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• LucyRosseCaceresQuispe

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CRECIMIENTO MICROBIANO

CRECIMIENTO CELULAR

•Es el aumento en la cantidad de constituyentes y estructuras celulares. •En ausencia de división celular, el crecimiento implica aumento en el tamaño y peso de la célula. • cuando el crecimiento es seguido de división celular hay un aumento en el número de células. Se toma como base el crecimiento de bacterias (se puede extender a levaduras y hongos). El crecimiento de una población resulta de la suma de los ciclos celulares de todos los individuos de dicha población. Ciclo celular : proceso de desarrollo de una bacteria aislada.

CRECIMIENTO CELULAR •Los microorganismos en un medio de cultivo apropiado, se dividen empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo para producir nuevos microorganismos. •Este proceso continúa hasta que algún nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se detiene. •También puede detenerse el crecimiento por acumulación de alguna substancia inhibidora formada por los mismos microorganismos Hay tres aspectos determinantes del crecimiento microbiano:  Los factores del crecimiento.  El estequiométrico, por el cual la concentración final de microorganismos obtenidos dependerá de la concentración y composición del medio de cultivo  El cinético, que indica la velocidad del proceso.

1.- FACTORES DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

1.1.- REQUERIMIENTOS FISICOS    

Temperatura pH Actividad de Agua Presión Osmótica

1.a.- Temperatura •Cada microorganismo prefiere una Tº de desarrollo. •Temperatura mínima, por debajo ella que no hay crecimiento •La falta de crecimiento a temperaturas muy bajas se debe a: –Reducción en la velocidad de reacción (según leyes cinéticas) –Cambio de estado de los lípidos. (aumento de viscosidad) •Temperatura óptima a la que la velocidad es máxima. •El incremento de la velocidad de crecimiento con la temperatura se debe al incremento generalizado de la velocidad de las reacciones enzimáticas con la temperatura. . Temperatura máxima por encima de ella no hay crecimiento

Tipos microbianos •Sicrófilos: -5 ª 20°C, óptimo < 15oC –organismos marinos, algas: Chlamydomonas nivalis (nieve rosada), bacterias: Pseudomonas, Flavobacterium –membrana con alto % de ác. grasos insaturados •Psicrótrofos 0-35°C, óptimo 20-30oC –Pseudomonas - crecen en el refrigerador ( psicrótrofos son mesófilos que pueden crecer a temperaturas bajas, es importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimentos, son capaces de crecer en condiciones de refrigeración (4 - 8ºC) y de producir infecciones en los consumidores del alimento (30 - 35 ºC). •Mesófilos 15-45° C, óptimo: 30-40°C –Mayoría de los m.o (del suelo, aguas, patógenos) •Termófilos 40-70°C, óptimo de 55-65oC Tienen membrana con alto % de ácidos grasos saturados, y enzimas estables al calor –Bacillus stearothermophilus, (compostaje) •Hipertermófilos 80-113°C, óptimo > 90o Pyrococcus, Pyrodictium (aguas termales)

1.b.- pH •El pH interno en la mayoría de m.o. está en 6.0 a 7.0. •Los rangos de pH tolerables son distintos. •Hay microorganismos acidófilos que pueden vivir a pH=1.0 y alcalófilos que toleran pH=10.0 •Como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de crecimiento suele bajar. •Si la única fuente de nitrógeno es amonio, se produce liberación de iones H, bajando el pH. •Si la fuente de nitrógeno es solo nitrato, se deben tomar iones H del medio para formar amonio, subiendo el pH.

•La bajada del pH del medio que producen ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente a otros microorganismos competidores. •Ejplo. Bacterias lácticas. Reducen el pH del medio a 4.5. •Los ácidos orgánicos de cadena corta son tóxicos para algunas bacterias por sí mismos. •La evolución del CO2, también hace variar apreciablemente el pH.

1.c.- Disponibilidad del agua •El agua es el componente principal de las células, por lo tanto un suministro de agua adecuado es indispensable para lograr el mantenimiento y crecimiento microbiano.

•También el agua es el medio de transporte de los sustratos (o contaminantes) hacia el interior de las células, y de los compuestos que se producen dentro de la célula. •Los microorganismos necesitan presencia de agua, en forma disponible, para crecer y llevar a cabo sus funciones metabólicas. • •La disponibilidad de agua se mide con actividad de agua (aw).

Actividad del agua. (aw) Relación entre la presión de vapor de agua del medio (P) y la presión de vapor del agua pura (Po).

Algunas moléculas del agua se orientan en torno a las moléculas del soluto y otras quedan absorbidas por componentes insolubles de las soluciones. En ambos casos, el agua queda en una forma menos reactiva. Estas contribuyen menos a la presión de vapor del medio

Actividad del agua y Presión osmótica •La presión osmótica π está relacionada con la aw a través de la expresión •

V . π = R . T . Ln.aw

donde •R es la constante de los gases, •T la temperatura absoluta, • π la presión osmótica, • V el volumen molar parcial del agua •Puede definirse como la presión que se debe aplicar a una solución para detener el flujo neto de disolvente a través de una membrana semipermeable. •La Presión osmótica alta, causa pérdida de agua y plasmólisis celular.

Efectos de la presión osmótica •Los valores mínimos: bacterias aw > 0.90, levaduras aw > 0.85, hongos filamentosos aw > 0.80. •La utilización de almíbares, salmueras y salazones reduce la actividad de agua de los alimentos, y permite su conservación. (ejemplo mermeladas, leche condensada, etc) •Halófilos. •El agua de mar tiene una concentración del 3%. Los m.o. halófilos: requieren condiciones salinas: •Discretamente halófilo (1-6%), •Moderadamente halófilo (6-15%), •Halófilos extremos (15-30%)

•La principal estrategia de los m.o. halófilos para adaptarse al estrés osmótico se basa en la acumulación de compuestos en el citoplasma para compensar la presión osmótica externa. Estos compuestos pueden ser iónicos o no iónicos.

Ejemplo del Mar muerto •La salinidad promedio del agua de los océanos está entre 3,1–3,8%, en Mar muerto es 28%. •Son aguas ricas en calcio, magnesio, potasio y bromo, y relativamente pobres en sodio, sulfatos y carbonatos. •Allí solo viven microorganismos halófilos: un protozoo ciliado, algunas algas y bacterias de los géneros Flavobacterium, Halococcus y Halobacterium, y las artemias. •Debido a la elevada densidad de sus aguas (1 240 kg/m³) una persona puede flotar, debido al empuje superior a la del mar (1 027 kg/m³)

1.d.- Concentración de oxigeno. •Cuando el O2 es el sustrato limitante, la tasa de crecimiento especifica varia con la concentración del oxigeno disuelto, de acuerdo a una cinética de saturación. •El oxigeno se introduce al caldo de cultivo normalmente esparciéndolo en el medio. •La transferencia del oxigeno desde las burbujas de gas, hasta las células esta limitada por la transferencia de oxigeno a través de la película liquida que rodea las burbujas de gas

