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• David Alva Alba

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TECNICAS DE MEDICION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO Podemos enunciar el crecimiento microbiano como el aumento ordenado de los constituyentes de un microorganismo que conduce al aumento en el número de individuos de la población. Para lograr un crecimiento adecuado de la población microbiana se requiere de un medio de cultivo apropiado que le proporcione todos los nutrientes necesarios para su metabolismo. Los métodos para el seguimiento de la evolución de un cultivo microbiano, es decir de determinación del crecimiento microbiano pueden clasificarse en directos e indirectos.

METODOS DIRECTOS • Medida de la evolucion del numero de celulas vivas o del numero de particulas.

METODOS INDIRECTOS • Medida de algun parametro de cultivo que permita deducir informacion sobre la evolucion del numero de microorganismos.

La elección de un método de seguimiento del cultivo en concreto depende de las características del cultivo y del proceso. Entre los métodos principales de recuento de microrganismos podemos destacar: Medida de peso seco celular: Es el método más usado para medir el crecimiento microbiano. El sistema consiste en la filtración del cultivo a través de una membrana que retenga las células y su posterior desecación hasta peso constante. El sistema, obviamente, no diferencia células vivas de muertas y su sensibilidad es limitada debido a la absorción de humedad atmosférica por las células secas y los tubos de centrifuga en el enfriamiento. Medida del peso húmedo: es un proceso de centrifugación o filtración de muestras de cultivo seguida por el pesado directo. Es un método extremadamente rápido, pero se requiere estandarizar el procedimiento puesto que se mide agua intra y extracelular, especialmente cuando se miden pequeños cambios en la población celular. Masa de un componente celular: este indicador representa una cantidad constante del peso seco total, y se puede estimar a partir del mismo, la concentración de células o de biomasa. Se han usado componentes como el Nitrógeno, proteínas, ARN, ADN y ATP celulares. Puede generar errores debido a la variación de estos componentes durante el crecimiento de las células. Número de células: el crecimiento se puede determinar en términos del número de células por litro. El número total de células se puede medir colocando muestras de cultivo

adecuadamente diluidas sobre portaobjetos de microscopios graduados como los de Helber. Aunque este método es relativamente rápido y exacto, o distingue entre células viables y no viables, también es muy agotador si no se cuenta con los contadores automáticos. Técnicas de recuento en placa: Basadas en colocar en un medio de cultivo adecuado un volumen determinado de muestra. Cada una de las células aisladas dará lugar, después de la incubación correspondiente, a una colonia de forma que el número de estas nos permitirá estimar el número de células presentes en la muestra plaqueada. Para que el sistema de recuento en placa tenga validez estadística, es necesario contar entre 30 y 300 colonias con objeto de disminuir el error de la medida. Técnicas turbidométricas: Están basadas en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las partículas en suspensión (células) y su medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un equipo similar al que se emplea en la medida de la absorbancia de luz por disoluciones coloreadas. La limitación de este sistema, por otra parte muy sencillo, es que no distingue células vivas de muerta y que normalmente no es capaz de detectar densidades celulares menores a 10.000 células por mililitro. Medida del ATP: Es una medida relativamente sencilla basada en la emisión de luz por la luciferasa de luciérnaga (Photimus pyralis) en presencia de O2 y de ATP. De esta forma se puede medir la concentración de ATP en un volumen dado de cultivo. Esta medida es interesante porque la concentración de ATP decae rápidamente en las células muertas, de forma que esa medida indirecta detecta únicamente las células vivas. Los sistemas de medida del crecimiento celular se han adaptado técnicamente para poder ser utilizados como sistemas online. En una operación on line no es necesario extraer la muestra del cultivo para realizar la medida. Esto es muy importante en el caso de fermentaciones en gran volumen porque permite realizar medidas en tiempo real y disminuye los riesgos de contaminación. Mediciones fisicas: El crecimiento de las células microbianas siempre va acompañado de generación de calor. Se ha demostrado que hay una relación directa entre la cantidad de calor producido y la concentración de biomasa La rapidez de la captación de oxigeno es utilizado en los cultivos aeróbicos, pues está relacionado con la concentración de biomasa

TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE