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• HumbertoSalamanca

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Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Estudios de Superiores Cuautitlan Campo 1 Sección de Microbiología

Laboratorio de Microbiología Industrial Reporte de las prácticas #2 y #3 “Curva de crecimiento microbiano” y “Efecto de diferentes fuentes de Carbono sobre el crecimiento microbiano”

Profesores:  

Q.F.B Paredes Juárez Jonathan Pablo Q.F.B García Barrón Alma Susana

Grupo: 2651 Semestre: 2016-II Carrera: Química industrial Alumnos:      

Álvarez Rivas Rubén Darío Benítez Hernández José Antonio Espinosa Villeda Elsy Valeria López Martínez Adrian Osvaldo López Moreno Miguel Ángel Cipréss Pérez Pérez Daniel Alfredo

Fecha de Entrega: 8 de abril del 2016

1

Objetivos.

General:  Evaluar el efecto de diferentes fuentes de carbono (Dextrosa, Lactosa, Manitol, y Melaza) sobre el crecimiento de Escherichia Coli, así como identificar las fases de crecimiento del microorganismo en un cultivo. Particulares:  Elaboración de curvas de crecimiento microbiano para identificar la mejor fuente de carbono en Escherichia Coli.  Determinación de parámetros cinéticos que permitan evaluar el crecimiento del microorganismo en diferentes sustratos.  Elaboración de métodos indirectos (Biomasa por Turbidez y por peso seco) para el Análisis de crecimiento de Escherichia Coli.  Elaboración de método directo (Cuenta viable por sembrado masivo) para el Análisis de crecimiento de Escherichia Coli.

Introducción. En microbiología el crecimiento se define como el incremento de número de células; la fisión binaria es el proceso por el cual una célula se divide para formar dos células iguales, hay un intervalo que transcurre en la formación de dos células a partir de una la cual se llama generación y el tiempo requerido para esto es el tiempo de generación o tiempo de duplicación. El hecho de que exista un crecimiento equilibrado simplifica la medición de velocidad de crecimiento en un cultivo bacteriano, dado que dicha velocidad en todos los componentes de una misma población es la misma, el medir cualquier componente permite la determinación de la velocidad de crecimiento. Las bacterias enfrentan constantemente condiciones que limitan o impiden su crecimiento. Su habilidad para colonizar un ambiente requiere la capacidad para alternar períodos de rápida división celular y de crecimiento nulo. Las características de las células en estos periodos pueden analizarse en el laboratorio en condiciones controladas de temperatura, oxigenación y composición del medio de cultivo. Hay microorganismos que se multiplican por fisión binaria como es el caso de E.Coli su crecimiento puede ser representado como el logaritmo del número de células en función del tiempo de incubación, que gráficamente resulta en una curva de crecimiento bacteriano y presenta 4 fases: 2

   

Fase de transición A o “lag” Fase logarítmica o exponencial (FE) Fase estacionaria (FS) Fase de muerte celular

La fase “lag” representa el tiempo necesario para reiniciar el ciclo celular después de un periodo de ayuno nutrimental Un cultivo bacteriano generalmente se inicia al inocular el medio de cultivo con un número pequeño de bacterias en FS. En los primeros minutos posteriores al inicio del cultivo, se recupera el nivel normal de tensión helicoidal del DNA e incrementa la expresión de los genes importantes para el crecimiento. Posteriormente, entre los 30 y 40 minutos, se reinicia la replicación del cromosoma y a los 80-120 minutos se presenta la primera división de la mayoría de las células. La FE, o de crecimiento balanceado, representa el periodo en el que hay suficientes nutrimentos; las bacterias recuperan el ciclo celular e incrementan su número exponencialmente. La fase de transición B, o de crecimiento no balanceado, se inicia cuando disminuyen los nutrientes. En esta transición cambia la pendiente de la curva de crecimiento exponencial y disminuye la velocidad de síntesis de macromoléculas. La disminución de la síntesis de DNA y proteínas no es sincrónica, lo que ocasiona un incremento en la relación DNA/proteína. Por otra parte, la división celular continúa a una velocidad similar a la de la FE, lo que genera células de menor tamaño. Finalmente, cuando los nutrientes se agotan, las células entran a la FS. El inicio de esta fase se define operacionalmente como el momento en el que el número de células en el cultivo no varía. En estos cultivos la fase exponencial en la bacteria Escherichia coli representa el periodo de rápida división celular o de crecimiento balanceado, mientras que la FS representa el periodo de crecimiento nulo. Las bacterias que no esporulan en respuesta al ayuno nutrimental, como es el caso de Escherichia Coli, presentan cambios morfológicos y fisiológicos importantes al ingresar a la FS. Estos cambios no representan un estadio final con suspensión total del metabolismo, como en la esporulación, sino un estadio dinámico en el que se mantiene un metabolismo basal aun después de semanas en ayuno. Esta condición se logra mediante la expresión oportuna de genes que se organizan en redes de regulación. La respuesta genética al estrés nutrimental varía en relación al tiempo que tienen las células en FS, la oxigenación, el pH, la temperatura y el primer nutriente que se agota (fuente de carbono, nitrógeno o fosfato), entre otros factores. En la fase de muerte celular ya no es posible la división celular, por lo tanto, las células mueren y la población decrece.

La curva de crecimiento se inicia al diluir el cultivo de una noche en medio nuevo. 1) Fase de transición A o fase “lag”; 2) Fase logarítmica o exponencial; 3) y 4) 3

Fase estacionaria. En estos cultivos la fase exponencial representa el periodo de crecimiento rápido o balanceado y la fase estacionaria el periodo de crecimiento nulo. Hay distintos métodos que permiten conocer el crecimiento de los microorganismos, directos (recuentos en placa, filtración a través de membrana, número más probable y recuento directo en microscopio) e indirectos (Turbidimetría, actividad metabólica y peso seco). Para esta práctica se llevó a cabo el estudio de cómo se ve afectado el crecimiento microbiano por efecto de un sustrato. Dicho efecto puede ser descrito por la ecuación cinética de Monod, dicha ecuación establece la cinética para la degradación de sustrato y a su vez puede ejercer relación con el rendimiento de utilización del sustrato.Una vez conocidos los parámetros cinéticos ayudará a determinar cuál será la mejor fuente de carbono para utilizar con la bacteria E.Coli. Esta es una imagen de una curva de crecimiento microbiano en un medio que contiene Escherichia Coli.

Materiales y Reactivos. Tabla 1.0 Materiales, Equipo, Reactivos y/o Soluciones

4

Metodología

5

Efecto de diferentes fuentes de carbono sobre el crecimiento microbiano. ACTIVACION DE LA CEPA.

Tomar dos muestras de E. Coli e inocular en un tubo con 10mL de BHI

Incubar a 37ºC durante 24 horas preinoculo Tomar 5mL del medio e inocular en 50mL del medio de cultivo en un matraz Erlenmeyer

Incubar a 37ªC durante 12 horas

1. MMM 1% 2. MMM 1% 3. MMM 1% 4. MMM 1%

+ lactosa

Sembrar con pipeta estéril en un matraz Erlenmeyer del medio

+ glucosa

Rotular los matraces

+ melaza

Dejar en agitación a 150rpm y a 36ªC durante 12 horas

+ sorbitol

Llenar 2/3 de una celda y el resto congelarlo.

Tomar 20mLdel medio y colocarlo en un frasco ámbar (será utilizado como blanco).

Antes de inocular Añadir 10mLdel preinoculo en cada uno de los matraces

6

Preparar la solución de sustrato. a) 2mL de H2O b) 1.8ml de H2O 0.2ml de sustrato. c) 1.6ml de H2O c 0.4ml de sustrato. d) 1.4ml de H2O 0.6ml de sustrato. e) 1.2ml de H2O 0.8ml de sustrato. f) 1.0ml de sustrato.

y Rotular seis tubos. y Agregar

y

y

Solución de sustrato y H2O a cada tubo. Adicionar 0.5ml de Fenol al 5%

Agitar y enfriar en un baño de hielo.

Adicionar a cada tubo 2.5ml de H2SO4

Reposar a temperatura ambiente.

10 minutos.