2.- FORMAS DE CULTIVO Las fermentaciones, pueden clasificarse en: continua, semicontinua o intermitente. a.- PROCESO INTERMITENTE. Fermentación Batch. •Se refiere al crecimiento de células en sistema cerrado. •En el inicio del cultivo, el medio estéril se inocula con un volumen adecuado de microorganismos y se permite que se lleve a cabo la fermentación en condiciones óptimas. A lo largo del proceso no se añade ningún nutriente, salvo el oxígeno, por lo que se produce el agotamiento de los nutrientes, lo que ocasiona cambios fisicoquímicos en el caldo que dan origen a fases típicas de un cultivo microbiano. •Consecuencia: Varían el pH, temperatura y la concentración de nutrientes con el tiempo. CICLO DE CRECIMIENTO MICROBIANO. •El crecimiento no es lineal y sigue un patrón

Crecimiento microbiano en medio líquido

•Fase lag. Adaptación al nuevo ambiente. •Fase exponencial (log) - velocidad máxima de crecimiento bajo condiciones particulares. •Fase estacionaria - sin crecimiento neto, vc=0. vc=vm (vel. crecimiento = vel de muerte), por nutrientes limitantes, acumulación de desechos, inhibición del crecimiento •Fase de muerte. velocidad de muerte celular > velocidad de división celular

Fase de latencia •Cuando se introduce un inoculo en medio fresco, el crecimiento usualmente no comienza de inmediato sino después de un tiempo llamado de latencia o acostumbramiento. • En este periodo de transición los microorganismos, producen las enzimas necesarias para aprovechar un nuevo medio ambiente. •En esta fase no hay incremento en el número de células, pero hay actividad metabólica, aumento en el tamaño individual de las células, en el contenido proteico, ADN y peso seco de las células. •Si un cultivo que está creciendo en fase exponencial es inoculado al mismo medio de cultivo bajo las mismas condiciones de crecimiento, no se observa fase de latencia y el crecimiento exponencial sigue a la misma velocidad. •Si una población se transfiere de un medio de cultivo rico a un medio pobre, se observa latencia porque las células para poder seguir creciendo deben tener las enzimas necesarias para sintetizar algunos metabolitos esenciales que no están presentes en el medio.

Factores que afectan la fase de latencia •Generalmente la fase de latencia aumenta con la edad del inoculo. •Si un cultivo que está creciendo en fase exponencial es inoculado al mismo medio de cultivo bajo las mismas condiciones de crecimiento, no se observa fase de latencia y el crecimiento exponencial sigue a la misma velocidad. •Se puede producir una pseudo fase de latencia, cuando el inoculo es pequeño o con baja porción de células viables. Si se desea minimizar la fase de latencia es recomendable: •- Las células deben estar adaptadas a las condiciones del medio donde crecerá. •- Las células debe ser jóvenes (en fase exponencial) •- El tamaño del inoculo debe ser entre el 5% y 10% v/v.

Fases de latencia múltiples. •El crecimiento diaúxico es un tipo de crecimiento microbiano que tiene lugar cuando hay presentes dos sustratos diferentes que pueden ser utilizados como fuente de carbono. •En este caso se observa una curva de crecimiento bifásica debido a la utilización secuencial de distintas fuentes de carbono. •El metabolismo del organismo es selectivo para uno de los sustratos (se usa la fuente de carbono que permite un crecimiento más rápido) y cuando la agota, comienza a metabolizar el otro. •En bacterias lácticas, por ejemplo, la presencia de glucosa que es fácilmente asimilable, induce un efecto de represión por catabolito sobre el operón lac que es necesario para el metabolismo de la lactosa, un disacárido de más difícil asimilación. •Como consecuencia se produce un crecimiento diaúxico en medios de cultivo que contienen una mezcla de glucosa y lactosa.

Fase exponencial o fase logarítmica •Es el período en el cual, cada vez que pasa un tiempo de generación la población microbiana se duplica. La velocidad de crecimiento es máxima. •En esta fase la concentración de nutrientes es alta, y la tasa de crecimiento celular es por tanto independiente de la concentración de nutrientes. •Es un periodo de crecimiento balanceado, en el cual todos los componentes celulares se incrementan en la misma proporción.

•Fase de desaceleración. En esta fase el crecimiento desacelera debido a la escases de algún nutriente esencial o de la acumulación de algún producto toxico, resultado del crecimiento previo. •Estos factores ocasionan un crecimiento desbalanceado, ocasionando cambios en las estructuras celulares, para aumentar sus perspectivas de crecimiento en un medio hostil. •Un ejemplo de producto inhibitorio es el etanol producido por las levaduras alcohólicas. •Si de algún modo se remueve el producto toxico, puede haber una nueva fase de crecimiento. •Fase estacionaria •En esta fase la velocidad de muerte celular se iguala a la velocidad de reproducción de las sobrevivientes. •En esta fase las células sobrevivientes, producen metabolitos secundarios (como los antibióticos). •Las limitaciones del crecimiento ocurren por: agotamiento de algún nutriente esencial, por acumulación de productos tóxicos, o por una combinación de las causas anteriores.

Fase de muerte •Ocurre una disminución progresiva en el número de células viables. •velocidad de muerte celular > velocidad de división celular •Cuando la concentración de sustrato es mínima, la célula se ve forzada a metabolizar su propio protoplasma (se conoce como metabolismo endógeno) Manejo industrial. •La fase de latencia, no es deseable, por que se pierde tiempo y acarrea pérdidas económicas •Para minimizar esta fase, se hace crecer el inóculo aparte, en un medio de cultivo igual al que se va a emplear en el bioproceso (cultivo o fermentación) y luego se procede a transferirlo cuando las células ya se encuentran en la fase exponencial (inoculación).

Ventajas y Desventajas del proceso batch. •Su mayor ventaja es la sencillez. •Desventajas: alto requerimiento de mano de obra, y demasiados tiempos muertos. •Tiempos muertos: Fase de adaptación, fase de decaimiento, periodo de descarga, y renovación de la carga del reactor para un nuevo batch.

Proceso semicontinuo •Se evitan las fases de adaptación y decaimiento.

•Periódicamente se extrae medio agotado y se repone medio fresco.

Criterios: –mantener la concentración de sustrato suficientemente alta para evitar escases. –la concentración del producto suficientemente baja para no sobrepasar los límites tolerables.

2,b.- Proceso semicontinuo •Se operan de forma similar a los batch, pero sólo se cosechan parcialmente a intervalos regulares, reponiendo el cosechado con medio fresco. •Es como repetir un cultivo batch indefinidamente, pero ahorrando la mayor parte del tiempo de servicio entre lotes. •Los parámetros a controlar: volumen y tiempo de adición, se calculan de modo que el cultivo se mantenga en fase logarítmica. •Si el volumen extraído es muy grande puede diluirse el medio, tanto que la masa microbiana puede volver a la fase de acostumbramiento. •Si el volumen extraído es muy pequeño para igual tiempo el cultivo puede agotarse y pasar a la fase estacionaria. •Si el tiempo de renovación es muy grande el cultivo puede alcanzar a la fase estacionaria y si es muy pequeño el cultivo puede regresar a la fase de acostumbramiento.

