaciona inversamente con la concentración de solutos en el espacio extracelular. A una concentración de NaCl 0.154 M (0.308 Osmolar), el volumen de los eritrocitos es el mismo que en el plasma, por lo que se dice que esta concentración de NaCl es isotónica respecto a estas células. Concentraciones superiores a 154 mM son hipertónicas (y hacen que la célula se contraiga), mientras que las inferiores a 154 mM son hipotónicas (y hacen que la célula se hinche). Cuando los eritrocitos se hinchan hasta 1.4 veces su tamaño original, algunos de ellos lisan (estallan). A partir de este volumen, las propiedades de la membrana celular se modifican abruptamente: la hemoglobina escapa de la célula y la membrana se hace transitoriamente permeable también a otras moléculas de gran tamaño. Entre las sustancias intracelulares que originan en el interior del eritrocito una presión osmótica que equilibra exactamente la presión osmótica del liquido extracelular, se cuentan la hemoglobina, el K+, los fosfatos orgánicos (como el ATP y el 2,3-difosfoglicerato), y los intermediarios glucolíticos. Independientemente de la naturaleza química de su contenido, el eritrocito se comporta como si estuviera lleno de una solución de moléculas para las que la 23

membrana no es permeable con una concentración osmótica eficaz de 286 miliosmolar (0.93 x 2 x 0.154 M = 0.286 M) y una presión osmótica de 7.2758 atm o 5.530 mm de Hg. MATERIAL. Reactivos: CLNa 0,17 M Urea 0,3 M Cl Na 0.34 M Cl Na 0.085 M Urea 1.72 % EQUIPO:

Sacarosa 0,3 M Glicerol 0,3 M

Centrífuga Centrífuga de microhematocrito Fotocolorímetro Baño María Microscopio MATERIAL BIOLÓGICO: Sangre heparinizada

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METODOLOGIA. DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE FRAGILIDAD EN ERITROCITOS: T1

T2

T3

T4

T5

T6

T7

T8

T9

T10

T11

ClNa 0.17 M

5.0

4.5

4.0 3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

AGUA (ml)

0.0

0.5

1.0 1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

2

2

2

2

2

2

2

2

2

SANGRE (g)

2

2

- Centrifugar por 5 min. a 4,000 R.P.M. - Medir la densidad óptica a 540 nm. (filtro verde). RESULTADOS. Construya en papel milimetrado la curva de fragilidad de los eritrocitos, considerando los valores de densidad óptica (eje vertical) obtenidos frente a la osmolaridad (eje horizontal). Pegar en la cuadricula.

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RESULTADOS T1

T2

T3

T4

% HEMOLISIS MMOLARIDAD (M) OSMOLARIDAD (mOs/l) PRESION OSMÓTICA (mm HG) OBSERVACION DIAGNOSTICO

26

T5

T6

T7

T8

T9

T10

T11

PRACTICA 4 HEMATOCRITO VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR 1.0 INTRODUCCIÓN. ERITROPOYESIS NORMOBLASTICA Pronormoblasto. Esta es la primera célula reconocible como perteneciente francamente a la célula eritroide. Mide unos 12 a 20 m de diámetro y se distingue del mieloblasto por su citoplasma muy azul, que suele ser solo una estrecha orilla en torno del núcleo relativamente grande; muchas veces se tiñe en forma despareja y puede presentar un halo perinuclear. El núcleo consiste en una red de riendas de cromatina distribuidas con uniformidad, que le imparten un aspecto finamente reticular. Se tiñe de un color púrpura rojizo y contiene varios nucléolos más oscuros. Normoblasto inicial. Existe una gran semejanza entre esta célula, que mide 8 a 14 m de diámetro, el citoplasma presenta una reacción tintorial policromàtica, es decir, tendencia a tomar los colorantes básicos y ácidos, de modo que le imparte un tinte purpúreo que se torna más acidófilo a medida que la célula madura porque empieza a aparecer hemoglobina. El núcleo ocupa una parte relativamente más pequeña del total y disminuye de tamaño a medida que la célula envejece; ahora se tiñe intensamente y la cromatina está dispuesta en grumos. Normoblasto tardío. El citoplasma de esta célula, aunque es acidofilo, puede exhibir un ligero tinte policromático. El diámetro de esta célula varía entre 8 y 10 m. El núcleo es pequeño y todavía puede presentar una cromatina aglomerada muy gruesa que desaparece a medida que el núcleo se achica, y eventualmente queda como una masa negra azulada homogénea sin estructura. Al madurar la célula el núcleo suele ser excéntrico, en ocasiones lobulillar y finalmente desaparece por extrusión, fragmentación o disolución. Reticulocito. Este es un eritrocito joven que todavía contiene un fino retículo basófilo que se demuestra con tinciones supravitales como azul de cresilo brillante. Coloreadas con cualquiera de los métodos de Romanowsky, estas células exhiben una basofila pálida difusa. El contenido de reticulocitos de la sangre normal es 0.92 a 2%. Esta célula es plana y disciforme y a medida que pierde su retículo basófilo se convierte en un glóbulo rojo maduro o eritrocito. Eritrocito. Esta es una célula bicóncava que exhibe una moderada variación de tamaño, desde 6,7 hasta 7,7 m con un promedio de 7,2 m, y se deforma con facilidad por causa de su flexibilidad; de ahí las variaciones de forma que se observan en los frotas de sangre coloreados. Despliega reacción eosinófila al colorearlo con los métodos de Romanowsky, de modo que la tinción es más intensa en la periferia y disminuye gradualmente hacia el centro por causa de la biconcavidad de la célula. El área central pálida suele conocerse

28 como área de palidez central y ocupa menos de la tercera parte del diámetro del eritrocito normal, pero esto puede variar de acuerdo con la técnica tintorial. Se dice que las células que tienen un contenido de hemoglobina normal son normocrómicas.

ERITROPOYESIS MEGALOBLÁSTICA En la médula ósea normal no existen megaloblastos. Su ocurrencia se debe a una perturbación del crecimiento y maduración celular causada por deficiencia de vitamina B12 y/o ácido fólico. La maduración de la serie megablástica es similar a la de la serie normoblástica, pero existen diferencias morfológicas en cada etapa. Gran cantidad de veces la eritropoyesis mehaloblástica se acompaña de anormalidades en el desarrollo de las series mieloide y megacariocítica. También ocurre un moderado aumento en la cantidad de hemohistioblastos y hemocitoblastos. La célula inicial de esta serie, en transición desde el hemocitoblasto es el promegaloblasto, y la maduración se cumple a través del megaloblasto inicial, intermedio y tardío hasta el macrocito. Las diferencias morfológicas respecto de la serie normoblástica afectan el tamaño celular y el aspecto del núcleo. El tamaño de la célula es mayor y el citoplasma es más abundante en comparación con los normoblastos en etapas de maduración equivalentes: 1. Promegaloblastos

20 a 30 m

2. Megaloblasto inicial

18 a 25 m

28

29 3. Megaloblasto intermedio

16 a 20 m

4. Megaloblasto tardío

12 a 15 m 9 a 12 m

5. Macrocito

El núcleo es más grande en comparación con el del normoblasto en todas las etapas del desarrollo. La cromatina tiene una trama más abierta, y está dispuesta en una forma reticular fina, impartiendo al núcleo un aspecto punteado. Muchas veces esto es muy bien pronunciado, en la etapa intermedia y todavía puede observarse en el megablasto. A medida que la célula madura, la aglomeración de la cromatina es mucho menos obvia que en los normoablastos de las etapas respectivas. La maduración nuclear se atrasa respecto de la hemoglobinización citoplasmática, de modo que los megaloblastos con citoplasma eosinófilo todavía pueden contener núcleos con cromatina finamente reticular. En las etapas tardías puede haber uno o más cuerpos de Howell-Jolly. Los promegaloblastos y los megaloblastos iniciales pueden representar el 50% de la serie eritroide en la médula ósea de la anemia megaloblástica severa.

MATERIAL 

Muestra de sangre: capilar o venosa.



Tubos capilares, los heparinizados para sangre capilar o sin anticoagulante, y los no heparinizados para muestras con anticoagulante.



Plastilina.



Microcentrífuga.



Abaco de lectura.de microhematocrito

DETERMINACION DEL HEMATOCRITO. El hematocrito (Hto) es la relación existente entre el volumen de eritrocitos y el volumen total de sangre, expresado como porcentaje. Está directamente relacionado con la concentración de hemoglobina, por lo que su determinación constituye el procedimiento más simple para el diagnóstico de anemia. Así, un descenso del Hto es indicativo de anemia, mientras que el aumento lo es de poliglobulia. El método de referencia para la determinación del Hto es la centrifugación de sangre total en tubo capilar (micrométodo), es una técnica sencilla, barata y accesible a laboratorios de baja complejidad. Aunque también puede emplearse un tubo de Wintrobe (macrométodo), este procedimiento no es tan recomendable debido a su mayor inexactitud e imprecisión. Ambos métodos se basan en medir el empaquetamiento de la columna de eritrocitos cuando la sangre total con anticoagulante se somete a la acción de una fuerza centrífuga. Por ello, entre sus factores de error está el plasma que queda

29

30 atrapado entre los eritrocitos empaquetados y el posible efecto de leucocitos y plaquetas en la lectura. En la actualidad, todos los autoanalizadores hematológicos suministran, dentro del contexto del hemograma automatizado, un valor de Hto que resulta de un cálculo electrónico a partir del Volumen Corpuscular Medio (obtenido por conductividad o campo oscuro) y la concentración de eritrocitos. Obviamente este valor obtenido electrónicamente difiere del obtenido por centrifugación en que no considera el efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el efecto de las restantes células sanguíneas, por lo que es siempre algo inferior (0,2-0,3 %). Tanto el Hto. obtenido por microcentrifugación o por métodos automatizados, son un buen parámetro del estado de la serie eritroide. El Hto refleja la concentración y no la masa total de glóbulos rojos. Por ej., un paciente en estado de shock acompañado de hemoconcentración, el Hto. puede ser normal o alto, aún cuando la masa eritrocitaria total disminuye por la pérdida de sangre. Por lo tanto no es confiable como indicador de anemia poco después de una hemorragia o una transfusión. TECNICA DEL MICROHEMATOCRITO. FUNDAMENTO.- La determinación del microhematocrito se fundamenta en el uso de tubos capilares de 7 cm. de largo por 1 mm. de diámetro interior, los cuales pueden ser heparinizados o no heparinizados, de acuerdo a la muestra que se vaya a utilizar. (sangre con anticoagulante o sangre sin anticoagulante). Esta técnica es rápida y consiste en separar los eritrocitos del plasma por centrifugación, obteniéndose hematíes aglomerados, los cuales son medidos en micro escalas o con una regla milimetrada.(VER ANEXO 1)

PROCEDIMIENTO:

30

31 -

Llenar el tubo capilar (heparinizada o no) con la muestra de sangre (capilar o venosa) hasta las 3/4 partes de las extensión total del capilar, y el llenado se hará por capilaridad.

-

Una vez lleno el capilar, sellar uno de los extremos del capilar con plastilina, esto con la finalidad de que al momento de la centrifugación no salga la sangre por cualquiera de los extremos.

-

Colocar el capilar en una microcentrífuga a una velocidad de 10,000 r.p.m. por 5 minutos, o a 5,000 r.p.m. por 10 minutos.