Reposar en baño de agua a 30ºC

Leer absorbancias a 490nm 7

Resultados Tabla 1. Resultados de colonias presentes en Agar EMB de melaza a diferentes tiempos con Asa Bacteriológica de 10 μL (sembrado masivo) 8

Tiempo (minuto s) 30

Dilució Asa( n μL)

Conteo características

1/1000

10

8 rosas y 1 verde

60

1/1000

10

3 grandes rosas

90

1/1000 0

10

5 grandes, 8 medianas, 6 chicas

120

1/1000 0

10

Incontables coloración fluorescente

150

1/1000 0

10

19 medianas Todas de coloración rosada y 5 de ellas tiene el centro un poco morado

y

y Imagen

de verde

9

180

1/1000 00

10

46 medianas, 6 rosas 40 moradas

210

1/1000 00

10

14 medianas, 55 chicas y todas poseen una coloración morada

Tabla 2. Resultados para la curva de crecimiento microbiano de Escherichia Coli en melaza presentes en Agar EMB a diferentes tiempos con Asa Bacteriológica de 10 μL (sembrado masivo) y Absorbancia de 490 nm

Melaza 1% Tiempo (minutos ) 30 60

Transmitan Absorbancia cia (490 nm)

Dilución en tubo

UFC/mL

ln(UFC/ mL)

135.9 154.3

-2.1332 -2.1883

10-3 10-4

13.7101 14.9141

90

150.9

-2.1787

10-4

120

141.1

-2.1495

10-4

150

139.4

-2.1442

10-4

180

133.0

-2.1235

10-5

210

133.6

-2.1258

10-5

900,000 3,000,00 0 8,000,00 0 14,000,0 00 19,000,0 00 460,000, 000 690,000, 000

Nota: Para pasar -log(transmitancia)

de

transmitancia

absorbancia

15.759 16,589 16.7599 19.9467 20.3522

es

el

Tabla 3. Resultados para la curva de crecimiento microbiano de Escherichia Coli en glucosa Trabajado a diferentes tiempos, diluciones y absorbancia a 490 nm 10

Glucosa 1% Tiempo Transmitan Absorbanci (minutos) cia a (490 nm) 30 1 0

Dilución en tubo 10-3

60

0.9397

0,027

10-4

90

.8810

0,055

10-4

120

.9057

0,043

10-4

150

0.8994

0,046

10-4

180

0.9120

0,04

10-5

210

0.9549

0,02

10-5

240

0.9549

0,02

10-5

270

0.9549

0.02

10-5

UFC/mL 27000000 0 75000000 0 12000000 00 13500000 000 31200000 000 78000000 000 71100000 000 37500000 000 60000000 0

ln(UFC/mL ) 19.41393 252 20.43558 376 20.90558 739 23.32595 55 24.16368 39 25.07997 466 24.98735 31 24.34760 677 24.84986 568

Tabla 4. Resultados para la curva de crecimiento microbiano de Escherichia Coli en lactosa Trabajado a diferentes tiempos, diluciones y absorbancia a 490 nm Lactosa 1% Tiempo (minutos ) 30

Transmitan Absorbancia cia (490 nm)

Dilución en tubo

UFC/mL

ln(UFC/mL )

10-3

382.5

60

10-4

247.5

90

10-4

2060

120

10-4

0.056

150

10-4

900.026

180

10-5

2543

5.946728 653 5.511410 582 7.630461 262 2.882403 588 6.802423 652 7.841099 765 11

210

10-5

240

10-5

123009 400 612504 85

18.62777 133 17.93048 233

Tabla 5. Resultados para la curva de crecimiento microbiano de Escherichia Coli en manitol Trabajado a diferentes tiempos, diluciones y absorbancia a 490 nm Manitol 1% Tiempo (minutos ) 30

Transmitan Absorbancia cia (490 nm)

Dilución en tubo

UFC/mL

ln(UFC/m L)

10-3

1.009x10 20 1.4665x1 020 4.2766x1 020 3.3876x1 022 2.7491x1 023 3.1622x1 022 6.2058x1 024 9.6449x1 025

20,0048 008 20,1663 963 20,6311 505 22,5299 139 23,4392 842 22,5200 128 24,7928 053 25,9843 485