PROCESO EN CULTIVO CONTINUO

2.c.- Proceso en cultivo continuo •Constantemente se suministra nuevo medio de cultivo al bioreactor, con agitación, y se retira producto y células. •Cuando el sistema alcanza estado estacionario, la concentración de células, productos y sustrato permanecen constantes. •Proporciona condiciones constantes para el crecimiento celular, y la formación de productos y se pueden obtener productos de calidad uniforme. •Se usa, cuando el producto de interés se sintetiza en la fase logarítmica. Por tanto, interesa que las bacterias estén en esa fase el mayor tiempo posible, para lo que requieren más medio. •Sistemas de control: quimiostato y turbidostato

Control por quimiostato •El elemento de control la es la concentración de un nutriente limitante (C o N). •Los demás nutrientes en el medio se encuentran en exceso. Los parámetros a tener en cuenta son: •F (m3/h); •volumen del reactor (m3); •densidad celular (x); •factor de dilución (D): Es la relación entre el caudal de alimentación, y el volumen de cultivo. D=F/V (h -1) • D indica las veces que se renueva el volumen del biorreactor por unidad de tiempo. D= 0.25 h-1 indica que en una hora se renovó 25 % del volumen de cultivo, o bien que cada 4 h se renueva el volumen de cultivo. •Si la tasa de crecimiento se hace igual al factor de dilución (D), entonces dx/dt=0. Por tanto, la cc de las células se hace constante (x=x) y el cultivo se encuentra en estado dinámico de equilibrio.

•Con altas tasas de dilución el cultivo puede drenarse totalmente (DC: dilución crítica). •Es decir, el cultivo se “lava” porque su velocidad de crecimiento es inferior a la tasa de dilución. •A muy bajas diluciones (D) el quimiostato no funciona si el nutriente limitante es la fuente de energía. • Ello se debe a que en esas condiciones, la fuente de energía sólo se usa para reacciones de mantenimiento de la integridad celular, pero no queda para el crecimiento.

Aplicaciones: • Procesos industriales de fermentación (producción de bebidas alcohólicas, de antibióticos, de aminoácidos, etc) • Su aplicación más conocida es para la depuración de aguas residuales, por procesos aeróbicos o anaeróbicos. • El “medio de cultivo fresco” es el agua residual que entra en la planta y alimenta a los fangos activados por MO que luego se retiran por decantación

•Turbidostato: elemento de control, la turbidez. •La alimentación se regula mediante el monitoreo de la densidad óptica del cultivo. Se alimenta medio fresco cuando la turbidez supera un límite prefijado. •Se usa menos que el quimiostato porque es más elaborado y porque el medio cambia

3.- DETERMINACION DE LA CONCENTRACION CELULAR Existen diversos métodos, con diferentes propuestas de clasificación. • Se pueden agrupar en dos: – métodos directos y – métodos indirectos. Directos obtienen una medida de la masa celular por: – Técnicas de conteo, – Medida de concentración de masa celular: peso celular, absorbancia. Indirectos miden la concentración de algún componente celular (ADN, proteínas, etc).

a. Conteo celular •Se cuentan directamente las células, determinando la masa celular por unidad de volumen. •En el método la suspensión de la muestra se coloca en una cámara de recuento en una cuadriculada de dimensiones conocidas, y se tapa con el cubre objetos. Como se conoce el área de las cuadrículas y la altura de la cámara de recuento, el volumen ocupado por la suspensión en cada cuadrículas queda determinado. • Para obtener el número de bacterias por mililitro de suspensión, se requiere contar el número de microorganismos en varias cuadriculas, calcular el promedio de recuento por cuadrícula y multiplicar este promedio por el factor correspondiente. •Estos métodos presentan algunas limitaciones: - No se pueden distinguir células vivas de células muertas. -Las células muy pequeñas son difíciles de contar. -La precisión es difícil de lograr -El método no es adecuado para suspensiones celulares de baja densidad, es decir las soluciones deben contener aproximadamente 107 células/mL o más.

Cámaras de recuento •Existen cámaras especificas como: Cámaras de Neubauer, Cámara de Petroff-Hausser, el hemocitómetro, Microscopio graduado de Helber, etc. Cámara de Neubauer. •Esta cámara está adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases •Se trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente deprimidas en cuyo fondo se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula de dimensiones conocidas. •Se cubre la cámara con un cubreobjetos que se adhiere por simple tensión superficial (en especial una vez que se haya añadido la muestra líquida).

•Cuadrado de 3 x 3 mm. •El área sombreada y marcada L es 1 mm2. •La depresión tiene 0.1 mm de profundidad. •El volumen de la superficie L, bajo el cubreobjetos es de 0.1 mm3 (0.1 microlitro) •Los cuadrados L están subdivididos en 16 cuadraditos de 0,0025 mm2 cada uno. •El cuadrado del centro está dividido en 5 cuadrados por lado con una longitud lateral de 0,2 mm, y superficie de 0,04 mm2. •Al contar las cuatro áreas sombreadas (L), si hay un total de x células entre las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular será :

•células / mL = 10000 (x/4)

Cámara de Neubauer

Técnica de conteo Para que las células, no se cuenten dos veces, reglas:

-Se cuentan las células dentro de la zona definida. - También se cuentan las células, que se apoyan o tocan en dos caras , p.ej. en la línea de medida izquierda y superior.

Observaciones sobre el recuento – Efectuar conteo en forma de meandro –a) En los conteos de cámaras, el diafragma del condensador en el microscopio deberá estar cerrado en gran parte. b) El valor medio de los conteos se aplica luego en una fórmula de cálculo o se multiplica por el factor correspondiente.

Cámara Petroff-Hausser •El retículo del fondo está dividido en 25 cuadrados grandes •Cada cuadrado grande tiene 16 cuadraditos •Volumen de la cámara= 0,02 mm3 •Área de la cámara 1 mm2

Determinación de la concentración celular

•Càlculo del número de células por mL de muestra: •Se observan 12 células. •12 x 25 = 300 (número de células en 0,02 mm3). •300 x 50= 15000 (número de células en 1 mm3) •150000 x 1000 = 1,5 x 107 (número de células en 1 mL)

•Calculo del numero de células/ ml

Cámara de conteo SEDGEWICK RAFTER •Es una cámara graduada de 50 x 20 x 1 mm (= 1 cm³). •La cámara de conteo tiene 1 mm de profundidad. El área total es de 1000 mm2 y el volumen de 1000 mm3 o 1 ml. •Consiste en un marco de cerámica rectangular. Posee un grabado de 1000 cuadrados y está cubierto por un cubreobjetos espeso. •Esta diseñada para contar plancton en un microscopio compuesto o en un microscopio invertido, • medición cuantitativa del número exacto de partículas en un volumen preciso de un fluido.

b) Equipos automáticos •"Cell Coulter" de Beckman-Coulter •Se basa en medir los cambios en la resistencia eléctrica que se producen cuando una partícula no conductora en suspensión en un electrolito atraviesa un pequeño orificio. •El contador consta de dos cámaras separadas por un material no conductor, en el que hay un orificio de tamaño similar al de las células. •Cada cámara contiene un electrodo, la suspensión de células a ser contadas se coloca en una de las cámaras y se aplica presión para que las células pasen a la otra cámara a través del orificio, cada vez que una célula pasa a través del orificio ocasiona un cambio en la conductividad eléctrica que es registrado por un dispositivo electrónico y de esta manera el contador indica el número de células en esa suspensión.