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ABACO DE HEMATOCRITO

LECTURA Se coloca el capilar centrifugado sobre la escala para microhematocrito que acompaña a la microcentrífuga, haciendo que la base de la columna de eritrocitos (sobre el límite superior de la plastilina) coincida con la línea inferior de la cartilla, y de manera similar que el tope de la columna de plasma coincida con la línea superior, es decir que el fondo de la columna de eritrocitos y el tope superior de la columna de plasma coincida al mismo tiempo con las líneas inferior y superior de la cartilla. La lectura entonces se realiza tomando como valor de la lectura el tope superior de la columna de eritrocitos. VALORES NORMALES: Varones: 40 - 50 % ( en altura 45 - 53 % ) Mujeres: 38 - 45 % ( en altura 42 - 50 % ) INTERPRETACION La prueba del Hematocrito constituye una prueba simple para el diagnóstico de anemia, es mucho más útil y de confianza que el recuento de eritrocitos. En general el valor del Hematocrito baja en caso de hemodilución (hidremia fisiológica del embarazo) En todos los casos o tipos de anemia y hemorragias, etc. y al contrario la hemoconcentración a consecuencia de shock da cifras normales o elevadas aparentemente patológicas. CAUSAS DE ERROR    

Las fugas de muestra al no quedar bien sellado los capilares producen una disminución en el valor, al perderse mayor proporción de células que de plasma. El uso de anticoagulantes líquidos provoca un error por dilución de la muestra En muestras capilares no descartar la primer gota, produce una mezcla con los líquidos tisulares que provoca hemodilución. En muestras de sangre venosa, el lazo colocado durante un cierto tiempo produce hemoconcentración.

La lectura no inmediata de los capilares, provoca que el sedimento de hematíes vaya tomando forma de bisel si el capilar permanece en posición horizontal.

VELOCIDAD DE SEDIMENTACION GLOBULAR. El test de velocidad de sedimentación globular (VSG) mide la sedimentación de eritrocitos en su plasma nativo. VSG es un test no específico que puede ser utilizado para detectar un amplio rango de enfermedades y para monitorear el curso evolutivo de ciertas enfermedades crónicas como los procesos inflamatorios crónicos (artritis reumatoidea, polimialgia reumática y tuberculosis) o la respuesta a la terapia, por ejemplo con citostáticos (enfermedad de Hodgkin, linfomas y mieloma múltiple). Sin embargo en ocasiones cuadros tan graves

34 como neoplasias y la cirrosis pueden presentar una VSG normal. Constituye uno de los tests más utilizados como screening en el laboratorio clínico. Se trata de un método sencillo para realizar y que requiere equipamiento simple. MECANISMO El mecanismo por el cual se produce la eritrosedimentación no está completamente dilucidado, pero parece obedecer a interacciones electrostáticas entre la superficie de los GR y diversas proteínas del plasma que favorecen (fibrinógeno y globulinas) o disminuyen (albúmina) la agregabilidad de estas células.

Desde el punto de vista físico, este fenómeno depende de los siguientes factores: a. b. c. d.

Tamaño de los G Diferencia de densidad entre los eritrocitos y el plasma, Viscosidad del plasma. Temperatura.

Estos factores se hallan relacionados entre sí a través de la ley de Stokes si se considera al GR como una esfera suspendida en un medio infinito (relación entre la resistencia R que encuentra una partícula esférica de radio r al desplazarse en el seno de un fluido de viscosidad  a una velocidad v: R = 6vr La sedimentación ocurre en 3 etapas: 1) una etapa en que se produce la aglutinación de los GR con formación de agregados en forma de "pilas de monedas", 2) un período durante el cual los agregados de GR sedimentan a velocidad constante, y 3) una etapa final donde la velocidad de sedimentación se enlentece al mismo tiempo que los GR se acumulan en el fondo del recipiente. La etapa más importante es la primera o de aglutinación, ya que de ella dependerá la velocidad de todo el proceso. Así, cuanto más pequeños sean los agregados, más lentamente se producirá la sedimentación y viceversa. Dado que, como se mencionó más arriba, el test también está influenciado por la forma y el tamaño de los GR, éste resulta poco confiable como un índice de enfermedad en la anemia falciforme o cuando hay una marcada poiquilocitosis. La velocidad de sedimentación se incrementa por las altas concentraciones de fibrinógeno y otras proteínas de fase aguda e inmunoglobulinas. La albúmina retarda la VSG. El mecanismo por el cual el fibrinógeno y las globulinas facilitan la aglutinación de GR no se conoce fehacientemente aunque se cree que actúan disminuyendo la fuerza de repulsión que normalmente existe entre GR debido a su carga superficial o potencial zeta. El potencial zeta es producido por una intensa carga negativa a nivel de la superficie de los GR, lo que explica que estas células se mantengan separadas. La intensidad del potencial zeta depende en gran medida de la composición proteica del plasma y 34