60

10-4

90

10-4

120

10-4

150

10-4

180

10-5

210

10-5

240

10-5

Tabla 6. Relaciones de tiempo de duplicación experimental de Escherichia Coli para cada sustrato Sustrato

Tiempo de duplicación

glucosa Lactosa Melaza

1x10-9 3.828x104 0.05517

μ 109 2612.2 18.125

Número de Generaciones 28.9678 36.97 28.58

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Gráfico 1. Curvas de crecimiento microbiana logarítmica de Escherichia Coli a diferentes sustratos a diferentes intervalos de tiempo tomando como un máximo 240 minutos

Crecimiento logarítmico microbiano de E.Coli 30 25

f(x) f(x) = = 0.03x 0.04x + + 19.89 16.34 R² = 0.85 R² = 0.91

20

melaza ln Linear (melaza ln) dextrosa ln Linear (dextrosa ln)

15

f(x) = 0.06x + 1.77 R² = 0.45

ln 10

Linear (dextrosa ln) lactosa ln Linear (lactosa ln) Linear (lactosa ln)

5

Manitol Linear (Manitol)

0

0

20 40 60 80 100120140160180200220240

-5

Tiempo (minutos)

Gráfico 2. Curvas de crecimiento microbiano Algebraico de Escherichia Coli a diferentes sustratos en diferentes intervalos de tiempo tomando como un máximo de 240 minutos

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f(x) = NaN x^NaN R² = NaN

Tiempo vs UFC/mL

160000000000 140000000000 120000000000

melazaq

100000000000

Power (melazaq)

80000000000 UFC/mL

60000000000

lactosa

40000000000

Manitol

20000000000 0 0

20 60 100 140 180 220 260 300 40 80 120 160 200 240 280

TIiempo (minutos)

Gráfico 3. Valores medidos de Absorbancia en función del tiempo de incubación para la cepa de Escherichia Coli en los distintos sustratos trabajados.

Gráfico 4. Valores medidos de UFC/ml en función del tiempo de incubación para la cepa de Escherichia Coli en medio Melaza 1%

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Análisis de resultados Se analizaron 4 diversas fuentes de carbono en forma de sustrato que son: Dextrosa, Lactosa, Manitol, y Melaza para evaluar el crecimiento microbiano de Escherichia Coli y así llevar un seguimiento de las fases de crecimiento de dicha bacteria por el método de turbidimetría y espectrofotometría molecular cuyos resultados de Absorbancia y UFC/ml están representadas en la parte de resultados de la Tabla 2 a la Tabla 5. Teóricamente Escherichia Coli puede reproducirse cada 20 minutos e incluso en solo 7 hrs una célula bacteriana puede dar origen a más de 2,000,000 millones de células nuevas Cabe mencionar que los sustratos inicialmente planeados para servir como sustrato del crecimiento de Escherichia Coli: 1. Dextrosa 2. Lactosa 3. Melaza 4. Manitol Por otra parte al momento de medir la Absorbancia y Transmitancia para poder cuantificar el crecimiento microbiano de Escherichia Coli se tuvieron problemas con el equipo (espectrofotómetro) y con las celdas que no eran las ideales para la lectura aparte de que ya estaban muy dañadas y no dejaban absorber el haz de luz que en ellas se incidía Cabe destacar una de las características principales de cada sustrato por ejemplo se tiene que la glucosa es un monosacárido que tiene disponibles los carbonos 15