Cell Coulter :Ventajas y desventajas •Es posible contar y medir varios miles de partículas por segundo, independientemente de su forma, color y densidad. •Las limitaciones de este método son: - Se cuentan células vivas y muertas. - Las suspensiones deben estar libres de partículas diferentes a los microorganismos que se cuentan, por que el aparato no puede distinguir entre una u otra.

c.- Conteo de células viables •En los métodos anteriores se determina el número de células totales, pero en muchos casos únicamente interesa contar células viables. (célula que es capaz de dividirse y forma una progenie) •La manera usual de hacer este conteo es determinando el número de células en la muestra, capaces de formar colonias sobre un medio de cultivo sólido (agar) y esto se conoce como recuento en placa. (UFC) y numero mas probable (NMP)

c.1.- Conteo en placas. •En este procedimiento se realizan diluciones seriadas de la muestra •Se inoculan pequeños volúmenes conocidos, de cada dilución, en placas de Petri con un medio sólido adecuado y se extiende con una varilla de vidrio •Luego las placas se incuban en las condiciones optimas hasta que aparezcan las colonias que son fácilmente contables.

c.1.- Conteo en placas. •Se asume que cada colonia ha sido formada por una única célula del medio de cultivo original. Esta suposición puede subestimar la densidad de población. •Las células son entonces medidas como unidades formadoras de colonia – UFC. •Para realizar el recuento se seleccionan las placas de la que contengan entre 25 y 250 colonias.

c.1.- Conteo en placas.: Ejemplo. •En un recuento en placa, se hacen diluciones seriadas con un factor de dilución de 100, para ello se toma 1 mL del cultivo de bacterias en suspensión, y se añade a un frasco de dilución que contiene 99 mL del diluente adecuado, se agita y se toma de esta primera dilución (1:100 ó 10-2) 1 mL y se transfiere a un segundo frasco con 99 mL del diluente adecuado, se agita y se toma de esta segunda dilución (1:10.000 ó 10-4) 1 mL y se transfiere a un tercer frasco de dilución que contiene 99 mL del diluente adecuado (esa corresponde a la dilución 1:1.000.000 ó 10-6). •De cada dilución se siembran por triplicado muestras de 1 mL y se incuban por 24 horas y se cuentan las colonias. •Si el promedio de las 3 placas de la dilución 1/1000, es de 32 colonias entonces el recuento es de 32.000 UFC/mL de muestra = 3.2x105 UFC

Conteo en placas Ventajas y desventajas Ventajas. •Se usa frecuentemente, para estimar poblaciones bacterianas en leche, agua, y otros productos. •Es fácil de realizar y se adapta a la medición de poblaciones de cualquier densidad. Desventajas: •Tiempo largo, (requieren 24 horas) •Exigen muy buenas técnicas de esterilización •Puede dar errores cuando se trata de células agregadas

Placas petrifilm (3M) •Son placas prefabricadas con el medio de cultivo adecuado para el microorganismo que se desea contar. •Las placas Petrifilm de 3M para Coliformes dan resultados en 24 h. Tres etapas: •1) Sembrar. Levantar la película y añadir la muestra •2) Incubar. El diseño de las placas ahorra espacio en la estufa •3) Contar. Las colonias rojas asociadas a burbujas de gas.

c.2.- Número mas probable (NMP) •Es una técnica de estimación estadística basada en el hecho que a mayor número de bacterias en una muestra, mayor será la dilución necesitada para reducir la densidad hasta el punto en que ninguna bacteria se le permita crecer en una serie de tubos de dilución. •Se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de células en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de muestras. •Muestras microbianas son añadidas a tubos con caldos adecuados en unas cinco replicas e incubados, la presencia o ausencia de gas y turbiedad formados en la fermentación da un estimado del número de células. •Aquellos tubos que recibieron una o más células microbianas procedentes de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes.

c.2.- Número mas probable (NMP) •Se toma la muestra original y se subdivide unas 10 veces, o mas para evaluar la presencia/ausencia en múltiples replicas. •El grado de dilución para el cual comienza a aparecer la ausencia indica que los elementos se han diluido tanto que hay muchas submuestras en las que no aparece. •Al aumentar el factor de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contendrán tan sólo un microorganismo y otros tubos no contendrán ninguno. •Se usan las tablas de Cochran. •Al calcular la probabilidad de que los tubos no hayan recibido ninguna célula, se puede estimar el número más probable (NMP) de microorganismos presentes en la muestra original, a partir de una tabla estadística. •El NMP es una afirmación que existe 95% de probabilidad que la población bacteriana sea de rango correcto. •Este método es más útil cuando las bacterias a contar no crecen en medios sólidos, o cuando la bacteria puede crecer en un medio líquido diferencial, como sucede con las bacterias coliformes, que usan selectivamente lactosa.

Número mas probable (NMP) para 6 tubos, lectura 6,3,1 10 mL de inóculo

6 tubos positivos (com crescimento bacteriano)

1 mL de inóculo

0,1 mL de inóculo

3 tubos positivos

1 tubos positivos

Tabla: NMP de bacterias por 100 g (ml) de material analizado empleando cinco tubos inoculados con 10, 1 y 0.1 ml o g de material Tsoumada de: Enumeration of coliforms, faecal coliforms and of e. Coli in foods using the MPN methoD MFHPB-19 April 2002 por Donna Christensen Crawford y Rick Szabo

Uso de la tabla •Consideremos positivos los siguientes cultivos: (1) 5 tubos inoculados con 10 ml de la dilución (1/10) del material : los cinco (5) son postivos (2) 5 tubos inoculados con 1 ml de la dilución (1/10) del material: solo uno (1)es positivo (3) 5 tubos inoculados con 0,1 ml de la dilución (1/100) del material: ninguno (0) es positivo •Cada uno de los cinco tubos de las tres diluciones representan respectivamente a 1, 0.1 y 0.01 g (ml), del material analizado. •La lectura se toma en la ubicación de la Tabla correspondiente a la lectura 5-1-0 (NMP de 33) si se hubiesen utilizado 10, 1 y 0.1 g (ml) de material. •Como se usaron cantidades 10 veces menores (1/10) de aquellas con las que se construyó la tabla, el valor de 33 debe multiplicarse por 10, lo que proporciona un valor de 330 organismos por 100 g (ml) de material. •Como usualmente se expresa por g (ml) de material, este valor (330) debe dividirse por 100. •El recuento obtenido por el NMP es en este caso de 3,3 organismos por g (ml) de material analizado.

c.3.- Membranas Filtrantes •En poblaciones con menos de una célula por mililitro (agua de piscina), no son aplicables los métodos UFC o NMP. La muestra debe concentrarse antes del recuento, por filtración. •Los métodos de recuento en placa o del número más probable pueden detectar una célula microbiana viable, en un mililitro de la muestra. •La concentración de los microorganismos de las muestras se hace, generalmente, por filtración •Consiste en hacer pasar la muestra que contiene los microorganismos a través de una membrana de acetato de celulosa (0.45μm) colocada en un dispositivo de filtración. •Los microorganismos quedan retenidos en la membrana filtrante, la cual se retira después de terminado el proceso de filtración y se coloca en una placa de Petri con un medio de cultivo adecuado.

c.3.- Membranas Filtrantes •Después de incubar, aparecen sobre la membrana las colonias de los microorganismos. •Esta técnica permite el análisis de grandes cantidades de la muestra, tratándose por ejemplo de agua o de aire, pueden filtrarse a través de la membrana grandes volúmenes, concentrando así la población microbiana.

d. Peso seco. •Se basa en secar volúmenes conocidos de medio con las células en crecimiento, hasta obtener un peso constante. •Es útil para grandes volúmenes. •Para levadura se puede usar una centrífuga con velocidades de 4-6x103rpm. Se obtiene una masa húmeda de células, luego esta masa se lava y seca a 80ºC por 24 horas, y se pesa. •En células bacterianas, se usan filtros de membranas para obtener la masa celular húmeda, y luego se seca. •(1 mg de peso seco equivale a una masa bacteriana de 5 x 10 9 bacterias) •Puede ser usada cuando el medio no contiene sólidos en suspensión.