35 especialmente de la relación entre las concentraciones de albúmina, globulinas y fibrinógeno. Así, mientras la albúmina tiende a aumentar el potencial zeta, las globulinas y sobre todo el fibrinógeno tienden a disminuirlo. Ello obedece a que tanto el fibrinógeno como las globulinas tienen un mayor peso molecular y una conformación menos esférica que la albúmina, lo que aumenta la constante dieléctrica del plasma y reduce el potencial zeta eritrocitario. La disminución del potencial zeta de los GR tiene como consecuencia una mayor tendencia de éstos a agregarse y formar las llamadas “pilas de moneda”. De acuerdo con este mecanismo, el valor normal de la VSG resulta del equilibrio entre las principales proteínas plasmáticas. METODO DE WESTERGREEN. FUNDAMENTO.- Se basa en la utilización del tubo pipeta de Westergreen que es una pipeta de vidrio de 2 mm. de diámetro interno, de 30 cm. de longitud que viene calibrada de 0 a 200 mm., de arriba hacia abajo, para ello se utiliza sangre con anticoagulante. MATERIALES: -

Pipeta de Westergreen.

-

Gradilla para tubos de Westergreen.

-

Plastilina.

-

Sangre venosa con anticoagulante.

-

Cronómetro.

-

Sangre con citrato de sodio 3.8 % o EDTA.

PROCEDIMIENTO: -

Aspirar con la pipeta de Westergreen la muestra de sangre hasta la marca de cero. (0).

-

Cerrar el extremo inferior con plastilina y colocar en posición vertical durante 1 y 2 horas respectivamente, tiempos en los que se realizarán las lecturas respectivas.

LECTURA Pasada la primera hora, leer de inmediato la cantidad de mm.(mililitros) que a descendido en el tubo de eritrocitos. Es decir medimos la columna de plasma por encima del nivel de los eritrocitos sedimentados. Se realiza el mismo procedimiento a las dos horas. INTERPRETACION. Las variaciones de los valores normales de velocidad de sedimentación globular indican mas que un trastorno funcional una lesión orgánica. La sedimentación globular se encuentra aumentada en el embarazo, menstruación, reumatismo articular, neumonía, gripe, angina, infarto al miocardio, neoplasia y en la artritis reumatoide. En el periodo agudo de la fiebre reumática, en la tuberculosis pulmonar en donde adquiere valor 35

36 pronóstico, por estar relacionada con la velocidad de sedimentación, que se frena o acelera según los periodos de actividad evolutiva. La V.S.G. esta disminuida en la poliglobulia del recién nacido, en la poliglobulia del adulto, en enfermedades del corazón con estasis circulatoria y en la tos ferina. En las anemias aumenta la VSG debido a que un número pequeño de eritrocitos, englobado en un gran volumen de plasma, sedimenta con mayor facilidad. Sin embargo en las poliglobulias disminuye la VSG debido a que se incrementan las fuerzas de fricción existentes entre los eritrocitos. En la macrocitosis asciende la VSG debido al mayor peso y la menor área superficial relativa de los eritrocitos. Por situaciones opuestas, en la microcitosis desciende la VSG. VALORES NORMALES:

Niños mayores y jóvenes Hombres adultos

Mujeres adultas

EDAD (años)

X + 2 DE

0-15

5 + 10

Límite superior de la normalidad 15

17-50 51-60 61-70 17-50 51-60 61-70

4+3 6+3 6+4 6+3 9+5 10 + 5

10 12 14 12 19 20

FACTORES TÉCNICOS CAPACES DE MODIFICAR LA VSG Causas de aumento       

Desviación de verticalidad de la pipeta Incremento de la longitud y el diámetro de la pipeta Elevación de la temperatura ambiente Dilución de la sangre Causas de disminución: Reducción del diámetro de la pipeta Utilización tardía de la sangre