para ser aprovechados por Escherichia Coli por otro lado tenemos a la lactosa que es un disacárido (glucosa + galactosa) ya este tiene dos fuentes de carbono provenientes de diferente monosacárido por lo que se le hace más difícil a Escherichia Coli la obtención del carbono aunque la fuente sea basta y siguiendo esta lógica llegamos al sustrato melaza que es el sustrato que nosotros manejamos siendo un polisacárido la fuente de carbono es basta pero de difícil acceso para Escherichia Coli por cuestiones de la energía que tiene que emplear para la sustracción del mismo En cuanto a la cuestión del crecimiento microbiano de los tres sustratos utilizados para el crecimiento de Escherichia Coli donde su crecimiento es apreciable en el Gráfico 2 donde se observa el crecimiento de la bacteria antes mencionada en función del tiempo El mejor sustrato para el crecimiento de Escherichia Coli como era de esperarse fue glucosa por su baja complejidad molecular y fácil sustracción de la fuente de carbono en dicho gráfico es apreciable algunas de las etapas del crecimiento microbiano de una bacteria como los son: 1. Adaptación 2. crecimiento 3. estacionaria 4. muerte En la gráfica no es apreciable la fase de adaptación debido a que antes de comenzar con el estudio espectrofotométrico se dejó que Escherichia Coli se adaptará en cada sustrato para que posteriormente fuera menos tardada la medición de lecturas Las lecturas de espectrofotometría se llevaron a cabo durante un periodo de aproximadamente 4 horas (240 minutos) en el que el comportamiento de la bacteria fue diferente para cada caso: 1. Glucosa se logra apreciar un gráfico prácticamente completo con fase de crecimiento bien definida con una fase estacionaria con duración baja y una fase de muerte confirmando nuevamente la facilidad para la obtención de carbono y la baja energía requerida por Escherichia Coli. (Gráfico 2) 2. Para el caso de lactosa y melaza únicamente se logra observar la fase de crecimiento logarítmico debido al difícil acceso para la obtención del carbono y aunque la lactosa es un disacárido y la melaza un polisacárido no quiere decir que cada uno de los monosacaridos presentes en ella están disponibles para que Escherichia Coli pueda tomarlos y reproducirse ya que se trata de un sacárido muy procesado por lo que le fuerza a Escherichia Coli a utilizar mas energía para poder obtener este macronutriente y por consecuencia le lleva más tiempo alcanzar cada una de las fases de crecimiento en ambos sustratos. (Gráfico 2) 3. De manera similar se comporto el manitol ya que es un polisacárido y necesita mucha energía para poder observar claramente todas las fases de 16

crecimiento de E.Coli por ende en la parte de resultados del Gráfico 2 solo es posible apreciar la parte de adaptación y logarítmica. En cuanto a la tabla de resultados 6 se tienen los datos de μ , tiempo de duplicación y el número de generaciones, estos resultados fueron calculados y proporcionados por cada equipo de laboratorio que realizo dicha experimentación con el sustrato asignado. Estos resultados nos indicarían (teóricamente) que a mayor μ menor será el tiempo de duplicación, lo que resultara a un número de generaciones mayor. Esto puede confirmarse en la parte de resultados en el Grafico 2 ya que se reporta un mayor número de generaciones para la Glucosa y Lactosa con valores de 28.9 y 36.9 respectivamente. Para el caso de la melaza también se encuentra concordancia en cuanto al número de generaciones y la representación gráfica ya que aunque la diferencia no es mucha si cuenta con un número de generaciones menor en comparación a los demás sustratos trabajados, y así su comportamiento será una curva menos elevada que indica una menor cantidad de UFC/ml. Existen microorganismos que estando en la etapa de crecimiento aumentan considerablemente en cantidad y se agrupan en colonias que son grupos de células suficientemente grandes para ser observadas (UFC) sin ayuda de un microscopio, como se puede observar en la parte de resultados en la Tabla 1. hay que tomar en cuenta que para que se de dicho crecimiento microbiano es necesario cumplir requerimientos nutricionales como son tener un control en la temperatura, pH, presión osmótica y fuente de carbono.

Conclusiones:       

A un menor tiempo de duplicación de microorganismos en cada sustrato , se tendrá una velocidad de crecimiento mayor. El mejor sustrato en el que se puede desarrollar E.Coli es en la glucosa. dada su baja complejidad de enlaces Entre menor sea el tiempo de duplicación del microorganismo, en el sustrato mayor será el número de generaciones. entre menor sea la complejidad del sustrato menor energía requerida E.Coli para poder reproducirse la incubación de E.coli se llevó a cabo en una incubadora a 37ºC para su óptimo desarrollo y crecimiento E.Coli es el microorganismo procariota estudiado con mayor profundidad debido a su rápida multiplicidad, bajo tamaño y gran manejabilidad La fase de crecimiento o fase exponencial del microorganismo en nuestro sustrato (melaza) se dio en un tiempo periodo de 3 horas y media a cuatro.

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