Desventajas: •Los componentes volátiles de la célula pueden perderse. •La muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta. •Requiere muestras muy grandes y el proceso es lentos.

e. Absorción de luz. •Consiste en hacer incidir una luz monocromática a la suspensión de microorganismos, y se mide la luz transmitida a través de la suspensión, la que es inversamente proporcional a la concentración de biomasa, según la ley de Beer. •Usar, turbidímetro o espectrofotómetro 600- 700 nm. •Se necesitan de 10 millones a 100 millones de células por mililitro para hacer una suspensión suficientemente turbia para ser leída.

e. Absorción de luz. •Hay que hacer una curva de calibración que relacione medidas directas (recuento en placa o microscopía) con las indirectas de turbidez •Teniendo esta curva, se podrá determinar las ufc/ml de otras muestras luego de leer la absorbancia de las mismas. •Valores altos de OD (mayores a 0.3) afectarán la linealidad en la respuesta. •El principal inconveniente es que no distingue células vivas de muertas, o entre células y otras particulas. Sin embargo, es una técnica que puede ser utilizada on-line para mediciones continuas

f. Masa de un componente celular. • Medida de algún componente celular que sea parte constante del peso seco total de las células. • Pueden ser: proteínas, nitrógeno, ADN, RNA, y ATP celulares, los cuales están presentes en cantidades mas o menos constantes por especie. • Se detecta la presencia de ATP, por bioluminiscencia usando luciferasa, aunque hay algunos problemas experimentales que hacen que la técnica sea controvertida.

g. Efectos físicos. Se puede medir la variación de algún factor externo por efecto del crecimiento celular, tales como;

• el calor generado por el crecimiento, • el oxígeno captado por el medio, y que deja un vacío medible.

4.- CINETICA DEL CRECIMIENTO •La velocidad de crecimiento es el cambio en el nùmero de células en la unidad de tiempo. •El crecimiento es una consecuencia del hecho de que cada célula se divide dando dos células hijas, las cuales se dividen luego, cada una en otras dos, de modo que en cada período de división la población se duplica. Parametros: •Tiempo de duplicación. •Tasa de crecimiento.μ

a.- Tiempo de duplicación. (g) •Es el tiempo necesario para duplicar una biomasa. •Xo ----g--- 2Xo •Al tiempo 0 X = Xo •Después de: 1 generación X= 2.Xo. •En 2 generaciones X = 2(2Xo.) =22 Xo •En 3 generaciones X = 2(22 Xo)= 23Xo •En n generaciones

X = 2nXo , Y =2n.Xo

El número de generaciones en un tiempo t será: n = t/g (1)

• Aplicando logaritmos: X = 2n Xo (2) … • Log X = log Xo + n log 2 • (3)

Sustituyendo log 2 por su valor 0.3010, se tiene que 1/0.3010 = 3.3 • n = 3.3(logX – logXo) • n = 3.3 log (X/Xo) (4) Reemplazando en ec.1: n = t/g • g= 0.3 t / log (X/Xo) (5) • En ln la ec.3: n= (LnX-LnXo)/Ln2 • O también LnX=nLn2+LnXo (6) • (ln 2=0.69), y remplazando n =t/g se tiene: • g =0.693 t/(lnX-lnXo) (7)

Tiempos de generación en bacterias Bacteria

Medio

Tiempo de generacion (min)

E. Coli

Glucosa-sal

17

Bacillus megaterium

Sacarosa-sal

25

Streptococcus lactis

Leche

26

Staphylococcus aureum

Caldo infusion de corazon

27-30

Streptococcus lactis

Caldo lactosa

48

Lactobacillus acidófulus

Leche

66-87

Rhizobium japonicum

Leche

344-461

Mycobacterium tuberculosis

Sintético

792-932

Ejemplo.1 Se tienen 1000 bacterias en un medio de cultivo óptimo y después de 4 horas de incubación, creciendo exponencialmente, se obtienen 100 000 bacterias. Calcule el tiempo de generación. • Xo = 1000 • X = 100 000 • T = 4 horas =240 minutos • g =? g = t/n

• • • • • •

Cálculo de n de la ec (3): n = 3.3 log X/Xo , n = 3.3 log 100000/1000 = 6.6 generaciones g =t / n g = 240/6.6 = 36,36 minutos Otra forma: con g =0.693 t / (lnX - lnXo) g= (0.693 x 4) / (ln100) = 0.602 hr = 36.12 min

Ejemplo 2. En un cultivo se tiene inicialmente 5x107 bacterias y después de 6 horas se tiene 5x108 Calcule el tiempo de generación Ecuaciones: • n=t/g, : n= (LnX-LnXo)/Ln2 Reemplazando: • n = (20-17.7)/0.693 • n = 3.3 • g = t/3.3 = 6/3.3 • g =Td = 1,8 h

Ejemplo 3. En un proceso de fermentación microbiana, se toman datos del conteo celular, obteniéndose los siguientes: t (hr) X

0 0.5 1 2

1 4

1.5 2 8 16

2.5 32

3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 64 128 256 512 1024 2048 4096 8192 16382

Calcular el tiempo de generación. t (hr) X lnX

0 0.5 1 1 2 4 0 0.7 1.4

1.5 8 2.1

2 16 3

2.5 3 32 64 3.47 4.16

3.5 128 4.9

4 256 5.5

4.5 5 5.5 6 512 1024 2048 4096 6.2 6.93 7.62 8.32

Solución por correlación: •La ecuación de la recta es: LnX = 1.3863 t + 0.00001 •De la Ec. 5, LnX=nLn2+LnXo. •LnX=Ln2(t/g) + LnXo •Se observa que: Pendiente: m = 1.386 = Ln2/g = 0.693/g •g = o.5 h

6.5 7 8192 16382 9.01 9.704

Solución Gráfica: (criterio) La pendiente de la línea de ajuste corresponde a la variación del doble del valor de X en la ordenada y de un valor g en la abscisa. Por tanto: m=Ln2/g

•Se observa que: Pendiente: m =0.693/g = 1.386 •m = 1.386 = 0.693/g •g = 0.5 h

b.- Tasa de crecimiento •La velocidad de crecimiento para la fase exponencial es directamente proporcional a la concentración de células y está dada por la siguiente relación: Reemplazando el signo de proporcionalidad • (8)

Unidades de rx son (biomasa / L.h)

rx = μ X

(9)

•rx=Velocidad o tasa de crecimiento bacteriano en la fase de crecimiento logarítmico •X=concentración de microorganismos •μ=Velocidad específica de crecimiento, dado por la ecuación de Monod.