36

37  TABLA DE RESULTADOS NOMBRE

EDAD

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

37

HT

VSG

DX

38

CUESTIONARIO

1. A que denomina una poliglobulia relativa

2. Que un síndrome mieloproliferativo

3. Cuales son los criterios de diagnóstico de policitemia vera

4. En que circunstancia desciende la velocidad de sedimento globular

5. En que circunstancia aumenta la velocidad de sedimento globular

38

39

PRACTICA 5 RECUENTO DE ERITROCITOS Y RETICULOCITOS

RECUENTO DE ERITROCITOS Viene a ser la determinación del número de ERITROCITOS milímetro cúbico o por litro de sangre. RECUENTO DE ERITROCITOS EN CAMARA DE NEUBAWER. FUNDAMENTO.- Se fundamenta en el uso de la pipeta de Thoma para glóbulos rojos, la cual viene calibrada para diluir la muestra de sangre en dilución de 1 en 200 o 1 en 20, para ello se utiliza con mayor frecuencia como solución diluyente la solución Hayen que tiene la propiedad de lisar a los leucocitos. Permitiendo una mayor visibilidad de los eritrocitos.

39

40 MATERIALES E INSTRUMENTOS. -

Solución Hayen

-

Pipetas de Thoma para glóbulos rojos, con su respectiva sonda de absorción.

-

Cámara de Neubawer, con su respectivo cubre cámara.

-

Microscopio.

-

Rotor para pipetas.

-

Contador manual.

PROCEDIMIENTO.

-

Obtenga sangre por punción digital hasta la marca de 0.5 en la pipeta para dilución de eritrocitos (cuenta roja, bulbo mayor, 101 en el extremo superior).

-

Aspire el líquido para dilución de eritrocitos (solución Hayem) hasta la marca de 101. Se gira la punta sobre su eje longitudinal para asegurar una mezcla total entre la sangre y el diluyente.

-

Ahora descarte tres o cuatro primeras gotas de sangre diluida y con cuidado se llena la cámara por capilaridad colocando la punta de la pipeta en uno de los extremos del cubreobjetos.

-

Cuente las células que se encuentren en los cuadrados marcados A, B, C, D, E (véase diagrama - Anexo).

-

Para calcular el número total de eritrocitos se aplica:

40

41 -

R.E 

ERITROCITOS (5) DILUCION * ALTURA * AREA

R.E 

ERITROCITOS (5) 1 / 200 *1 / 10 *1 / 5

R.E 

ERITROCITOS (5) 1 / 10000

41

42 VALORES NORMALES: 4,0-5,6 x 106/ul

Neonatos de término, sangre del cordón Niños de 1 año

4,5 x 106/ul

Niños de 10 años

4,7 x 106/ul

Hombres

4,5-6,5 x 106/ul

Mujeres

4.0 -5,6 x 106/ul

INTERPRETACION: El aumento del recuento eritrocitario se denomina policitemia. La policitemia puede ser secundaria (eritrocitosis) o primaria (eritremia, policitemia vera). La policitemia secundaria se debe a varios factores que no cambian la masa hemática, por ejemplo deshidratación o anoxia. Una forma fisiológica de eritrocitos se presenta en el recién nacido. La policitemia vera es poco frecuente, la pancitosis idiopática da lugar a un progresivo aumento de la masa de hematíes. La disminución provoca anemia. La anemia también puede ser primaria o secundaria. La secundaria se presenta después de una dilución de la sangre por un aumento del volumen del plasma, como es el caso en las embarazadas, mientras que la anemia primaria se debe a una disminución de la masa de hematíes. RETICULOCITOS Los reticulocitos, eritrocitos inmaduros, existen en la sangre en una proporción de cinco a diez por mil hematíes. Su tamaño es el de los demás hematíes y se caracteriza por contener una pequeña cantidad de ARN (ribosomas) formando un retículo granulofilamentoso observable al ser teñido con colorantes llamados vitales como son el azul brillante de cresilo o el azul de metileno nuevo. La cantidad de ARN es tanto menor cuanto más madura es la célula. El recuento de reticulocitos es la técnica más simple actualmente disponible para valorar la actividad eritropoyética de la médula ósea. Cuando una anemia se acompaña de un elevado número de reticulocitos circulantes (reticulocitosis) se considera regenerativa, mientras que cuando el número es normal o disminuido se denomina arregenerativa. En condiciones normales, los reticulocitos permanecen en la médula durante 2-3 días y terminan su maduración en 24 horas, aproximadamente, una vez ya en la sangre periférica. El recuento de reticulocitos debe realizarse a partir de sangre total con anticoagulante (EDTA)y a ser posible, dentro de las 24 primeras horas de la extracción cuando la sangre se conserva a temperatura ambiente. Si se mantiene a 4º C, el recuento puede realizarse hasta 48 horas después de la extracción. El recuento puede efectuarse por dos procedimientos: 1. Tinción vital y microscopio óptico.