Valor de μ. Velocidad específica de crecimiento (μ) Para un m.o. dado depende de: La composición y concentración del medio, Presencia de inhibidores, Temperatura y pH.

Ec. de Monod. (10)

x = concentración de microorganismos g/l t = tiempo, h μ = velocidad específica de crecimiento h-1, S = Concentración del sustrato, masa/unidad de volumen Ks=Constante promedio de velocidad. Concentración de sustrato a la mitad del máximo de velocidad de crecimiento. masa/unidad de volumen ko = máxima velocidad de utilización de sustrato por unidad de masa de microorganismos.

Limitaciones de la Ec. De Monod Posee limitaciones 1) A muy bajas concentraciones de sustratos no va bien 2) A muy altas concentraciones de sustratos Ks real es cte • Extensión: de las ecuaciones 8 y 10, se tiene:

5.- ESTEQUIOMETRIA •Estudia el grado en que un microorganismo puede transformar los componentes del medio de cultivo en nuevas células (biomasa) y productos. •Esto determina la viabilidad de un proceso industrial.

Se puede establecer las relaciones estequiometrias a través de: • •

balance de materiales. los coeficientes de rendimiento.

5.1.- Coeficientes de rendimiento a.- Coeficiente de rendimiento biomasa-sustrato Definición. Es la relación entre la variación de la biomasa y la variación del sustrato.

• Yx/s= -X/S

(5)

•Yx/s =Coeficiente de máximo rendimiento en biomasa (masa de células formadas/masa de sustrato consumidos). •Si para obtener 30 gl-1 de levadura para panificación, se consumen 60 gl-1 de fuente carbonada, el rendimiento será Yx / s= 0.5 g de levadura/gr de sustrato. •En un medio específico, la relación de la velocidad de utilización de sustrato y la velocidad de crecimiento, esta dada por:

•Yx/s = - rx/rsu • •rx = -Yx/s . rsu

(6)

•rsu = Velocidad de utilización del sustrato. masa/unidad de volumen × tiempo.

a.- Coeficiente de rendimiento biomasa-sustrato (7) •El término μm/Y = k, representa la máxima velocidad de utilización de sustrato por unidad de masa microbiana. • Reemplazando en la ecuación (7) se tiene:

•Para organismos aerobios que crecen en glucosa se tiene que los Yx/s típicos son: –para levaduras y bacterias varía entre 0.4 y 0.6 g/g, –en condiciones anaerobias el valor de Yx/s es substancialmente menor. •En metano, con bacterias el Yx/s será 0.6 y 1.0 g/g

b.- Coeficiente de Rendimiento biomasa-oxígeno. •Esta dado por la relación de biomasa producida y el consumo de O2 del medio. •Yx/o2 = -X/O2 •Yx/O2 para bacterias y levaduras aerobias que crecen en glucosa es de 0.9 a 1.4 g/g •Un cambio en el sustrato ocasionará variaciones en el valor del coeficiente. •Los mismos m.o. en las mismas condiciones, pero en metano tendrán un Yx/O2 de alrededor de 0.2 g/g.

Coeficientes para m.o aerobios Organismo

Sustrato

Enterobacteraerógenes

Yx/s

Yx/o2

g/g

g/mol

g/g-C

g/g

Maltosa

0.46

149.2

1.03

1.50

Manitol

0.52

95.2

1.32

1.18

Fructosa

0.42

76.1

1.05

1.46

Glucosa

0.40

72.7

1.01

1.11

Candida utilis

Glucosa

0.51

91.8

1.28

1.32

Penicillium chrysogenum

glucosa

0.43

77.4

1.08

1.35

Pseudomonas fluorescens

glucosa

0.38

68.4

0.95

0.85

Rhodopseudomonas spheroides

glucosa

0.45

81.0

1.12

1.46

Saccharomyces cerevisiae

Glucosa

0.50

90.0

1.25

0.97

Enterobacter aerógenes

Ribosa

0.35

53.2

0.88

0.98

Succinato

0.25

29.7

0.62

0.62

Glycerol

0.45

41.8

1.16

0.97

Lactato

0.18

16.6

0.46

0.37

Piruvato

0.20

17.9

0.49

0.48

Acetato

0.18

10.5

0.43

0.31

Coeficientes para m.o aerobios Organismo

Sustrato

Yx/s

Yx/o2

g/g

g/mol

g/g

g/mol

Cándida utilis

Acetato

0.36

21.0

0.90

0.70

Pseudomonas fluorescens

Acetato

0.28

16.8

0.70

0.46

Cándida utilis

Etanol

0.68

31.2

1.30

0.61

Pseudomonas fluorescens

Etanol

0.49

22.5

0.93

0.42

Klesbiella sp.

Metanol

0.38

12.2

1.01

0.56

Metylomonas sp.

Metanol

0.48

15.4

1.28

0.53

Pseudomonas sp.

Metanol

0.41

13.1

1.09

0.44

Metyloccocus sp.

Metano

1.01

16.2

1.34

0.29

Pseudomonas sp.

Metano

0.80

12.8

1.06

0.20

Metanol

0.60

9.60

0.80

0.19

Metano

0.56

9.00

0.75

0.17

Pseudomonas metánica

c.- Coeficiente de formación de producto (qr), o Yp/s. • Yp/s = - P/S • Puede variar según el producto y la forma como se producen. • Los productos microbianos pueden ser clasificados en tres categorías: productos asociados al crecimiento, productos no asociados, y productos asociados mixtos. • En productos asociados. La formación de producto es proporcional a la tasa específica de crecimiento (µ). Ej. La producción de una enzima constitutiva. • Productos no asociados. Antibióticos

5.2.- Balance del consumo de sustrato •Resulta de gran interés conocer el destino del sustrato durante el crecimiento microbiano. •El sustrato es utilizado por las células como fuente de energía y como materia prima para la síntesis de macromoléculas constitutivas. •Por tanto en un tiempo cualquiera, el consumo de sustrato (ΔS) es:

•

s = sx + sp + sE

•Donde:

(8)

•S = Sustrato total consumido •Sx = Fracción de sustrato utilizado en formación de biomasa •Sp = Fracción de sustrato utilizado en formación de producto •SE = Fracción de sustrato utilizado para obtener energía

a.- Balance de biomasa en reactor abierto •En un biorreactor continuo, el sustrato entra al digestor, donde existen las condiciones (pH, temperatura, nutrientes, oxigeno.) adecuadas para el crecimiento celular. •En el biorreactor, el sustrato es convertido a productos y nuevas células por los microorganismos presentes en el medio. •Con el tiempo, la cantidad de biomasa se incrementa a expensas del sustrato que disminuye. •El balance de biomasa para reactor aerobio de mezcla total es: •Qo Xo + V(r‘x) = Qe Xe (12)

•r‘x=Tasa de crecimiento celular. •Reemplazando el valor de r´x, se tiene:

Balance de biomasa en reactor abierto • QoXo + V(r'g) = QeXe (10) • • • • • • • • • •

Qo=Flujo de agua en el influente. Qe=Flujo de agua producto o agua en el efluente. So=Concentración de sustrato en el influente. S=Concentración de sustrato en el reactor. Se=Concentración de sustrato en el efluente Xo=Concentración de biomasa en el influente. X=Concentración o masa de biomasa en el reactor. Xe=Concentración o masa de biomasa en el efluente V=Volumen del reactor. r'g=Tasa o velocidad real de crecimiento de los microorganismos.

RESUMEN DE TÉRMINOS CINÉTICOS EN TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES • • • •

μ=Velocidad especifica de crecimiento μm=máxima velocidad de crecimiento Ks=Constante promedio de velocidad. Concentración de sustrato a la mitad del máximo de velocidad de crecimiento. mg DBO/L S=Concentración del sustrato. mg DBO/L

• rg=velocidad o tasa de crecimiento celular • •

rg= -Yrsu Y=Coeficiente de máximo rendimiento medido durante un periodo finito en la fase de crecimiento logarítmico. Se define como la masa de células formadas/masa de sustrato consumidos.

• rsu=Velocidad de utilización del sustrato. masa/unidad de volumen × tiempo. • • • • • • •

rd = velocidad de decaimiento por metabolismo endógeno rd = kdX kd=constante especifica de velocidad de decaimiento endógeno dias-1 X=concentración de células en el reactor mg SVS/L r'g=rg-rd r'g=velocidad neta de crecimiento de células en el reactor r'g =(μmXS/Ks+S)- kdX

b.- Balance de carbono •La base del balance, es la composición celular en los elementos mayoritarios (C, N, H, O). •Se ha encontrado que la composición elemental de un microorganismo durante un cultivo no se modifica mayormente y, que las composiciones elementales de distintos tipos de microorganismos (bacterias y hongos) son semejantes. •Se puede definir un "microorganismo promedio" con una composición (% p/p) de: C = 46.5; H = 6.49; 0 = 31.0; N = 10.85, y el contenido de sales 5%. •Sin embargo, la composición macromolecular, esto es: proteínas, ácidos nucleicos, etc., varia en el proceso. •El contenido de átomos para 1 C, de la formula global será: •n =(%n/%C)*(PAC / PAn) •Aplicando se obtiene la “fórmula global” de un m.o. promedio será: CH1,79O0,5N0,2 (representa el 95% p/p de la biomasa)

c.- Mol de biomasa. •CH1,79O0,5N0,2 (representa el 95% p/p de la biomasa)

•“1 C-mol de biomasa” es la cantidad de biomasa que contiene 1 átomo gramo de C, su peso será:

•Por tanto una concentración de X en gL-1 de biomasa es equivalente a X/25.8 C-mol de biomasa l-1, o bien Xox /12 C-mol de biomasa l-1 . •Donde ox es la fracción de Carbono de la biomasa (0.465 para el "microorganismo promedio"). •ox se obtiene de bibliografía, o se puede suponer ox = 0.465. •1 C-mol de glucosa (C6H12O6), se representa por CH2O y pesa 30 g, y 1 C-mol de etanol (C2H60) se representa por CH3O0.5 y pesa 23 g.

•En general para un compuesto de la forma CnHlOqNm, 1 C-mol esta representado por C Hl/n Oq/n Nm/n.

d.- C-mol de fuente de energía, y 1 C-mol de producto. •El crecimiento puede representarse por la "reacción química“:

•Donde NH3 es la fuente de nitrógeno, y los coeficientes estequiométricos están dados en 1 C-mol de fuente de C y energía. •yx/s representa los C-moles de biomasa formada por cada Cmol de fuente de C y E consumida., b los moles de O2 consumido por cada C-mol de fuente de C y E consumida, etc. •Los valores de yx/s e yp/s se calculan a partir de Yx/s e Yp/s:

e.- El “grado de reducción" (γ) •Es el número de electrones transferidos desde 1 C-mol del compuesto a oxidar, al O2. •En la tabla están los valores de γ para la oxidación de 1 C-mol de distintos compuestos orgánicos a CO2 y H2O, y el calor de reacción q.

Cálculo de γ por estequiometria •De la tabla se observa que: La cantidad de calor liberado por cada mol de electrones transferidos al oxígeno (q/ γ), es similar, con un valor promedio de: •qo = 27.5 k cal (mol electrones transferidos al O2)-1 •En general para calcular el grado de reducción de un compuesto se plantea la ecuación de oxidación del mismo a CO2 y H2O, y el valor de γ se obtiene multiplicando por 4 el coeficiente estequiométrico del O2 (ver tabla). •Si el compuesto contiene nitrógeno, deberá especificarse su estado de oxidación final. •En un compuesto dado por CHaObNc, y para calcular el valor de y con respecto al nivel de referencia dado por CO2 , H2O y NH3 será: De la ecuación de oxidación: •El valor de γ será igual a 4n.

Calculo directo de γ •Por balance elemental de C, H, O y N se tiene:

•Por tanto γ será:

(7)

•Tanto para CO2, H2O y NH3 es γ = 0 (no tienen electrones disponibles) por ser éste el nivel de referencia elegido. • •Si en lugar de NH3, se elige N2: γ = 4 + a - 2b. •Para aplicar el balances de materia y energía, se plantea la "reacción química" que representa al cultivo. •Para simplificar el tratamiento suponer que la fuente de C y E no contiene nitrógeno (es lo usual) y que la fuente de nitrógeno es una sal de amonio, por lo que γ estará dado por la ecuación 7

e.- Ecuaciones de balance en C-mol Balance de Carbono:

•Con los rendimientos referidos a 1 C-mol de fuente de Carbono y energía, resulta: • • (8)

Balance de grado de reducción:

•Los electrones disponibles a la izquierda y a la derecha de la reacción deberán ser iguales, luego: • (9) •Para: NH3 , H2O y C02 es γ= 0. Además el grado de reducción del O2 es -4. •Reordenando la ecuación (9) queda: • (10) •O bien:

(11)

e.- Ecuaciones de balance en C-mol •Donde: η, ξ, ε representan la fracción de energía transferida a la biomasa, al producto y al oxígeno respectivamente. •Por cada mol de electrones transferidos al O2 se liberan qo = 27.5 k cal, y el calor producido esta dado por: q = 4 bqo (k cal / C-mol fuente de C y E) (15) •e representa la fracción de energía disipada como calor. Mediante las ecuaciones (8) y (10) es posible analizar los resultados y verificar si las determinaciones han sido correctas. •Se puede aplicar las ecuaciones para calcular un rendimiento no medido, por ejemplo yp/s en base a los demás.

Ejemplo 1: •Se cultivó la levadura Candida utilis en un medio conteniendo glucosa, S04(NH4)2 y sales. La concentración inicial de microorganismos fue de 0.53 gL-1, y la glucosa 15.2 gL-1. Al cabo de 9.5 horas, se consumió totalmente la glucosa, se consumieron 0.123 mol de O2 L-1, se produjeron 0.179 mol de CO2 L-1 y la biomasa alcanzó un valor de 6.07 gL-1. Se desea averiguar si, además de biomasa, se formó algún producto. •Datos: •Xo = 0.53g/L , So= 15.2 g/L •t= 9.5 hr. •Sf= 0, Xf= 6.07 g/L •consumo: O2= 0.123 mol/L •Productos: CO2= 0.179 mol/L . •Criterios de solución: se usa formula de microorganismo promedio, y el valor de C-mol.