42

43 2. Citometría de flujo. El método manual adolece de muy escasa fiabilidad (coeficientes de variación >20%), lo que limita su empleo para valorar la capacidad de respuesta medular frente a terapéuticas agresivas, pero sobretodo a los errores de índole subjetiva debidos al diferente criterio que cada observador tiene de lo que es un reticulocito. MÉTODO DE LA TINCIÓN VITAL (MÉTODO DE REFERENCIA) Este método usa como colorante el azul de metileno nuevo: 1 g cada 100 ml de solución citratada (1 vol de citrato de sodio 30 g/L y 4 vol de ClNa 9 g/L). Mediante una pipeta Pasteur se añaden a un tubo de hemólisis tres gotas de solución colorante y tres gotas de sangre total bien homogeneizada. En caso de valores muy bajos de hematocrito debe colocarse doble cantidad de sangre total que de solución colorante. La suspensión sangre/colorante se agita suavemente y se deja a temperatura ambiente durante cinco minutos. Transcurrido este tiempo, se toma una pequeña gota de la suspensión y se extiende sobre un portaobjetos., una vez seca se puede observar al microscopio con objetivo de inmersión (x1000). Es necesario realizar el recuento sobre un mínimo de 1000 eritrocitos. El recuento se efectúa contando en donde los eritrocitos estén distribuidos homogéneamente. Se cuentan tantos campos como sean necesarios para alcanzar la cifra de eritrocitos requerida, siendo 100-125 el número óptimo de hematíes por campo de los cuales distinguimos cuales son reticulocitos para luego expresar el resultado como porcentaje, siendo el cien porciento el número total de hematíes contado. Este valor será valido si se trata de una concentración normal de eritrocitos en sangre total. Por ello, cuando disminuye el número de eritrocitos como suele suceder en la anemia, el valor porcentual debe corregirse según el hematocrito empleando la siguiente fórmula: Reticulocitos corregidos (%) = reticulocitos observados (%) x

Hto del paciente Hto normal

(El hematocrito normal es el que le corresponde según edad y sexo). En caso de anemia intensa, el número de reticulocitos circulantes suele ser superior al que corresponde al grado de regeneración eritroblástica. Ello obedece a que la anemia se acompaña siempre de un estímulo eritropoyético compensador, que facilita una salida precoz de reticulocitos desde la médula a la sangre periférica, y un acortamiento de su período de maduración intramedular, lo que supone un aumento del período de maduración periférica. Este fenómeno se caracteriza por la aparición en el examen morfológico de la extensión de sangre de eritrocitos grandes (macrocitos) y tonalidad azulada (policromasia) Existe una relación inversa, aproximadamente lineal, entre el hematocrito y el período de maduración periférica de los reticulocitos. De esta forma puede calcularse otra magnitud

43

44 de interés clínico denominada índice de producción reticulocitaria (IPR) aplicando la fórmula siguiente: IPR =

Reticulocitos del paciente x Hto del paciente Período de maduración en días x Hto normal

Un IPR >3 indica aumento de actividad eritropoyética medular (anemia regenerativa), mientras que un IPR