Ejemplo 1: •Ecuación de reacción:

•CH2O + O2 + SO4(NH4)2 ---Yx/s(CH1.79O0.5N0.2) +yp/sP •Biomasa formada = (6.07 -0.53)/25.8 = 0.215 C-mol/L •Glucosa consumida = 15.2/30= 0.506 C-mol/L •Rendimiento: yx/s = 0.215/0.506 = 0.425

•yco2/s = 0.179/0.506= 0.354. •Puesto que la suma de yx/s y yco2/s es inferior a 1, es obvio que se ha formado algún producto: •yp/s= 1 - (0.425 + 0.354) = 0.22

6.- MODELOS CINETICOS •El crecimiento microbiano es un proceso difícil de modelar debido a las múltiples interacciones entre las células y el medio, y a la gran cantidad de reacciones bioquímicas que intervienen en la actividad celular. •Varios modelos conceptuales y matemáticos se han formulado con el objeto de explicar y replicar el comportamiento que muestran los sistemas biológicos. •Estos modelos se han clasificado según las consideraciones asumidas respecto a la estructura de las células o a la distribución de la población celular. •La clasificación más general incluye modelos no-estructurados, estructurados y segregados Modelo

No estructurados

No segregados

CAJA NEGRA

Segregados

estructurados CASO REAL

a.- Modelos No-Estructurados •Son los modelos más simples para describir el crecimiento microbiano. •Se asume que las células son una entidad en solución, que interactúa con el ambiente. •No se reconoce ninguna estructura celular interna, ni la diversidad de la población. •Por tanto, todos los componentes celulares se representan por una única concentración, la de la biomasa (X). •Los modelos no segregados no estructurados suelen llamarse del tipo "Caja Negra". •Los mas usados son: Modelo de Monod, Modelo de Contois, Modelo de Mosser,

Modelo de Monod •Monod en 1942 desarrolló una ecuación cinética simple. •Parte de suponer que sólo una enzima con cinética Michaeliana es la responsable del consumo de S. •El modelo asume también que la producción de biomasa depende exclusivamente de la concentración de un sustrato limitante. Representación:

Modelo de Monod X : Concentración de microorganismos. •μ : tasa efectiva de crecimiento K S •S : Concentración de substrato, mg/L •μm : tasa máxima de crecimiento •Ks : Constante de saturación. Relación inversa con afinidad del m.o por el sustrato. L valor de S cuando μ= μm/2 Cuando S > > Ks, μ toma el valor de μm y rx sólo depende de x. En general Ks tiene valores muy bajos, del orden de los mg/l. En promedio: En bacterias μm ……………………………… Las levaduras…………………………………… Los hongos filamentosos…………………

0.9 h-1 0.45 h-1 0.25 h-1

El modelo tiene limitaciones para concentraciones de sustrato bajas y altas.

Modelo de Monod

•El coeficiente Yx/s, estará dado por: •Yx/s= (aumento de biomasa) • descenso en conc. de sustrato

= (dX/dt) = dX (dS/dt) dS

Modelo de Monod

Utilización del sustrato

Linearización del modelo La solución empírica del modelo requiere hacer la linearizacion de Lineweaber-Burk.

Otros modelos no estructurados Modelo de Contois. Muestra una dependencia de la tasa específica de la reacción con respecto a la concentración de organismos activos presentes.



 m S  K sx x  [S ]

Ejemplo • Una cultivo de microorganismos BATCH en crecimiento, en sustrato de glucosa, dio los siguientes datos. TIEMPO (h)

CONC. CELULAS (X) (g/l)

ln X

CONC. GLUCOSA (g/l)

0

1.25

0.2231

100.00

9

2.45

0.8961

97.00

16

5.10

1.6292

90.40

23

10.50

2.3514

76.90

30

22.00

3.0910

48.10

34

33.00

3.4965

20.60

36

37.50

3.6243

9.38

40

41.00

3.7136

0.63

• a) Calcular la velocidad máxima de crecimiento. • b) Calcular la variación de sustrato (coeficiente biomasa-sustrato) • c) Cuál es la concentración celular máxima que podría esperarse si 150g de glucosa fueron usados con la misma cantidad de inoculo. Rpta. a)

ln X

 ln X

t

t (h)

y  ln X tg  m   x t b) Rpta.

ln 37.5  ln 5.1 m   0.1 h 1 36  16

Calcular la variación de sustrato por el crecimiento celular.

y

X celuar Rango de Conc. Celular  S sustrato Rango de Conc. Sustrato

41  1.25 y  0.40 gr de células / gr de sustrato 0.63  100

c) Rpta.

X max  X 0  Y .S 0 X max  1.25  0.4(150) X max  60.25

g células lt

Modelo logistico • Los modelos anteriores representan el comportamiento de los m.o, sólo en la fase log de un cultivo batch (donde  es constante) • Si se quiere representar todo el proceso, es necesario recurrir al modelo logístico. • Este modelo es capaz de arrojar una curva sigmoidal • Se obtiene combinando la ecuación de Monod con la expresión de μ y la de rendimiento biomasa-sustrato (Yx/s). dX = m(Yx/s.So + Xo – X) . X dt (Ks.Yx/s + Yx/s.So +Xo-X)22

Modelos Estructurados •Los modelos estructurados modelan a la célula como un sistema de componentes múltiples (ribosomas, enzimas, membranas,etc.), y esta se describen con más de una variable. •En estos modelos, los componentes de la biomasa se juntan en algunas variables clave que son representativas del comportamiento celular. •La actividad microbiana es función de variables abióticas y de la composición celular, además la actividad microbiana depende de las condiciones ambientales que el cultivo ha sufrido en el pasado. •Estos modelos tienen mayor capacidad de predicción que los modelos no-estructurados

Modelos estructurados. •Al construir el modelo se debe decidir cuantos componentes celulares se tomaran en cuenta. (de 2 a 40) •Estos modelos consideran: las concentraciones intrínsecas, (cantidad de un componente por unidad de masa celular) (Ci/X), y las concentraciones extrínsecas o cantidad de un componente por unidad de volumen del reactor. d(Ci/X) = (1.dCi) - ( Ci. dX/dt) dt X.dt X. X •Un resultado aceptable se produce usando al menos 3 componentes celulares. •Con mas componentes el modelo será mas preciso, pero también mas complejo. •Ci, es la concentración de cada componente.

Modelos estructurados. • Con más de un substrato limitante se pueden usar modelos modelos multiplicativos, modelos aditivos y modelos nominativos • Son desarrollados con amplitud en el libro de Shuler-Kargi. • El modelo aditivo toma la forma: •  = W1.S1 + W2.S2 + ... + Wn. Sn • max

• donde W1, W2, ..., Wn son funciones del peso, y  sigue la cinética Monod.

Modelos segregados •Los modelos segregados tienen en cuenta que la población celular es heterogénea, reconoce a las células como discretas, por lo que resultan complejos. •Estos modelos pueden reconocer como diferentes a las "células más viejas" de las "células más jóvenes". •Se aplican a sistemas microbianos en los cuáles se observa que la diferenciación de las células juega un papel importante en el desempeño global del cultivo, y que las cinéticas de crecimiento y la productividad del cultivo son afectadas por la aparición de más de un tipo de célula. (Paz Astudillo)